板栗坚果营养物质和抗氧化成分综合评价

武妍妍，史文石，石新如，陈荣荣，赵 悦，赵佳冰，，王志伟，史胜青＊

(1.中国林业科学研究院林业研究所，国家林业和草原局林木培育重点实验室，林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091；2.中国林业科学研究院成果转化与产业开发处，北京 100091；3.中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所，林木遗传育种国家重点实验室，北京 100091；4.河北省秦皇岛市青龙满族自治县娄杖子镇小鹿沟村，河北 秦皇岛 066508)

板栗（Castanea mollissimaBl.）是壳斗科（Fagaceae）栗属（CastaneaMill.）经济林树种，不仅提供品质优良的坚果，还是重要的生态恢复树种[1-3]。板栗坚果营养丰富，以淀粉为主，同时还含有丰富的可溶性糖、蛋白质、粗脂肪、维生素C及黄酮类化合物，有“木本粮食”的美称[4-5]。

营养品质评价是优良种质资源选育的重要步骤，目前在种质资源收集与评价方面开展了大量工作，如利用等距分级评价法[6]、模糊数学法[7]、方差分析与相关分析结合法[8]、因子分析与隶属函数结合法[9]等对河北省燕山地区和山东省的板栗种质或主要品种从表型和营养成分等方面进行了比较研究，包括单粒鲜质量、含水量、淀粉、直链淀粉和支链淀粉、总糖、可溶性糖、还原糖、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维、灰分及矿质元素等。

板栗在采后或贮藏期间，果仁内腐病发生严重[10-11]。研究发现，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）活性维持在一个较高的水平有利于板栗贮藏[12]；POD、多酚氧化酶（PPO）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性下降时内腐病发生严重，而增强时腐烂现象则减缓[13]，表明抗氧化酶的活性对板栗采后坚果品质的维持具有十分重要的作用。然而，目前对板栗抗性物质的研究多集中在贮藏期间以及叶、壳和花中[12-16]，在板栗种质评价中进行板栗抗性物质的研究尚且较少。

本研究在对燕山地区63个板栗种质进行营养评价[17]的基础上，以河北省迁西县3个板栗品种为参照，对收集的14个板栗优良单株坚果的营养物质和抗氧化成分进行分析，并采用隶属函数-因子分析相结合的方法进行综合评价，以期为优良板栗品种选育及采后运输和贮藏等提供理论依据。

1 材料与方法

2020年秋季在河北省燕山地区成年板栗园（树龄均在35年以上）收集18份种质。4份栽培品种包括燕奎、燕山短枝和燕山早丰，其中，燕山早丰分别采集于迁西县和青龙县2个栗园；其余14份种质在走访农户和实地调查的基础上采集，选取具有高产、稳产，坚果大小均匀、品相口感好，抗病虫、耐贫瘠、抗旱性强等特点的单株或农家种。当树上约1/3以上栗苞自然裂开落果后，采集健康无病害的坚果。每个种质随机取3～5 kg健康坚果，在当地冷库（0～2 ℃）或冰箱（4 ℃）临时贮藏后带回实验室。一部分称质量烘干保存，用于营养物质和维生素C测定；一部分置于-80 ℃冰箱保存，用于抗氧化成分测定。每个种质3个实验重复，每个重复随机选取15～20个大小均匀的坚果。

1.1 植物材料

采集的板栗种质相关信息见表1。

表1 板栗种质采集信息Table 1 Collection information of chestnut germplasms

1.2 指标测定方法

1.2.1 表型特征测定 用游标卡尺分别测量坚果的横、纵、侧径，果形指数=坚果纵径/横径[18]，体积V=(4/3)πabc（a、b、c分别代表横径、纵径、侧径值的一半）[19-20]。

1.2.2 单果鲜质量和含水量测定参照GB/T 5009.3—2003《食品中水分的测定》，利用千分之一天平测定15～20个坚果鲜质量并记录；然后，参照曹小艳等[21]方法略有修改，将每个坚果切成均等4份，放入105 ℃烘箱中杀青30 min，65 ℃烘至恒质量，测定干质量并记录，计算单果鲜质量和含水量。

1.2.3 营养指标测定 利用蒽酮比色法测定可溶性糖、淀粉，利用氨基酸与水和茚三酮生成紫色化合物的原理测定总氨基酸，具体测定方法详见植物可溶性糖含量试剂盒、植物淀粉含量试剂盒、氨基酸含量测定试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。利用考马斯亮蓝法测定可溶性蛋白，具体测定方法详见改良型Bradford蛋白浓度测定试剂盒（上海生工生物工程有限公司）。

1.2.4 抗氧化指标测定 维生素C是利用它与固蓝盐B在乙酸溶液中反应生成黄色的草酰肼-2-羟基丁酰内脂衍生物的原理测定；超氧化物歧化酶（SOD）是利用黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子与WST-8反应产生水溶性染料甲臜的原理测定；多酚氧化酶（PPO）是利用PPO能够催化邻苯二酚产生醌的原理测定；过氧化物酶（POD）是利用POD催化H2O2氧化特定底物的原理测定；过氧化氢酶（CAT）是利用CAT能够分解H2O2的原理测定。具体测定方法详见相关试剂盒（苏州科铭生物技术有限公司）。

总多酚含量测定：采用福林酚比色法测定[22]。称取0.1 g样品，加入5 mL 50%甲醇超声波提取30 min。然后，12000 r·min-1离心10 min，去上清液至于4 ℃待测。以没食子酸（北京世纪奥科生物技术有限公司）为标准，配置质量浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05 mg·mL-1的系列标准溶液。按照待测液/标准液:福林酚:Na2CO3溶液为1:5:4比例，分别加入10% 福林酚试剂和7.5%Na2CO3溶液，混匀后在25 ℃条件下避光放置40 min，记录波长725 nm下吸光值A。利用标准曲线方程y=0.0056x+0.0124计算，式中，x为总多酚含量，y为吸光值A。

总黄酮含量测定：提取方法同总多酚含量测定，采用比色法测定[23]。以槲皮素（北京索莱宝科技有限公司）为标准，配制质量浓度为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg·mL-1的系列标准溶液。取25 μL待测液/标准液加入7.5μL 5% NaNO2，混匀，立即加入7.5μL 10% Al(NO3)3，静置5 min，再依次加入50μL 4% NaOH和160μL 50%甲醇，混匀，静置5 min后，在波长510 nm处测定吸光值A。利用标准曲线方程y=0.0005x-0.00005计算，式中，x为总黄酮含量，y为吸光值A。

1.3 数据分析

利用Microsoft Excel 2010、SPSS 20.0软件对原始数据进行方差分析、相关性分析和因子分析。

应用计算公式S(in)= (Xin-Ximin)/(Ximax-Ximin)对原始数据进行标准化得到隶属函数值，其中，S(in)指第n个样品第i个指标，Xin指第n个样品第i个指标的原始测定值，Ximax、Ximin分别为第i个指标的最大值和最小值。之后利用因子分析筛选出影响果实品质的若干公因子，同时得到各个指标的公因子分值Fm，以每个公因子分值Fm乘以因子分析中相对应的方差贡献率Em，最后相加得到综合得分D，其计算公式为：

式中：Ei为样品第i个公因子分值，Fi为第i个公因子的方差贡献率，i=1，2，3，4……n，n为公因子的个数[24]。

2 结果与分析

2.1 板栗坚果外部特征

18份板栗种质单果鲜质量之间存在较大差异（表2），平均为9.65 g，其中，QTC的单果鲜质量最小（7.88 g），TPZ的最大（12.51 g），TPZ是QTC的1.59倍。坚果果型指数变化幅度为0.65～0.89（表2），其中，JCY-3和JSY-7的果型指数最大，均为0.89，说明这二者坚果形状最近似圆形；而QL3113的果形指数只有0.65，说明该坚果形状近似扁圆形。TPZ的体积最大（9.72 cm3），YZX的 体 积 最 小（6.37 cm3），TPZ体 积是YZX的1.53倍。

表2 板栗坚果外部形态特征Table 2 External morphological characteristics of chestnut nuts

2.2 板栗坚果营养物质

不同种质板栗坚果营养物质含量均有一定差异，其中，可溶性糖（24.25%）、可溶性蛋白（34.72%）的变异系数较大（表3）。含水量为45.95%～51.59%，TPZ和ZJ2的水分含量较高，分别为51.59%和51.55%。淀粉含量为38.28%～53.69%，其中，＞50.00%的有QL3113、QX3113、LJT、JCY-3、YZX、LMY-1。可溶性糖含量为4.51%～11.62%，其中，＞10.00%的有QL3113、QX3113和ZQ1。可溶性蛋白质含量为0.35%～1.15%，其中，＞1.00%的有QL3113、QX3113、QX107和ZQ1。氨基酸含量为1.03%～1.82%，其中，＞1.70%的有QX107、ZQ1、ZJ2。结果表明，ZQ1与现有栽培品种燕山早丰、燕奎比较接近，有待于深入挖掘。

表3 不同种质板栗坚果营养指标Table 3 Nut nutrient indices of different chestnut germplasms

2.3 板栗坚果抗氧化成分

表4表明：18份板栗种质中，PPO的变异系数最大（64.51%），CAT的变异系数次之（33.85%）。SOD为717.40～1 310.42 U·g-1，其中，＞1 100.00 U·g-1的有QL3113、YHZ、XCZ、TPZ、YZX、JIH。PPO为11.22～89.06 U·g-1，其中，＞80.00 U·g-1的有YZX、ZQ1、LMY-1。POD为3 009.33～5 965.33 U·g-1，其中，＞5 000.00 U·g-1的有QL3313、ZJ2、JIH。CAT为48.20～367.19 nmol·min-1·g-1，其中，＞340.00 nmol·min-1·g-1的有QL3113、LJT、JIH、QTC。维生素C含量为203.81～595.40 μg·g-1，其中，＞560.00 μg·g-1的有QL3313、JSY-7、QTC。总多酚含量为338.67～822.33 μg·g-1，其中，＞700.00 μg·g-1的有QX3113、QX107、JCY-1、XCZ、ZJ2、LMY-1。总黄酮含量 为89.67～146.00 μg·g-1，其 中，＞130.00 μg·g-1的 有QL3313、QX3113、QX107、ZQ1、ZJ2。结果表明，18份板栗种质抗氧化成分均存在较大差异，其中，ZJ2、ZQ1和QTC与燕山早丰、燕奎比较接近，有待于进一步比较分析。

表4 不同种质板栗坚果抗氧化指标Table 4 Nut antioxidant indices of different chestnut germplasms

2.4 各指标相关性分析

如表5所示：单果鲜质量与体积、含水量呈极显著正相关，与维生素C呈极显著负相关；可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸和总多酚与总黄酮呈极显著正相关；可溶性糖、氨基酸和总黄酮与SOD呈极显著负相关。

表5 板栗坚果品质指标相关性系数Table 5 Correlation coefficients of chestnut nut quality indices

果形指数与可溶性蛋白、总黄酮和POD呈显著负相关，与PPO呈显著正相关；体积与含水量呈显著正相关；淀粉与可溶性蛋白、维生素C和总黄酮呈显著正相关；可溶性糖与总多酚呈显著正相关；可溶性蛋白与氨基酸、维生素C呈显著正相关，与SOD呈显著负相关；PPO与CAT呈显著负相关。

2.5 不同种质板栗品质因子分析

如表6所示：在不含抗氧化酶时，因子1在总黄酮、可溶性糖和总多酚上的载荷值较大；因子2在单果鲜质量、含水量和体积上的载荷值较大；因子3在维生素C、淀粉和可溶性蛋白上的载荷值较大。3个因子累计贡献率为67.612%。如表7所示：在含抗氧化酶时，因子1在SOD、氨基酸和总黄酮上的载荷值较大；因子2在单果鲜质量、体积和含水量上的载荷值较大；因子3在CAT、PPO和维生素C上的载荷值较大；因子4在果型指数、POD和总多酚上的载荷值较大；因子5在淀粉、可溶性糖和总黄酮上的载荷值较大。5个因子累计贡献率为78.140%，表明所列因子可代替评价板栗的品质质量，能够反映原始数据的大部分信息。

表6 板栗坚果品质指标因子分析（不含抗氧化酶）Table 6 Factor analysis of chestnut nut quality indices (in the absence of antioxidant enzymes)

表7 板栗坚果品质指标因子分析（含抗氧化酶）Table 7 Factor analysis of chestnut nut quality indices (in the presence of antioxidant enzymes)

2.6 板栗种质品质综合评价

利用隶属函数-因子分析相结合的方法，得到各个指标的公因子得分，再根据各自方差贡献率，建立板栗营养物质和抗氧化成分综合评价的数学模型：

式中：Fy代表综合得分，F1～F5分别代表因子1～因子5。

由表8、9可看出：18份板栗种质品质存在显著差异。4份栽培品种中，有或无抗氧化酶时综合得分排名均为：QX107＞QL3113＞QX3113＞HHZ20，表明3个良种中QX107品质较好，HHZ20品质较差。除3个良种外，无抗氧化酶时综合得分前4名分别是ZQ1、ZJ2、LMY-1，QTC；有抗氧化酶时综合评价前4名分别是ZJ2、ZQ1、JIH、QTC。其中，QTC坚果在18份板栗种质中个头较小。

表8 不同种质板栗坚果品质综合评价（根据式（1））Table 8 Comprehensive evaluation of nut qualities from different chestnut germplasms(according to equation (1))

3 讨论

燕山板栗种质资源丰富，遗传多样性复杂。对地方种质资源进行综合评价，筛选优良、丰产、早熟型板栗，有利于地方种质品种选育和改良[25-26]。由于板栗品质受基因型、环境条件、栽培技术等众多因素的影响[27]，因此，后续研究还需将这几个优良种质在同一资源圃中种植后再进行比较。以往种质评价研究主要将形态特征和营养指标考虑在内，本研究发现，18份板栗种质无论是在种实特征、营养物质还是抗氧化成分方面均存在显著差异。

18份板栗种质中淀粉、可溶性糖、可溶性蛋白、氨基酸含量变异系数为10.43%～34.72%，SOD、PPO、POD、CAT、维生素C、总多酚、总黄酮变异系数为7.05%～64.51%，营养物质中以可溶性蛋白含量变异系数最大，抗氧化成分中PPO活性变异系数最大。含水量的变化范围与杜常健等[17]对相同分布区的63份板栗种质研究结果类似，含水量影响板栗贮藏时间长短，因此，把含水量纳入品质评价中具有重要意义。可溶性糖直接影响板栗的甜度和风味，其含量的高低与板栗自身抗性密切相关[28]，因此，可溶性糖是品质评价的一个重要指标。可溶性糖的变化范围为4.51%～11.62%，比路超等[9]研究结果略高，与杜长健等[17]研究结果类似，因此，本研究为筛选含糖量较高的板栗种质提供了借鉴。淀粉可以转化为可溶性糖，在果实品质的形成过程中发挥着重要作用[29]，是决定板栗食用品

质的最主要因素。淀粉含量的变化范围为38.28%～53.69%，与张乐等[30]的测定结果22.89%～24.58%存在差异，原因可能是：一方面板栗不同种质差异显著，另一方面可能是采样区域不同。此外，可溶性蛋白也是评价板栗营养价值的重要指标。由于测定方法不同，本研究中测定的可溶性蛋白含量为0.35%～1.15%，低于张乐等[30]和刘艳等[6]测定的粗蛋白含量。

表9 不同种质板栗坚果营养品质综合评价（根据式（2））Table 9 Comprehensive evaluation of nut qualities from different chestnut germplasms(according to equation (2))

植物病害因造成产量下降和经济损失而受到人们广泛关注，如板栗的叶焦枯病[31]、果仁内腐病[10-11]，柿果的顶腐病[32]。由于板栗含水量在50%左右，采后及贮藏过程中容易发生腐烂。因此，采后合理贮藏是板栗果实能够发挥食用价值和经济价值的关键一步。板栗坚果随贮藏时间延长容易产生并积累活性氧，膜脂过氧化加剧，腐烂率增加[33]。抗氧化酶SOD、CAT和POD在板栗贮藏过程中可以通过清除果实体内的活性氧，有效阻止膜脂过氧化，降低腐烂率[12-13]，PPO与植物褐变密切相关[34]。本研究首次将4种抗氧化酶引入到板栗种质评价中，发现无论有或无抗氧化酶指标，3个良种中燕奎和燕山早丰综合排名均在前；其余14份种质中ZJ2、ZQ1综合排名总体在前，值得后续深入挖掘。LMY-1在无抗氧化酶指标时排名在前，但有抗氧化酶指标时排名偏后，是否意味着种质不耐贮藏，还需后续进一步验证。

此外，抗氧化酶活性的高低与外界环境变化密切相关。有研究发现，热处理能抑制板栗果实贮藏过程中呼吸强度以及POD、CAT活性[35]。本研究在4种抗氧化酶活性测定过程中实验条件一致，并且在采样过程中也尽可能保证贮藏条件相似，可以排除测定过程和采集时外部因素的干扰。另外，2种评价体系中青龙县和迁西县两地栗园的燕山早丰综合排名均在前。因此，除生长环境影响外，所获得的抗氧化酶活性高低应该是该种质内在特征。这表明抗氧化酶可以考虑作为板栗种质评价指标。

4 结论

本研究采用外观特征、营养物质、抗氧化成分以及新引入的4种抗氧化酶为指标，对燕山地区4份栽培品种和14份候选种质进行综合评价发现，除栽培品种外，ZJ2和ZQ1可以作为候选优良种质深入挖掘；抗氧化酶SOD、POD、CAT和PPO可以考虑作为板栗种质评价的指标。今后将在种质资源保存圃中对这2个候选优良种质及抗氧化酶指标进行深入研究。