赫特维希上皮根鞘细胞的研究进展

毕 菲 ，郭维华

（1）四川大学华西口腔医院儿童口腔科，四川 成都 610041;2）口腔疾病研究国家重点实验室，四川 成都 610041）

从牙根发育与牙周组织形成的生理性过程角度来看，赫特维希上皮根鞘是一组必不可少的关键结构。当牙冠基本发育完成时，内、外釉上细胞在颈环处增生，向根尖孔方向延长，星网状层和中间层细胞消失，双层鞘状结构的赫特维希上皮根鞘（hertwig’s epithelial root sheath，HERS）形成；通过上皮-间充质相互作用（epithelialmesenchymal interaction，EMI），HERS 诱导其内侧的牙乳头细胞（dental papilla cells，DPCs）分化为成牙本质细胞，形成根部牙本质；HERS 细胞也会诱导其外侧的牙囊细胞（dental follicle cells，DFCs）分化为成纤维细胞、成骨细胞和成牙骨质细胞，形成牙周膜、牙槽骨和牙骨质[1]。HERS 细胞也能通过上皮间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT），进行成骨/成牙骨质向分化，形成牙周组织[2]。鉴于HERS 细胞在牙根、牙周组织发育形成过程中的重要性与必要性，为了进一步探究其在牙周组织的修复再生中的应用潜力以及明确今后的研究重点，笔者将HERS 的起源、形态结构特征，以及近年来关于HERS 的生物学行为、参与牙及支持组织发育调控、应用于组织再生修复的研究进展综述如下。

1 HERS 的起源和形态结构特征研究

1.1 HERS 的起源

HERS 是由德国生物学家Oskar Hertwig 于1874 年在两栖动物中首次发现的结构[3]。在两栖动物和非鳄鱼爬行动物中，HERS 保持连续而不断裂，在牙与骨之间有更加牢固的连结形成[4]；在鳄鱼和哺乳动物中，HERS 是一个短暂存在的结构，会发生断裂，并最终形成马拉瑟上皮剩余，在上皮结构的空隙中，牙周韧带能够在牙根与牙槽骨之间形成灵活的连结[3]。

1.2 HERS/ERM 的形态结构特征研究

Suzuki M 等[5]发现HERS 由两层细胞构成，内层细胞呈立方状，外层细胞扁平，细胞间通过桥粒和间隙连接紧密连接，周围被连续的基底膜包绕。Hamamoto Y 等[6]发现HERS 断裂后，立即能够观察到上皮细胞岛形成，细胞形态不规则，内含少量粗糙型内质网。Andujar M B 等[7]观察到小鼠磨牙牙根的早期发育期间，HERS 细胞在EMI 的过程中失去了立方状的外形，变得扁平；牙周膜中一部分细胞的粗糙型内质网和核膜在面对无细胞牙骨质一侧与层粘连蛋白和Ⅳ型胶原有特异性结合，并且这些细胞表达角蛋白，却不表达波形蛋白。

2 HERS 在牙根发育过程中参与调控的研究

2.1 HERS 参与的重要分子、信号通路调控研究

HERS 是牙根发育的重要引导结构，过往研究发现Bmp、Tgfβ、β-catenin、Wnt、Fgf、Shh、Nfic、Smad 等信号分子之间形成复杂的信号通路以及级联网络，对牙根的发育进行综合调控。

Mu H 等[8]发现上皮来源的Bmp2 和Bmp4 在HERS 退化过程中以及牙根部间充质的分化、成熟中，扮演了不可或缺的角色。Yang S 等[9]发现在牙根发育时，β-catenin 失活会导致HERS 提前断裂，细胞间黏附降低、连接蛋白表达下降、EMT 增加；相反，β-catenin 的稳定化使得HERS 不断裂，HERS 细胞无法解离，连接蛋白表达增加。Nemoto，E 等[10]发现HERS 能够通过Wnt/β-catenin 信号通路诱导DFCs 的成牙骨质/成骨向分化。Huang H 等[11]发现在RANKL 敲除小鼠的磨牙中，HERS 无法正常向根方延长并且排列杂乱无序，牙根发育和牙齿萌出受阻；且与根尖组织成牙向分化相关的基因表达降低。Nakatomi M 等[12]发现Shh 信号通路与HERS 的功能相关，并能调控胚胎时期牙发育过程中的EMI。Yokohama-Tamaki T 等[13]发现在牙根发育过程中，Fgf10 的过表达会抑制HERS 形成，Fgf10 信号的消失会引起牙冠发育转向牙根发育。

Wang J 等[14]对牙根发育过程中的重要信号通路进行了综合归纳，发现Nfic、Osterix、βcatenin 和sonic hedgehog 都在牙根发育中起到重要作用，并且HERS 在牙根发育调控中发挥的作用也是至关重要的。Li J 等[15]对牙根发育过程中的细胞及分子调控机制进行综合归纳，发现Bmp/Tgfβ 信号通路、Wnt 信号通路以及Fgf 和Hh 信号通路在牙根发育过程中发挥了重要作用；HERS 引导了牙根发育。Huang X 等[16]发现TGFβ/BMP、Smad 以及Shh 信号通路通过调节Nfic表达来控制牙根发育，HERS 和神经嵴来源的牙源性间充质之间的相互作用可能引导了牙根形成的大小、形状及数目。

除上述常见的HERS 细胞参与的分子及信号通路以外，Tian Q 等[17]发现Vps4b 基因突变可能通过改变HERS 中CK14 和PCNA 的表达，从而导致牙根发育异常；Date Y 等[18]发现Chd3 基因在分泌型成釉细胞和HERS 细胞中高表达，但在发育中的成牙本质细胞和星网状层细胞中低表达，Chd3 在HERS 细胞的DNA 合成及促进牙根发育中有重要作用[19]。

2.2 通过HERS 作用于牙根发育的其他影响因素研究

除了器官组织细胞本身表达的关键信号分子对牙根发育发挥着主要的调控作用外，一些内源性的其他生物活性分子或外源性的因素如药物、射线、创伤等，也会通过HERS 对牙根发育造成一定影响。

Xu J 等[20]发现血管活性肠肽（VIP）增强了HERS 的增殖以及向根方的延长，在体外培养中，VIP 促进了HERS01a 细胞系的增殖以及CK14 和vimentin 的表达。Ida-Yonemochi H 等[21]发现基底膜聚糖perlecan 的过量表达会造成牙齿形态的异常，如perlecan 在HERS 细胞中堆积导致牙根向外弯曲。Sakuraba H 等[22]发现肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor，HGF）可能通过增强HERS 增殖和向根方延长来促进牙根发育。

Fujiwara N 等[23]发现Harmine（骆驼蓬碱）能够促进HERS 延长并刺激HERS 细胞增殖，并且能够诱导HERS 细胞中SMAD1/5/8 蛋白磷酸化；星网状层的消失可能是控制HERS 形成时机的关键事件，表皮生长因子可能是颈环上皮转变为HERS 的调控因素之一[24]；胰岛素样生长因子1（IGF-1）通过调节HERS 外层细胞的有丝分裂活性来参与牙根的早期发育过程[25]。Kawakami T等[26]发现环磷酰胺在牙根发育过程中会造成HERS 的缺损，导致HERS 早失，进一步抑制正常的牙根发育，引起不可逆的牙根发育过短。Hirose N 等[27]发现成釉蛋白可能对HERS 细胞有调控其分化的作用，并通过在HERS 中的表达启动正常的牙根发育过程。

Ide Y 等[28]发现辐射导致的HERS 早失以及HERS 周围间充质细胞的增殖抑制会进一步引起牙根的发育畸形。Nakasone N 等[29]发现在牙根发育过程中，咬合能够降低细胞增殖，是牙根延长调控因素之一。Hodgson B D 等[30]发现，光生物调节能够改善在牙根发育过程中因长春碱造成的HERS 细胞增殖减弱及谷胱甘肽水平降低。

Jiang X 等[31]和Jung I Y 等[32]发现严重的创伤和大面积、长时间的根尖炎症可能导致HERS和牙乳头脱离牙根，形成一个单独发育的、与原牙根主体不相连的根尖段。Andreasen J O 等[33]将HERS 整体切除或挫伤，牙根表现为发育停滞，且牙槽骨向牙根内长入，将部分HERS 切除，依然有牙根形成，但体积较小，不切除HERS，牙根能够获得完整的发育；发现无论是部分还是完全的HERS 损伤都可能影响牙根发育[34]。

3 HERS 及其衍生物的生物学行为，以及应用于组织修复再生的研究

3.1 HERS 细胞/马拉瑟上皮剩余细胞的研究

在牙根发育期间，通过上皮-间充质相互作用，HERS 细胞可以诱导牙囊细胞向成纤维细胞、成牙骨质细胞及成骨细胞分化，形成牙周膜、牙骨质及牙槽骨；也可以诱导牙乳头细胞向成牙本质细胞分化，形成牙本质。除上皮-间充质相互作用以外，HERS 细胞还能够进行上皮-间充质转化，自身进行成牙骨质/成骨向分化，形成牙周支持组织。而牙根发育完成后，HERS 细胞进入牙周膜中形成马拉瑟上皮剩余细胞，维持牙周组织稳态，参与牙周组织受损修复的过程。

He M 等[35]发现HERS 细胞来源的条件培养基促进了大鼠切牙DFCs 的成骨分化以及矿化能力，相反地，却对大鼠磨牙DFCs 产生了抑制效应。Yang Y 等[36]发现在牙根发育过程中，HERS细胞能够通过Wnt 通路和牙本质的参与，诱导DFCs 进行成牙向分化。Guo Y 等[37]发现体外培养时，HERS 细胞在DFCs 诱导下细胞形态发生变化并且产生了更多的矿化结节；在体内移植实验中，HERS 细胞形成了牙骨质-牙周韧带样结构[38]；提出：HERS 细胞直接参与了牙周膜的形成过程，并且对于DFCs 的分化并形成牙周组织结构有重要作用。Jung H S 等[39]发现将HERS、DFCs 和DPCs 在体内共培养，能够诱导DFCs 的成牙骨质/成骨向分化，从而促进牙周组织修复再生。Bai Y 等[40]发现HERS 细胞通过EMI 诱导DFCs 膜片，能够促进DFCs 的成骨/成牙骨质向分化，并在体内形成牙骨质样组织，促进牙周组织修复。

Duan Y 等[41]发现相较于二维培养的HERS细胞，三维培养的HERS 细胞小球在增殖、自我更新、干性维持、分化潜能以及牙本质形成的诱导能力方面都有所增强；并且HERS 细胞小球的形成与扩展在一定程度上依赖于HIF-1 通路；在体内实验（大鼠肾被膜下植入）中，HERS 细胞小球与HA/TCP 共培养，有类牙骨质形成；HERS细胞小球与DPCs、TDM 共培养，有相对有序且明显矿化的新生类牙本质组织出现。Thomas H F等[42]将HERS 从5 日龄的CD-1 小鼠第一磨牙中分离出来进行HERS 细胞的培养，免疫荧光鉴定获得了纯化的上皮细胞；还将HERS 与牙乳头进行重组，发现HERS 对DPCs 有成牙本质细胞向分化的诱导作用，并且在移植2 周后观察到了根部牙本质样组织的出现。Suzuki M 等[5]发现HERS 的断裂是源于DFCs 的侵袭，而不是源于细胞的死亡；在与HERS 的基底膜发生接触后，DPCs 向成牙本质细胞分化；在与HERS 细胞发生直接接触后，DFCs 向成牙骨质细胞分化。

Oh J E 等[43]发现TGF-β能够诱导DFHERSCs 牙囊组织来源的HERS 细胞（DF-HERSCs）进行EMT，向成骨向分化。Chen J 等[44]发现，TGF-β1 和FGF2 能通过 MAPK/ERK-dependent信号通路诱导HERS 发生EMT。

Li Y 等[45]发现上皮剩余（ERM）能够促进牙周炎患者来源（P）和老年人来源（A）的PDLSCs 的成骨相关基因和蛋白表达。Bosshardt D D 等[46]对牙周再生过程中的细胞间的相互作用进行综合归纳，提出：马拉瑟上皮剩余中的上皮细胞被认为是一个能够提供成牙骨质细胞补给的细胞龛；在此过程中，釉质基质蛋白以及TGF-β 家族的成员与成牙骨质细胞分化有关。Huang X 等[47]对HERS细胞在牙根发育中的命运及转归作归纳总结，提出：HERS 细胞在牙根形成的全过程中都能在牙根表面被检测到，并不会消失；大部分HERS 细胞粘附于牙骨质表面，余下部分分散开来形成马拉瑟上皮剩余；在DFCs 穿过HERS 网络接触到牙本质之前，HERS 细胞会在牙本质表面分泌细胞外基质成分；HERS 细胞参与牙骨质的形成，也有可能分化成为成牙骨质细胞；在牙根发育过程中，HERS 并非被“打散”，相反，HERS 细胞之间继续以网络结构的形式进行相互交流作用；HERS 细胞与神经嵴来源的间充质进行相互作用，引导牙根发育。Xiong J 等[48]对马拉瑟上皮剩余细胞在牙周组织中的作用进行归纳总结，提出：虽然目前对于马拉瑟上皮剩余细胞的功能尚无共识，但其在维持牙周组织稳态、防止牙固连及牙根吸收以及促进牙骨质修复等方面发挥作用，可能成为诱导牙周组织再生的重要干细胞来源。

3.2 HERS 细胞系/马拉瑟上皮剩余细胞系的研究

HERS 细胞和马拉瑟上皮剩余细胞的原代培养较为困难，细胞量的获取不足在一定程度上限制了实验研究。因此，通过建立永生化的细胞系，保证充足的细胞来源，促进了对HERS 细胞和马拉瑟上皮剩余细胞生物学特性的研究。

Kim G H 等[49]构建了永生化的人诱导性多能干细胞来源的上皮样细胞系（EPI-hiPSCs），并发现EPI-hiPSCs 能够促进DPCs 成牙相关基因表达、牙本质涎磷蛋白（DSPP）表达以及更多的矿化结节形成。Li X 等[50]和Zhang S 等[51]建立了SD 大鼠HERS 细胞来源的细胞系HERS-H1 和HERS-C2；HERS-H1 细胞系在体外增强DPCs 的成牙向分化及矿化能力；HERS-C2 细胞系能够在体外通过EMT 分化为成牙骨质细胞并在体内形成牙骨质样组织。Tsunematsu T 等[52]从牙周膜中分离出了马拉瑟上皮剩余来源的自发性永生化的牙源性上皮（iOdE）细胞，发现它们具有形成小球并表达干细胞相关基因的能力；并且iOdE 细胞能够经成骨诱导培养基作用后进行成骨向分化，将其移植于免疫缺陷小鼠体内培养后形成了钙化结节。Nam H 等[53]发现HERS/ERM 细胞有上皮干细胞和胚胎干细胞标志物的表达；在此基础上构建了HERS/ERM 来源的永生化细胞系[54]，发现细胞系能够保持上皮干细胞和胚胎干细胞标志物的表达，并且在TGF-β1 诱导下，能通过EMT 获得间充质表型。Akimoto T 等[55]构建了HERS 细胞来源的细胞系HERS01a，发现细胞系表达间充质细胞标记物vimentin、N-cadherin 和上皮细胞标记物CK14、E-cadherin 以及p63；经TGF-β 诱导后，HERS01a 细胞的间充质标志物表达增多，EMT 标志物snail1 和snail 2 也增多。

3.3 HERS 细胞系来源的外泌体的研究

外泌体具有低免疫原性、高稳定性的特点，在向组织修复的临床转化研究中，拥有广阔应用前景。Zhang S 等[56]发现HERS-H1 细胞系来源的外泌体样囊泡（ELVs-H1）能够促进DPCs 的增殖、迁移以及成牙向分化，同时促进血管形成以及成神经向分化，并且还能激活Wnt/β-catenin通路；利用 ELVs-H1 与DPCs 在牙根薄片上进行体内共培养，能够促进包括修复性牙本质样硬组织及血管、神经软组织在内的牙髓-牙本质复合体样组织的再生。

3.4 关于HERS 细胞能否成为牙骨质细胞分化来源的研究争议

关于HERS 细胞是否能够经历EMT，进而分化为成牙骨质细胞，一直存在争议。Diekwisch T G 等[57]在研究中证实了牙骨质是由HERS 断裂后侵入其中的DFCs 所生产的这一经典理论；Yamamoto T 等[58-60]更是十分坚持在牙骨质形成过程中，HERS 细胞不会经历EMT，且DFCs 才是成牙骨质细胞的分化来源。与前述观点恰恰相反的是，Bosshardt D D 等的研究发现支持了HERS 细胞生产牙骨质基质蛋白[61-63]并成为成牙骨质细胞来源[64]的可能性；Hammarstrom L等[65]和Alatli I 等[66]称有证据证明HERS 细胞无细胞性牙骨质和细胞性牙骨质中都有涉及；Zeichner-David 等[67]的研究提出了无细胞性牙骨质和细胞性牙骨质都可以被HERS 来源的成牙骨质细胞合成；Sonoyama W 等[68]发现HERS 细胞在移植到免疫缺陷小鼠体内培养时，能够形成牙骨质样组织；Itaya S 等[69]发现TGF-β 能够诱导HERS 进行EMT 并分化为牙周膜成纤维细胞，并表达无细胞牙骨质和牙周膜形成相关蛋白如fibronectin 和periostin。

4 小结

一方面，HERS 细胞可通过EMT 进行自身的成骨/成牙骨质向分化。另一方面，通过EMI，HERS 细胞诱导DPCs 的成牙/成骨向分化，参与根部牙本质的形成；HERS 细胞诱导DFCs 的成骨/成牙骨质向分化，参与牙周组织形成。

为了更好地补充HERS 细胞参与牙根发育及牙周组织形成的基础知识，为牙周再生及生物牙根构建提供理论参考及实践指导，以下科学问题尚需要进一步实验探究来明确：EMI 和EMT 在分子层面的调控机制为何；EMI 与EMT 在组织发生过程中所占比例如何；在组织修复过程中EMI 与EMT，哪一种修复策略的效率更高；HERS 细胞应用于牙周再生时的血管、神经形成及功能评价；HERS 细胞生理性的EMT 与肿瘤细胞病理性的EMT 区别为何；恒牙与乳牙的HERS 区别为何；HERS 细胞抵御局部感染能力如何；HERS 细胞在炎症环境下发挥的免疫功能为何；HERS 细胞最高效的保存策略为何；HERS 细胞应用于牙周修复最简便、利用率最高的的操作方式为何等。