黄酮类活性物质参与制备银纳米粒子的研究进展

赵志远,李培骏,程蕾蓉,曹兴业,谢闰生,李霞

(桂林理工大学 化学与生物工程学院,广西 桂林,541004)

纳米科学和纳米技术已被引入生物学、化学、物理学和生物工程的跨学科领域。近年来,纳米颗粒的研究在许多科学技术领域引起了广泛的关注,纳米技术领域经历了实质性的发展[1]。通常,纳米颗粒的直径范围为1～100 nm。纳米颗粒的物理和化学性质不同于常规材料。纳米颗粒因其高比表面积和小尺寸而具有独特的性质。纳米颗粒的生物活性和表面能随着其表面积的变化而变化[2]。

在众多的纳米技术中,由于纳米银(silver nanoparticles,AgNPs)独特的属性,它们被用于不同的领域,如生物医学(快速诊断、成像、组织再生和药物输送,以及新医疗产品的开发)[3]、纺织业、食品包装[4]、化妆品业、催化剂[5]、传感器、生物学、抗菌性[6]、DNA测序[7]、表面增强拉曼反射(surface-enhanced Raman scattering,SERS),气候变化和污染控制,清洁水技术,能源生产和信息存储等。一般来说,AgNPs的合成采用物理化学技术,如高压灭菌、γ射线辐射、微乳液的使用、电化学技术、化学还原、激光烧蚀、微波辐射和光化学还原进行[8-9]。上述方法产率高,但同时也存在一些局限性,如使用有毒化学品、功能成本和能源需求高。为了克服物理化学方法的局限性,替代的成本效益高的方法包括植物提取物、微生物和天然聚合物[10]。绿色化学和纳米技术的结合扩大了细胞遗传学和生物相容性金属纳米颗粒的应用范围[11]。

黄酮类化合物是一种植物次生代谢产物,广泛存在于食品和饮料(如水果、蔬菜、茶、可可和葡萄酒)中,并参与紫外线防护、色素沉着、抗病性和固氮刺激。重要的是,黄酮类化合物具有许多宝贵的生物功能,包括抗氧化、抗癌、抗病毒、抗炎和保肝活性。黄酮类化合物具有C15(C6—C3—C6)骨架的3个芳香环(A、B和C)排列。如图1所示,环A为苯,并与六元环(环C)缩合,该六元环在位置2处携带苯(环B)作为取代基。黄酮类化合物有4 000多种,按其化学结构分为六大类:黄酮(flavones)、黄酮醇(flavonols)、黄烷醇(flavanols)、黄烷酮(flavanones)、花青素(anthocyanidins),和异黄酮(isoflavones),它们可以主动螯合并将金属离子还原为纳米颗粒。黄酮不同种类的基本结构如图1所示。

黄酮类化合物具有生物相容性、低毒性和环境友好性等优点。然而,黄酮类化合物由于吸收率低、稳定性差、不溶性、被动扩散和胃肠道主动外排,阻碍了其在体内的生物活性应用[12]。有趣的是,使用纳米材料的新型药物输送系统具有广泛的应用,为科学整合和创新提供了新的治疗基础。从光谱角度来看,它们可以用作制备生物相容性AgNPs的还原剂,因为黄酮属于对金属表面亲和力相对较低的物质(它们的结构中不含硫或氮原子)。使用黄酮类化合物制备的AgNPs,可使AgNPs在食品和制药工业中的应用大大拓宽。本篇综述重点阐述了植物类黄酮化合物在AgNPs绿色合成中的作用,从制备方法、表征技术[紫外紫外-可见分光光度法(ultraviolet and visible spectrophotometry,UV-Vis)、傅里叶变换红外光谱法(Fourier transform infrared spectrometer,FTIR)、X-射线衍射(X-ray diffraction,XRD)、扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)、动态光散射(dy- namic light scattering,DLS)、透射电子显微镜(trans- mission electron microscope,TEM)和能量色散X射线能谱(energy dispersive spectroscopy,EDS)]、合成机制和应用方面等方面对其进行介绍。

图1 黄酮化合物的基本结构[12]Fig.1 Basic structure of flavonoids compound[12]注:flaones-黄酮;flavanones-黄烷酮;flavonols-黄酮醇;flavanols-黄烷醇;isoflavones-异黄酮;anthocyanidins-花青素

1 黄酮类AgNPs的制备

一般来说,AgNPs的合成首先是将溶液状态的黄酮与银盐(通常为硝酸银)混合。混合后,溶液特定的条件下孵育。AgNPs的合成分两步完成。第一步,是黄酮将银盐中的Ag+还原成Ag0;第二步是离心,去除反应中未反应的游离体,如黄酮、银盐等。由于黄酮类化合物的独特的生物活性,在合成AgNPs的过程中具有还原剂和稳定剂的作用[11]。可以通过优化不同参数(温度、pH值、时间、黄酮和硝酸银浓度)来制备不同产量、尺寸、形状和稳定性等性质的AgNPs。

pH值对黄酮类化合物的物理和化学性质有很大影响,这与它们的溶解度、解离度和还原能力密切相关,且对AgNPs的合成具有一定的影响[13]。碱性环境是银离子还原反应的必要条件。碱性条件下,黄酮类化合物中羟基更容易失去H+，从而使得整个分子带负电荷,这种带有负电荷的黄酮类化合物不但更容易与Ag+作用,而且更容易失去电子发生还原反应。LUO等[14]研究了pH值的变化对制备的AgNPs,使用紫外可见光谱进行表征,成功制备了粒径为12.7 nm的AgNPs;发现,当反应系统的pH值为7时,在400～450 nm处未发现明显的吸收峰,说明在此条件下并没有AgNPs的产生;当pH值达到8时,从350～600 nm 的吸光度显著增加,最大吸收峰在426 nm,表明AgNPs的形成。当pH值达到10时,表面等离子体共振(surface plasmon resonance,SPR)波长向较短波长有一个小的偏移,表明粒径减小[15]。ZHOU等[16]通过对不同pH值制备AgNPs的过程中影响研究。在pH值为10的条件下,使用槲皮素和芦丁制备了粒径大小为25 nm的AgNPs,所得到的结果与LUO等[14]一致。因此,在其他条件相同的情况下,pH值在10左右时,是制备AgNPs的最优pH。

通过控制AgNO3和黄酮化合物的浓度,可以达到增加AgNPs产量的目的。DENG等[17]在研究AgNO3和黄酮化合物的浓度对于制备AgNPs影响研究中发现,当AgNO3的浓度非常低时,几乎不发生AgNPs的合成。随着AgNO3的浓度增加,AgNPs溶液的产量逐渐增加,最大吸收强度增强。同时,RAO等[18]通过改变黄酮化合物浓度达到了类似的结果。黄酮化合物浓度过低时,反应体系中缺少还原剂,便无法还原制备出AgNPs。

据报道,反应温度和反应时间一直是纳米颗粒合成中最关键的因素之一。LI等[19]在研究中发现,AgNPs 的产量随着温度的升高而增加,较高的温度可以促进更多AgNPs产生,这与MUNIYAPPAN等[20]的研究结果一致。在较低温度时,如20～60 ℃,温度对AgNPs的粒径影响不大。但在较高温度时,如80 ℃或90 ℃,AgNPs的粒径和多分散性指数(polymer dispersity index,PDI)会突然增加。这种现象可能是由于AgNPs胶体在高温下的稳定性降低,导致AgNPs的团聚和均匀性差。较高的温度还会导致黄酮类化合物失去其部分原有的生物活性,导致所制备的Ag- NPs无法达到预期的作用。所以,在使用黄酮制备AgNPs的过程中应选取适当的温度作为反应条件。反应时间也是影响AgNPs合成的主要因素之一[21]。BARUAH等[22]在研究反应时间对合成AgNPs影响时发现,在反应时间达到1 h时,Ag+的还原率达到最高。但综合来看反应时间对其影响不大。

因此,综合来看,在制备黄酮基AgNPs的过程中,反应温度、时间、pH值、黄酮浓度和硝酸银浓度等反应条件对AgNPs的制备都产生了不同程度的影响(表1)。但在使用不同黄酮类化合物制备AgNPs的研究中,发现这些反应条件都是对AgNPs的综合影响,单一条件对AgNPs的影响无法呈现出相关性。因此,在使用黄酮类活性物质制备AgNPs的研究中,应做好前期制备的工艺优化。这对制备AgNPs整个实验的质量而言,具有重要的意义。

表1 不同黄酮类化合物制备AgNPs的优化条件、表征方法及应用Table 1 Optimization conditions, characterization methods and application of AgNPs with different flavones

2 黄酮类AgNPs的表征

由于单一技术无法完全表征黄酮基AgNPs,因此可以采用多种不同的技术来表征,如UV-Vis、FTIR、XRD、SEM、DLS、TEM、EDX、XPS和Zeta电位等,来研究黄酮化合物与AgNPs的结合机制、表面形貌、粒径、价态和晶体性质等特征。

AgNPs的初始合成主要通过UV-Vis进行分析。一般来讲,不同的纳米粒子在UV-Vis光谱中吸收峰的位置会不相同,例如,纳米铜会在600～650 nm处有较强的吸收峰,纳米金的吸收峰会处于500～600 nm处,而纳米银会在410 nm左右表现出很强的吸收峰[10]。因此,可以通过UV-Vis光谱来确定所制备的金属纳米粒子的种类。同时,对于同种样品可以通过峰的位置及形状判断样品中纳米粒子的大小和形貌。在使用紫外-可见光谱分析黄酮基AgNPs时,可以发现在240～285 nm范围内出现第一个紫外吸收峰,这归因于黄酮类物质所含有的芳香环[12]。FTIR有助于探测银纳米粒子表面的化学成分和纳米粒子上封端剂的局部分子环境。总的来说,黄酮基AgNPs的红外光谱通常保留了黄酮类化合物的特征谱带,并且提供了黄酮基AgNPs的结构信息[17-39]。通过光谱法来获得黄酮类活性物质与AgNPs中化学成分组成的信息,已是很普遍的手段。诸如拉曼光谱和核磁共振等,亦可用于此类研究,但使用甚少。

SEM和TEM研究了纳米颗粒的表面形貌,使用DLS[46]来测定粒子粒径大小。在使用黄酮类物质合成纳米银后,由于黄酮具有还原剂及稳定剂的作用,可以通过电镜来从AgNPs的表面研究其结合机制及包覆状态。LI等[43]和AMEEN等[44]使用SEM和TEM表征杨梅素合成的AgNPs,发现其纳米粒径大小为25 nm,表面形状为圆形颗粒。AgNPs粒子的形状大多为球状圆形,但也有以不规则多面体形状存在。AgNPs粒子的形状大多是可以通过制备方法来控制。

EDS主要是分析所制备的AgNPs的元素组成[28]。在使用EDS分析AgNPs时,EDS光谱在3 keV处显示出强烈的峰值,表明Ag是AgNPs中的主要元素。SHIIRZADITABAR等[47]在研究中发现,在3 keV的峰值显示出弱碳、氧和氯等。这是由于黄酮类化合物或其他黄酮提取物中的的生物分子与Ag- NPs表面结合。XPS用来揭示所制备的黄酮基Ag- NPs中的金属银的存在并获得其化学组成和氧化态的信息[43]。XRD主要用于研究合成AgNP的晶体或非晶结构。测定AgNPs的XRD光谱范围为20°～80°。一般会观察到4个峰,将所观察到的峰与来自粉末衍射标准联合委员会(Joint Committee on Powder Diffraction Standards,JCPDS)或国际衍射数据中心(The International Centre for Diffraction Data,ICDD)的银数据库进行比较,被索引为111、200、220和311,它们与银的面心立方(face center cubic,FCC)结构相匹配(JCPDS文件号04-0783)[43-44]。一般而言,XRD的峰宽度,一定程度上代表着AgNPs粒径的大小。使用Debye-Scherrer方程计算合成AgNPs的平均尺寸。Zeta电位计算溶液中电场作用下移动粒子的净电荷。其中负值表示粒子周围的净电荷,而不是实际的表面电荷。负电荷可能是由于生物活性化合物(如黄酮等化合物)吸附在AgNPs表面所致。AgNPs的稳定性可由Zeta电位值确定。高Zeta电位会在粒子之间产生强大的排斥力,从而阻止它们聚集。因此,AgNPs在酸性pH下显示较低的Zeta电位值,而在更碱性的pH溶液中显示较高的Zeta电位值。

上述表征方法已广泛用于AgNPs的表征实验,但是依然无法完全表述出AgNPs的生物合成奥秘。还有其他的表征方法应用在金属纳米粒子的表征中,如核磁共振、拉曼光谱、球差电镜等,但是在黄酮基AgNPs的研究中还未曾有过使用。在研究黄酮基AgNPs的具体结合机制以及黄酮类化合物中官能团与Ag的具体结合位点中,迫切需要更先进的表征方法和仪器来揭示这一问题。

3 黄酮类AgNPs的合成机制

魏思敏等[41]研究发现,黄酮类化合物在碱性条件下更容易与Ag+反应。在碱性条件下黄酮类化合物失去羟基上的H+生成氧负离子,更容易通过静电相互作用与AgNO3中的Ag结合,形成Ag0,如图2所示。ANJUM等[45]在使用亚麻提取物制备Ag- NPs的研究中发现,黄酮类化合物是纳米颗粒还原和稳定的主要原因。如图3所示,ANJUM等[45]阐述了黄酮类化合物(槲皮素)通过氧化反应将Ag+还原为Ag0的机理和植物活性化合物对AgNPs起到了封盖及稳定的作用。

目前,大多数对黄酮类化合物与AgNPs的具体结合机制依然是推测和假想。大多数现有文献清楚地表明黄酮类化合物中的羟基和羰基在AgNPs的形成中共同起主要作用。从这一点看来,黄酮类化合物形成纳米材料的效率取决于黄酮类化合物结构中羟基和羰基的数量。羟基和羰基的化学修饰可以阐明这些基团的数量和位置在纳米材料形成中的重要性。

图2 碱性条件下山茱萸水提液还原Ag+生成AgNPs的可能机制(以槲皮素为例)[41]Fig.2 Possible mechanism of Ag+ generating AgNPs under alkaline conditions (for example, quercetin)[41]

4 黄酮类AgNPs的应用

与宏观材料相比,纳米材料的物理、化学和生物特性往往表现出独特且发生显著变化。在各种纳米粒子中,AgNPs等金属纳米粒子由于具有较大的比表面积和不同的生物活性,在生物医学领域具有广阔的应用前景。银金属历来备受关注,并在不同领域中得到应用。AgNPs由于其在催化、生物传感、药物传递和纳米器件制造等众多领域的潜在应用,已引起人们极大的关注。银主要用于合成纳米颗粒的稳定分散体,这在摄影、催化、生物标记、光子学、光电子和SERS检测等领域非常有用。

AgNPs作为抗菌剂,从医疗器械和家用电器的消毒到水处理都有广泛的应用。由于Ag纳米颗粒的抗菌特性,使得这些纳米金属在医药、各种工业、畜牧业、包装、配件、化妆品、卫生和军事等不同领域的应用。AgNPs对感染性微生物具有明显的抑制作用,包括大肠杆菌、枯草杆菌、霍乱弧菌、铜绿假单胞菌、梅毒斑疹伤寒和金黄色葡萄球菌。AgNPs所展示出来的良好的抑菌效果,吸引了很多研究者的注意。LI等[43]在使用二氢杨梅素制备的AgNPs抗菌研究中发现,在室温下,其对大肠杆菌和沙门氏菌都有较好的抑制效果,最低抑菌浓度分别为1 μg/mL和100 μg/mL。JAIN等[29]使用槲皮素制备的AgNPs对大肠杆菌的最低抑菌浓度为150 μg/mL。DENG等[17]使用山奈酚制备的AgNPs对大肠杆菌的最低抑菌浓度达到了2 μg/mL。LUO等[14]在对使用百合花瓣中提取的黄酮制备的AgNPs抑菌研究中,发现其对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的最低抑菌浓度分别为31.25、62.5、250和250 μg/mL。AMEEN等[44]使用同样的方法制备出二氢杨梅素-AgNPs,研究了其对烟曲霉、黑曲霉、福尔摩沙曲霉、白色念珠菌和副丝酵母菌等5种真菌的抗菌性,其最低抑菌浓度分别为0.83、0.73、0.67、0.95和0.89 μg/mL。通过以上使用不同黄酮类活性物质制备AgNPs的研究,可以发现,不同的黄酮基AgNPs具有不同的抑菌效果。这些初步的抑菌研究为AgNPs在抑菌领域的应用做了基础。YOUSSEF等[48]将AgNPs加入到聚酰胺和聚苯乙烯等常用包装材料中,所得复合材料对多种细菌具有良好抑制效果。辛宜聪等[49]将绿色合成的AgNPs与壳聚糖膜结合,制成复合材料。AgNPs在壳聚糖膜中分散良好,对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌均有良好的抑制效果。在抑菌材料这一领域,大多依然使用化学法制备AgNPs,这免不了制备的AgNPs残留部分化学试剂。因此,使用黄酮类化合物绿色制备AgNPs将有效解决这一问题,这也为黄酮类AgNPs的后续应用研究指明了路径。

A-亚麻中可能参与AgNPs还原和稳定的黄酮生物分子的结构;B-氧化还原反应显示了使用槲皮素(黄酮化合物)将Ag+还原为Ag0的机理;C-黄酮化合物对AgNPs 的封盖作用图3 黄酮类物质制备纳米银粒子的合成机制[45]Fig.3 Synthesis mechanism of silver nanoparticles prepared from flavonoids[45]

在医药方面,ANWAR等[23]成功将橙皮苷负载于树胶基AgNPs上,制备出橙皮苷负载的树胶基AgNPs。所得复合材料具有增强药物缓释及抗菌作用,其主要作用为抗食脑虫病,效果良好。RAO等[18]使用同样的方法制备出的橙皮苷负载于树胶基AgNPs的复合材料中,发现其还具有抗关节炎的作用。树胶基AgNPs在整个体系中的作用为药物输送和药物缓释。WANG等[34]将异荭草苷负载于绿色制备的AgNPs上,发现所制得的复合物在体外模拟胃肠道消化中比AgNPs更稳定。此外,异荭草苷-AgNPs具有较低的红细胞溶血率和细胞毒性,并对α-葡萄糖苷酶和胰脂肪酶有明显的抑制作用,为进一步开发高稳定性、低细胞毒性的AgNPs-Iso治疗Ⅱ型糖尿病和肥胖提供了基础支持。

ZHOU等[16]在研究中使用了槲皮素和芦丁两种黄酮类化合物制备了AgNPs,将这种黄酮基AgNPs用于丝织物的涂层材料。经AgNPs处理的丝织物对大肠杆菌的抗菌活性保持在90%以上,且30次洗涤循环后仍然使用,这种应用可作为卫生相关和医用纺织材料。金属基纳米颗粒中,AgNPs在催化作用中起着重要作用,在许多有机转化合成精细化学品中得到了广泛的探索。LUO等[14]使用百合花瓣中的黄酮制备出了AgNPs。生物合成的Ag-NPs具有良好的抑菌性和稳定性以及对对硝基苯酚的硼氢化反应也表现出良好的催化活性。MUNIYAPPAN等[20]以黄檀叶为原料,在水溶液中合成了AgNPs。合成的AgNPs还可以有效地催化4-硝基苯酚(p-nitrophenol,4-NP)还原为4-氨基苯酚(4-aminophenol,4-AP)。

通过使用黄酮类化合物或植物中提取的黄酮类化合物绿色制备的AgNPs,可有效降低上述应用中有害化学物质的影响,并且可以降低其生产成本。这两项优势,使其研究及应用价值大大增加。

5 总结及展望

黄酮类活性物质具有独特的结构,决定了其具有特殊的生物活性,且可有效与Ag结合。因此,黄酮类活性物质合成AgNPs得到广泛关注。本文首先讲述了黄酮类活性物质生物合成AgNPs的制备工艺,以及温度、pH值、时间、黄酮和硝酸银浓度等方面对AgNPs的形状、尺寸、稳定性和产量等的影响;其次综述了UV-vis、FTIR、XRD、SEM、DLS、TEM、EDX、XPS和Zeta电位等表征方法在黄酮类AgNPs中的应用;并描述了黄酮类AgNPs结合机制,推测在AgNPs的合成中只涉及到黄酮类化合物部分官能团,如羟基和羰基在AgNPs的形成中起主要作用;最后介绍了黄酮类AgNPs在医药和抗菌领域的应用。这些初步发现为更全面的黄酮类AgNPs研究铺平了道路,以确定哪些类型的黄酮化合物参与了AgNPs的合成,以及可能影响AgNPs形成的因素。黄酮类化合物不仅为生物合成AgNPs提供了新思路,而且拓展了AgNPs的商业化应用的领域。

总的来说,虽然黄酮类AgNPs的研究尽管已经取得了重大进展,但随着纳米科学领域的发展,仍然可以预期会有很多新的研究进展方向:(1)AgNPs医学和工业中的广泛应用,但是对人类健康的相关潜在风险,比如诱导细胞毒性、氧化应激、活性氧、DNA损伤和细胞死亡,因此迫切需要开展毒理学及其机理方面的研究。(2)目前对黄酮类活性物质制备AgNPs的研究较多,但其具体结合位点依然不得而知,这样的确切机制仍有待探索。(3)黄酮类活性物质拥有多种生物功能,广泛用于药物研究。但是作为药物缓释材料领域中研究依然不足。(4)目前对单分子纳米金属材料研究甚广,尤其是银纳米材料。但对于双金属合金纳米材料或多金属合金纳米材料,其效能能否比普通单金属纳米材料更具优势,尚值得研究。