纸芯片法快速检测ρ(黄酮类化合物)*

张 剑,郑志鸿,张 博,张宁宁,唐新萍,李一冰,夏敏珠,刘春叶

(西安医学院 药学院,陕西 西安 710021)

黄酮类化合物是一类重要的天然有机化合物,具有多种生物活性,如抗炎、减压、保肝、降脂、抗氧化、抗肿瘤等[1-2]。因此,黄酮类物质简便、快速、准确地检测方法近年来受到研究人员的广泛关注。

黄酮类化合物的传统检测方法有紫外分光光度法、高效液相色谱法、红外光谱法、荧光分析法、毛细管电泳法等。这些方法准确且重现性好,但均需要大型分析仪器,对设备和操作要求较高,试剂消耗量大,分析时间长,不能及时进行现场检测[3-5]。微流控纸芯片技术是近几十年发展起来的新技术,旨在把生物和化学等领域中所涉及的样品制备、分离检测、生物与化学反应等基本操作集成到纸芯片上,用以完成不同的生物或化学反应过程,并对其产物进行分析[6-9]。该方法在纸芯片上实现进样、检测等全部实验流程,是一个集分析检测于一体的微型实验分析平台。与传统检测方法相比,微流控纸芯片无需依赖附加大型检测仪器,操作简便、成本低廉、携带方便,能使检测更经济、实用、便捷[10-13]。目前,技术尚未用于黄酮类化合物的检测分析。作者旨在建立一种基于纸芯片的黄酮类化合物快速测定方法,为中药成分含量测定提供新思路。

1 实验部分

1.1 试剂与仪器

芦丁:纯度≥98.0%,上海源叶生物科技有限公司;甲醇、氢氧化钠:分析纯,天津市河东区红岩试剂厂;硝酸铝、亚硝酸钠:分析纯,天津市风船化学试剂厂;蒺藜叶和果实:均来源于陕西省陕北地区,经西安医学院张寒教授鉴定。

紫外可见分光光度计:UV-6000T,上海元析仪器有限公司;十万分之一电子天平:Precise Gravimetrics AG Dietikon,Switzerlang;喷腊打印机:Xerox Phaser8570,美国富士施乐集团;手机:iphone7,苹果公司;不同规格移液器:大龙兴创实验仪器股份公司;纸芯片:Whatman No.1,滤纸实验室自制。

1.2 实验原理

黄酮类化合物结构中相邻的羰基与羟基,如5-羟基和4-羰基、3-羟基和4-羰基、4′-羟基和5′-羟基,可与Al3＋在碱性条件下生成红色络合物。以芦丁为对照品,分析待测物质总黄酮的含量[14]。将显色剂铺满纸芯片,再将待测物溶液滴加到纸芯片的中心,两者在纸芯片上发生显色反应,通过手机拍照记录结果,用PhSp_CS2软件分析图片色度值。

2 结果与讨论

2.1 实验条件的优化

精密移取50μLρ(芦丁)＝0.294 0 mg/m L标准溶 液 于0.5 m L离心管中,加 入5.0μLw(Na NO2)＝4%溶液,静置反应6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液;静置反应6 min。分别精密移取上述标准溶液7.6、7.8、8.0、8.2、8.4μL,依次同4.0μLw(NaOH)＝10%溶液在纸芯片上进行反应,考察芦丁标准溶液上样量对显色结果的影响,见图1。

由图1可知,上样量为7.8μL时,液体可完全铺满纸芯片,呈规则圆形且显色均匀,上样量为8.0、8.2和8.4μL时溶液有部分溢出,故选取7.8 μL为最佳芦丁溶液上样量。

考察显色时间对显色强度的影响,见图2。

图1 芦丁溶液上样量对显色强度的影响

图2 反应时间对显色强度的影响

由图2可知,显色3 min和4 min时所得颜色铺展不均匀,出现颜色堆积现象从而影响分析结果。

反应时间对颜色强度最大值(PhSp_CS2软件分析RGB通道即红、绿、蓝三叠加通道mean值,简称RGB值)的影响见表1。

表1 反应时间对RGB值的影响

由表1可知,显色2 min时颜色最均匀且RGB值最大,因此选择显色2 min。

w(NaOH)、w[Al(NO3)3]和w(Na NO2)均会对显色强度产生影响,见表2~表4。

表2 w(NaOH)对RGB值的影响

表3 w[AI(NO3)3]对RGB值的影响

表4 w(NaNO2)对RGB值的影响

由表2~表4可知,NaNO2溶液和Al(NO3)3溶液体积为5.0μL、质量分数分别为4%和10%,NaOH体积为4.0μL、质量分数为10%时RGB值最大;NaNO2和NaOH体积分别为5.0μL和4.0μL,质量分数分别为4%和10%,Al(NO3)3体积为5.0μL,质量分数为10%时RGB值最大;NaOH和Al(NO3)3溶液体积分别为4.0μL和5.0μL,质量分数为10%,NaNO2体积为5.0μL,质量分数为4%时RGB值最大。因此选择w(NaOH)＝10%、w[Al(NO3)3]＝10%,和w(NaNO2)＝4%进行显色实验。

2.2 标准曲线的建立

以RGB值对ρ(芦丁)进行线性拟合见图3。

图3 RGB值对ρ(芦丁)线性拟合

配制ρ(芦丁)＝0.058 8、0.117 6、0.176 4、0.235 2、0.294 0 mg/m L溶液,精密移取50μL至离心管中,加入5.0μLw(NaNO2)＝4%溶液,反应6 min,再加入5.0μLw[Al(NO3)3]＝10%溶液,反应6 min。精密移取4.0μLw(NaOH)＝10%溶液滴于纸芯片中心,待溶液铺满纸芯片后,取上述芦丁溶液7.8μL滴加到纸芯片中心位置,反应2 min后用手机拍照,PhSp_CS2进行分析,得出RGB值。

由图3可 知,ρ(芦 丁)＝0.058 80~0.294 0 mg/m L,线性关系良好。

2.3 方法学考察

取用0.176 4 mg/m L芦丁标准品溶液,按照最佳检测条件在纸芯片上与Na NO2-Al(NO3)3-NaOH显色体系反应,手机拍照,用PhSp_CS2软件分析芦丁与空白的RGB值,见表5。根据标准工作曲线方程换算检测浓度,得纸芯片法日内重复性为1.44%(n＝6);以上步骤重复操作6 d,得日间重复性为1.71%;日内和日间重复性结果均小于5%,说明该方法的重复性良好。

表5 纸芯片方法的日内重复性和日间重复性

取用0.235 2 mg/m L芦丁标准品溶液,按照最佳实验条件在纸芯片上与NaNO2-Al(NO3)3-NaOH显 色 体 系 反 应,分 别 于2、4、6、8、10、12 min拍照,得到6组图像,提取6组图像的RGB值,根据标准工作曲线方程得到检测质量浓度,见表6。

表6 纸芯片方法的稳定性

由表6可知,纸芯片检测方法在12 min内保持稳定,RSD值为0.76%,稳定性良好。

2.4 蒺藜样品中总黄酮含量测定

蒺藜果实和叶中黄酮提取方法参照文献[15],取干燥的刺蒺藜果实和叶细粉各3 g,倒入250 m L圆底烧瓶中,加60 m L体积分数80%乙醇,于超声仪上加热回流并超声40 min,抽滤2次,滤液转移至100 m L容量瓶,用乙醇定容。采用纸芯片法,测得刺蒺藜果实和叶子提取液中ρ(黄酮)＝28.89、109.5μg/m L。在最大吸收波长为506 nm时采用分光光度法测得上述提取液ρ(黄酮)＝28.71、108.7μg/m L。2种方法检测结果符合较好,相对误差分别为0.62%和0.76%。

取3份刺蒺藜果实提取液,分别加入芦丁标准品,进行加标回收实验,见表7。

由表7可知,提取液的加标回收率分别为97.93%、98.69%、101.75%,均 在95.00%~105.00%,说明纸芯片检测法加标回收率良好。

表7 纸芯片检测法的加标回收率结果

3 结 论

作者建立了一种基于纸芯片技术快速检测黄酮类化合物的新方法。该方法简便、准确,具有较好的重复性和稳定性,无需借助分光光度计等大型仪器,即可对未知样品中黄酮类化合物含量进行定量检测,为含有黄酮物质的药材的质量评价提供了科学依据,在黄酮类化合物的定量检测方法学领域具有十分良好的发展前景。