结晶麦芽类黑精对拉格啤酒酵母KS-12发酵的影响

李存,韩冰心,褚贝贝,潘贺鹏,张明,陆健*,蔡国林*

1(工业生物技术教育部重点实验室(江南大学),江苏 无锡,214122)2(粮食发酵与食品生物制造国家工程研究中心(江南大学),江苏 无锡,214122)3(江南大学 生物工程学院,江苏 无锡,214122)4(正大食品研发有限公司,浙江 慈溪,315300) 5(江苏省农垦麦芽有限公司,江苏 射阳,224300)

麦芽是啤酒酿造的主要原料,是影响啤酒品质的重要因素。结晶麦芽是目前工坊啤酒酿造中常用的特种麦芽之一,可以赋予啤酒独特的风味和口感。结晶麦芽与普通麦芽在发芽工序上是类似的,但焙焦工艺不同,结晶麦芽需要经过高温焙烤,焙烤温度为130～180 ℃[1-2]。发芽结束的绿麦芽在经过焙烤时,其中的还原糖末端羰基与氨基酸、多肽或蛋白质之间发生非酶褐变,即美拉德反应[2]。美拉德反应赋予结晶麦芽色泽、风味及抗氧化性等特性[4],对啤酒的品质也有着重要的影响。顾宏等[2]研究了结晶麦芽对啤酒酿造的影响,发现结晶麦芽的大部分特征风味在啤酒酿造的煮沸过程中挥发散失,但成品啤酒的风味却发生了极大的改变,推测结晶麦芽中的美拉德反应终产物类黑精影响了酵母的生长和代谢,从而影响啤酒风味物质的含量。

美拉德反应贯穿啤酒酿造的整个过程[5],对啤酒的理化指标和风味物质有着重要影响。美拉德反应产物类黑精是啤酒最重要的内源性抗氧化物,有较强的DPPH自由基清除能力,直接影响啤酒的风味、色泽和黏度[6]。ZHAO等[7]的研究表明啤酒中的抗氧化性与类黑精的含量和分子质量相关,随着类黑精含量和分子质量的提升,啤酒的抗氧化性也显著提升。同时,由于具有抗氧化力类黑精含量的差异,麦汁的氧化还原电位势必受到影响,进而可能影响酵母的生产强度和胁迫耐受性,导致代谢产物发生改变[8]。此外,麦汁中发酵性碳水化合物和氨基酸随着麦汁颜色加深而显著降低,而麦汁颜色深浅与类黑精含量相关,表明类黑精可能影响酵母的发酵速率[9]。COGHE 等[4]的研究表明,增加麦汁颜色和降低乙酸乙酯的形成速度呈负相关,深色麦汁发酵时乙酸异戊酯的产生完全被抑制。另一方面,尽管美拉德反应产物被证明可以抑制参与合成关键风味化合物(如高级醇) 的酶,但深色麦汁并不影响高级醇的合成[10]。目前为止,关于类黑精对啤酒酵母生长、代谢及风味物质积累影响的研究尚未见报道,而且不同分子质量的类黑精其结构与功能还存在一定的差异[11]。

本文通过提取结晶麦芽中的类黑精,并将其超滤为不同分子质量的组分,在麦汁中添加不同分子质量类黑精的组分进行啤酒酿造,考察其对啤酒酿造过程中酵母生长、发酵速率、啤酒常规理化指标以及啤酒最终风味物质含量的影响,为今后精准调控啤酒风味提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 实验材料

啤酒酵母KS-12,江南大学酿造酒实验室保藏;结晶麦芽(452 EBC),江苏省农垦麦芽有限公司;马格鲁门和卡斯卡特酒花,上海金啤食品原料有限公司。

将大麦麦芽粉碎,当水温达到48 ℃时,按料水比1∶3.5 (g∶mL)进行投料,然后参考顾宏[12]报道的麦芽糖化工艺进行糖化;糖化完成后,过滤,将麦糟滤去,得到麦汁;将过滤的麦汁煮沸,煮沸时间60 min,并在煮沸过程中分3次添加酒花,在刚煮沸时添加0.2 g/L的马格鲁门酒花,在煮沸45 min再添加0.2 g/L的马格鲁门酒花,最后在煮沸结束时加入0.1 g/L的卡斯卡特酒花;煮沸结束后进行第2次过滤,往过滤后的麦汁中添加适量的水,通过阿贝折光仪将麦汁浓度调整为12 °P,灭菌备用。

1.1.2 仪器与设备

EL204电子分析天平,Mettler Toledo仪器(上海)有限公司;EBC-LF麦芽标准粉碎机,北京德之杰公司;紫外分光光度计,北京普析通用仪器有限责任公司;EYEL4KCL-2000恒温恒湿箱,日本东京理化器械株式会社;YQ-PJ-6B自动糖化仪,轻工业部西安轻机所电光公司;Trace1310-ISQ LT ISQ单四级杆气质联用仪,美国赛默飞世尔科技公司;Agilent 1260高效液相色谱仪,美国Agilent公司;MULTISKAN FC型酶标仪,赛默飞世尔(上海)仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 类黑精的提取与超滤

参考CARVALHO等[13]的类黑精提取的方法,并稍做修改。称取2.00 g结晶麦芽于100 mL容量瓶中,按照乙醇体积分数70%、料液比1∶10(g∶mL)和浸提时间3 h的条件浸提,然后以3 500×g离心15 min,取上清液,重复多次。真空旋转蒸发除去乙醇,过滤收集液体,冷冻干燥。采用徐献兵等[11]的方法对水溶性类黑精超滤。取已冷冻干燥的美拉德反应产物类黑精溶于超纯水中,采用不同截留分子质量(3、10 kDa)的Millipore离心管将其超滤分为不同分子质量的组分,所有样品以4 000×g离心20 min,用蒸馏水洗涤3～5次。不同分子质量的类黑精组分分别命名为MW-L(<3 kDa)、MW-M(3～10 kDa)、MW-H(>10 kDa),不同组分分别冷冻干燥,备用。

1.2.2 发酵条件

在1 000 mL锥形瓶中发酵,每瓶装入500 mL麦汁,编号为对照(不添加类黑精)、MW-L、MW-H和MW-M,发酵前分别向对应编号麦汁中添加0.50 g的相应分子质量组分类黑精。啤酒酵母活化后接入麦汁中,起始密度为1×106CFU/mL,液封发酵栓,密封瓶口,12 ℃下静置发酵。所有处理均设置3次生物学重复。

根据啤酒酵母KS-12在12 ℃培养箱的生长曲线,啤酒酵母延滞期每24 h测定1次酵母细胞生长情况(OD600值)、还原糖和α-氨基氮含量,酵母对数生长期后每12 h检测1次酵母生长情况,进入稳定期后每24 h测定1次,主发酵结束转入4 ℃后发酵4 d,发酵所得啤酒进行过滤,除去酵母,进行啤酒常规理化指标的测定。

1.2.3 啤酒理化指标的测定

色度、pH、真正浓度和原麦汁浓度的测定参考GB/T 4928—2008《啤酒分析方法》,酒精度测定参考5009.225—2016，啤酒稀释100倍后根据参考文献[14]描述的方法测定DPPH自由基清除率。

1.2.4 啤酒风味物质测定

高级醇、酯检测使用顶空固相微萃取结合气相色谱-质谱联用仪进行。取6 mL样品加入15 mL样品瓶,加入2.5 g NaCl、60 μL内标(2-辛醇)后用带有隔垫的瓶盖拧紧密封。

固相微萃取(solid-phase microextraction,SPME)提取方法:50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头在具塞顶空瓶上部吸附,于50 ℃下萃取30 min,在气相色谱进样口250 ℃进行解吸,解吸1 min。

色谱条件:TG-WAXMS(60 m×0.25 mm,0.25 μm);升温程序:45 ℃维持1 min,以6 ℃/min速度升温至230 ℃,保持6 min;载体为He,流速为1.5 mL/min;进样口温度250 ℃,解吸时间1 min;不分流。质谱条件:离子源EI源;离子源温度:200 ℃;四级杆温度:150 ℃;电子能量:70 eV,扫描质量范围33～400 u;进样方法:手动进样。采用内标法进行半定量分析,计算如公式(1):

待测挥发性物质浓度=

(1)

有机酸测定将发酵结束的啤酒过滤后,经0.22 μm滤膜过滤后采用高效液相色谱测量,色谱条件参照文献[15]。

1.2.5 啤酒的感官评价

由实验室10名通过专业培训的人员,组成感官评价小组,对啤酒的外观,泡沫性能,啤酒香气和酒体口感4个方面进行评价,最终分值取平均分。评分细则见表1[16]。

表1 啤酒感官评价标准Table 1 Sensory evaluation standard of beer

1.2.6 统计分析与作图

使用SPSS 20.0单因素方差分析(ANOVA)进行差异显著性分析,表示为平均值±标准差，采用Duncan检验两两比较, 显著性水平设置为0.05。图形绘制采用Origin 9.0。

2 结果与分析

2.1 类黑精对酵母生长和发酵速率的影响

在发酵过程中,可发酵性糖和含氮物质的吸收利用速度是酵母发酵的重要指标[17]。如图1所示,从对数初期开始,添加高分子质量的类黑精组(MW-H)有助于提高酵母的细胞浓度,对数后期后,MW-H中酵母的OD值为2.252,显著高于对照组的2.010。酵母细胞浓度的提升可以加快麦汁中还原糖和α-氨基氮的消耗,提高酵母的发酵速率。MW-H中α-氨基氮的消耗速率最大，为1.63 g/(L·h),高于对照组的1.55 g/(L·h)。在酵母对数生长前期(48 h),MW-H的还原糖消耗速率最大为0.35 g/(L·h),显著高于对照组的0.18 g/(L·h)。POHL[18]研究发现类黑精可以螯和重要金属离子镁,镁离子在保护酵母免受环境胁迫方面也发挥着重要作用。表明类黑精可能通过螯和金属离子镁从而保护酵母,促进酵母对麦汁中还原糖和α-氨基氮的利用速度。

a-酵母和还原糖的含量变化;b-α-氨基氮的含量变化图1 不同分子质量组分类黑精对酵母生长、还原糖和α-氨基氮消耗的影响Fig.1 Effects of different molecular weight groups of melanoidins on yeast growth,sugar， and α-amino nitrogen consumption

2.2 类黑精对啤酒理化指标的影响

麦汁发酵结束后,不同分子质量组分类黑精对啤酒常规理化指标的影响如表2所示,表明类黑精在一定程度上影响了酵母的生长代谢。添加不同分子质量类黑精啤酒的酒精度相近,表明类黑精在酵母生长前期虽然促进酵母生长,但对发酵的主要代谢产物并没有显著的影响。类黑精对啤酒的色度、总酸和DPPH自由基清除率有显著影响(P<0.05)。随着类黑精分子质量的增加,啤酒的色度增加,MW-H的啤酒色度为40.21 EBC,显著高于对照组的9.31 EBC,表明类黑精具有良好的增加啤酒色泽的效果。MW-H啤酒的总酸(3.10%)略高于对照组(2.80%),表明高分子质量黑精可以提高啤酒中有机酸的含量。随着啤酒色度的提升,啤酒DPPH自由基清除率提高,其中MW-H啤酒的DPPH自由基清除率为37.40%,显著高于对照组的27.04%。王瑶等[19]研究发现咖啡中不同分子质量类黑精均呈现较强清除DPPH自由基能力,可能是因为美拉德反应中形成的色素类物质提供氢与DPPH反应,还可能因为这些化合物以非共价键的形式连接在类黑精骨架上,分级之后小分子物质解离出来暴露更多的羟基,使得清除DPPH自由基的能力增强。这表明类黑精可以提高成品啤酒清除DPPH自由基的能力,有利于增加啤酒的风味稳定性[8]。

表2 添加不同分子质量组分类黑精对啤酒理化指标的影响Table 2 Effects of adding different molecular weight groups of melanoidins on physical and chemical characteristics of beer

2.3 类黑精对啤酒特征挥发性风味化合物的影响

气味作为啤酒重要的风味特征,由啤酒挥发性成分决定,高级醇和酯类是其中最重要的风味化合物[20]。麦汁主发酵结束,后发酵期在4 ℃冰箱放置4 d,发酵结束后对啤酒进行顶空进样气相色谱质谱联用检测发现主要为醇、酯。醇类包含正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇;酯类有乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯(表3)。

表3 添加不同分子质量组分类黑精啤酒中挥发性风味物质Table 3 Volatile flavor compounds of beer by adding different molecular weight groups of melanoidins

不同分子质量组分类黑精对啤酒风味物质含量有显著差异。MW-H和中分子质量类黑精组(MW-M)的总醇和总酯的含量均显著高于对照组(P<0.05)。正丙醇、异丁醇、异戊醇是啤酒中的主要高级醇,添加类黑精可以提高啤酒中正丙醇和异丁醇的含量,异戊醇的含量随类黑精的分子质量增加而降低。苯乙醇是芳香醇,具有玫瑰花香、先微苦后甜的桃子味[21],添加类黑精对苯乙醇含量具有显著提升。酵母的酯类生物合成由酵母先形成酯酰辅酶A,在酵母酯酶催化和醇化下形成酯,使啤酒的香味丰满协调。乙酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸苯乙酯属于乙酸酯,为啤酒带来果香、花香等愉悦气味。添加类黑精后,低分子类黑精组(MW-L)的乙酸酯含量低于对照组,而MW-M和MW-H的乙酸酯含量分别提升了2.8%和11.68%,其中MW-H显著提高这3种物质的合成,其含量与对照相比分别提高了14.62%,11.81%和14.70%。VERSTREPEN等[22]研究表明美拉德反应产物类黑精对酿酒酵母的乙醇乙酰基转移酶的酶活性具有积极影响,使乙醇乙酰基转移酶的编码基因ATF1和ATF2表达水平有所增加,提高了细胞内总异戊醇乙酰转移酶的活性,从而促进乙酸酯的生成。此外,添加类黑精的啤酒辛酸乙酯与癸酸乙酯的含量也均高于对照组。麦汁中添加美拉德反应产物类黑精可以改变啤酒的醇厚性,主要表现为提高啤酒的醇类和酯类物质的含量,对啤酒整体品质的提高有积极影响。

2.4 类黑精对啤酒有机酸的影响

通过高效液相色谱技术对啤酒中苹果酸、乳酸、乙酸、柠檬酸和丁酸等有机酸进行检测,结果如表4所示。4种成品啤酒中酵母产的总有机酸含量为2 635.03～3 337.10 μg/mL。对照组中的啤酒的有机酸含量显著低于添加类黑精的啤酒(P<0.05)。酵母在正常发酵过程中,酸类物质虽然不构成啤酒的香味,但它是主要的呈味物质,适量的酸能使啤酒协调、平衡、爽口,口感活泼[23]。由丙酮酸在乳酸脱氢酶催化下还原得到乳酸,MW-H的乳酸含量为376.40 μg/mL,显著高于对照组的97.83 μg/mL。添加美拉德反应产物类黑精使啤酒中苹果酸的含量也有所提高,按分子质量从低到高,其含量与对照组相比分别提高了3.82%、3.32%和7.53%。

表4 添加不同分子量组分类黑精啤酒中有机酸含量Table 4 Organic acid content of beer by adding different molecular weight groups of melanoidins

2.5 感官评价及相关性分析

对照组、MW-L、MW-M和MW-H啤酒的感官评价如图2所示,各组啤酒外观,泡沫性能、啤酒香气和酒体口味的得分差异显著(P<0.05),结合啤酒的常规理化指标和主要风味物质成分的结果进行分析,MW-H啤酒的色度最深,影响视觉感官,所以在外观上的得分较低;在泡沫性能方面,添加不同分子质量类黑精的啤酒得分均高于对照组,说明添加类黑精可以提高啤酒泡沫的泡持性[24];啤酒香气方面,添加不同分子质量类黑精,提高了啤酒中高级醇、酯含量从而增强了啤酒的香气,与对照组比差异性显著(P<0.05);在口感方面,MW-H啤酒的啤酒香味得分最高,但是后苦味和酸味也最大,这与MW-H的总酸含量最高保持一致,这是由于高分子质量类黑精赋予了啤酒香味的同时,也导致啤酒有焦苦味道。从感官雷达图可以看出,MW-H的优势在于啤酒香气最为浓郁,泡沫性能更好,但酸味和后苦味略高,这可能是类黑精添加量偏高,而MW-M的啤酒酸味和后苦味适中,外观和啤酒香气的整体评价更好。

啤酒的主要风味物质含量与感官得分的相关性如图3所示。

风味物质的含量与啤酒外观的相关性不大;苹果酸与啤酒的泡沫性能呈正显著相关(P<0.05)。正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、苹果酸、乳酸、乙酸和丁酸与啤酒的香气呈正相关。酒体口感中啤酒的香味与丁酸和柠檬酸呈负相关,与高级醇、酯呈正相关。啤酒的酸味与苹果酸、乳酸、乙酸、丁酸极相关,且呈正相关。异丁醇、异戊醇、苯乙醇、乙酸乙酯、乙酸异戊酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、癸酸乙酯、苹果酸、乳酸、乙酸、丁酸与后苦味呈较大相关性,其中与异戊醇、乙酸异戊酯呈负相关,而与辛酸乙酯和乙酸苯乙酯呈显著正相关(P<0.05)。

图3 挥发性风味物质与感官得分的相关性热图Fig.3 The heat map of correlation of volatile flavor substances and sensory evaluation scores注:“*”表示差异显著(P<0.05)

3 结论

添加类黑精可以促进酵母在对数生长期的生长繁殖,提高麦汁中还原糖和α-氨基氮的利用速率,其中高分子质量类黑精组(MW-H)的提升程度最大。对4种啤酒的常规理化指标进行检测,发现类黑精对啤酒的色度、总酸和DPPH自由基清除率有显著影响(P<0.05)。采用气相色谱-质谱联用分析对照组、MW-L、MW-M和MW-H的主要香气成分物质,从物质的含量上比较,相比于对照组,添加类黑精可以显著提高高级醇、酯和有机酸的含量,其中高分子质量的类黑精提升最多。对4种发酵啤酒进行感官评价,MW-H的啤酒香气和啤酒香味较好,而外观、后苦味和酸味得分较差,这可能是MW-H啤酒中赋予啤酒较高酯的含量,同时也由于自身的焦苦味较大影响了啤酒的口感。比较啤酒的感官评分和风味物质的相关性,啤酒中的风味物质高级醇、酯和有机酸与啤酒的香味呈正相关。因此在实验范围内,通过添加类黑精可以促进麦芽汁中酵母的生长和发酵速率,改善啤酒的香气品质,提高啤酒的感官质量。