二倍体苜蓿主要性状配合力及杂种优势分析

石如如， 石凤翎， 徐 舶

(内蒙古农业大学草原与资源环境学院/农业农村部饲草栽培、加工及高效利用重点实验室， 呼和浩特 010011)

苜蓿是世界上最重要的饲料作物之一，它是一种高产、优质的多年生豆科植物，有“牧草之王”的美誉[1]。但种质资源贫乏与遗传基础渐趋狭窄是制约我国苜蓿产业发展的瓶颈。因此，当务之急是培育一批国产苜蓿新品种，加大高产、优质、抗逆品种的推广力度。

目前，我国利用杂种优势得到多种具有优良性状的紫花苜蓿杂交品种[2]，如草原1号、草原2号、草原3号杂花苜蓿等。不同紫花苜蓿品种杂交，其F1代杂种能表现出一定的优势。Sakiroglu等[3]将抗寒性的秋眠紫花苜蓿与半秋眠紫花苜蓿杂交，发现杂种表现出产量的杂种优势。杂种优势利用的实质是配合力育种，而正确选择父母本是苜蓿育种成功的重要因素之一[4]。配合力是杂种优势利用中筛选强优势组合的主要因素，只有选育出高配合力的亲本，才能组配出强优势的杂交组合，因此了解亲本农艺性状的配合力将有助于更有效地选配优良亲本。随着DNA分子标记迅速发展，国内外学者在玉米[5]、水稻[6]、高粱[7]等作物中利用杂交亲本遗传距离来预测杂种优势，并阐明亲本遗传距离与子代杂种优势的相关关系[8]。关于苜蓿亲本主要农艺性状的配合力及与杂种优势之间的相关关系也有大量研究。陈海玲等[9]对8个苜蓿雄性不育系的配合力和遗传力进行分析，筛选出3个雄性不育系的一般配合力较好，可作优良亲本；薛晓兰等[10]对6个苜蓿雄性不育株系与7个苜蓿品种的配合力进行研究，证明分枝数和株高是影响苜蓿杂交组合牧草产量优势形成的主要性状;王虹等[11]对16个苜蓿优良株系组合杂种一代的产量和品质一般配合力的分析和评价，筛选出2个一般配合力高的株系与6个一般配合力中等的株系。杨青川等[12]对107个苜蓿耐盐单株的耐盐性一般配合力进行测定，再将配合力高的单株相互杂交，在两次选择的基础上再混合选择，得到了70个杂交后的耐盐苜蓿新材料。

为提高二倍体苜蓿强优势杂交组合的选育效率，在崔楠[13]、徐舶等[14]研究基础上，本研究以花药组织培养的同源四倍体苜蓿的单倍体与二倍体扁蓿豆进行杂交，使用SRAP标记检测亲本间的遗传距离，并进一步探索其与农艺性状配合力之间的关系，以期为苜蓿杂交育种中亲本选配及杂种优势预测提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验选用3份通过花药组织培养单倍体苜蓿材料，2份扁蓿豆材料(表1)，按照不完全双列杂交设计配制10个杂交组合(F1)。

表1 亲本材料名称及来源Table 1 Name and source of parent materials

1.2 试验方法

1.2.1试验设计

本研究选用的5个亲本、10个杂交组合材料于2019年在中国农业科学院草原研究所国家多年生牧草资源圃(位于内蒙古农业大学沙尔沁)试验基地种植。其中，小区面积3 m×6 m,株行距均为50 cm，单株育苗移栽。小区土壤肥力与管理措施保持一致，与一般大田相同。本试验于材料生长第二年的初花期测定亲本及其杂交组合第一茬单株地上生物量、株高、分枝数、节间长、节间数、中间小叶长和宽等表型性状，并计算各性状的配合力与杂种优势效应。

1.2.2SPAR标记

采用改良CTAB法提取各亲本基因组DNA。按照Li和Quiros[15]公布的SPAR标记上游引物和下游引物6个，共合成36对组合，从中筛选出多态性好，条带清晰的引物组合用于遗传距离的分析。PCR反应体系 (20 μL)为[16]：1 μL 的DNA模板约30 ng,2×TaqPCR MasterMix 10 μL,上游引物(10×)和下游引物(10×)各1 μL，ddH2O 7 μL。PCR 扩增反应程序：95 ℃预变性10 min，94 ℃变性1 min，35 ℃复性1 min,72 ℃延伸 1 min,5个循环；94 ℃变性 1 min，50 ℃复性1 min，72 ℃延伸 1 min，35个循环；72 ℃延伸 7 min， 4 ℃保存备用。产物于8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，电泳结束后用银染法显色。

1.3 数据处理与分析

采用SAS 9.0软件对田间数据进行统计分析；杂种优势以中亲杂种优势(H)表示：

H=[F1-(P1+P2)/2]/[ (P1+P2)/2]×100%

根据各引物扩增谱带的结果，建立0、1统计表(相同迁移位置上有带的记为1，无带的记为0)，然后利用NTsys 2.10 软件计算遗传距离。

2 结果与分析

2.1 亲本间的遗传距离分析

亲本间遗传距离分析结果如表2所示，遗传距离在0.089 7～0.662 1之间，遗传距离最大的组合是CY-35×ZB(0.662 1)，遗传距离最小的组合是CY-35×CY-5(0.089 7)。在各杂交组合中，共有6个杂交组合的遗传距离大于平均距离(0.429 0)，表明亲本间的遗传差异较大。

表2 亲本材料遗传距离Table 2 Genetic distances between the parental materials

表3 各性状的配合力方差分析Table 3 Variance analysis on combining ability of each trait

表4 5个亲本材料农艺性状GCA效应值Table 4 General combining ability values for agronomic traits in the 5 parental materials

2.2 配合力分析

2.2.1各性状配合力方差分析

对杂交组合间的株高、分枝数、单株产量等7个性状的配合力进行方差分析，结果(表3)表明，区组间除叶宽差异显著外(p>0.05)，其余性状区组间均无显著差异(p<0.05)，而组合间仅有节间数与叶长无显著差异(p<0.05)，其余性状均有显著差异(p>0.05)，表明5个亲本间存在遗传差异，可进行进一步配合力分析。

对亲本间的GCA以及杂交组合间的SCA方差分析表明，P1中的株高、单株产量的GCA达到了显著水平(p>0.05)，P2中节间数、节间长的GCA有显著水平(p>0.05)，P1×P2的SCA方差中仅有节间长达显著水平(p>0.05)。由此可见，节间长主要受P2的一般配合力和组合间的特殊配合力影响，说明该性状遗传主要受加性效应和非加性效应共同影响；而株高、节间数、单株产量主要受亲本的一般配合力影响，其遗传主要受加性效应影响。

2.2.2亲本的GCA效应分析

由表4可见，GCA在不同的性状间存在明显的差异，说明各个亲本在不同性状上受基因加性效应的影响水平不同。其中，XJ-3、CY-35和ZB株高与单株生物量效应值均为正值，CY-35的两个性状效应值最高，说明利用CY-35更容易配制出株高与产量均较高的杂交组合。 XJ-3和ZB节间长GCA 值为负值，其余均为正值。ZB节间数和叶长的GCA在5个亲本中较优，表明ZB不仅可以显著提高后代的节间数，同时在增加叶长方面具有显著的正向作用，是个优良的亲本。CY-5分枝数的GCA达0.95，为5个亲本中最大，说明利用CY-5中决定分枝数的基因加性效应最好，杂交后代中更容易选育出多分枝后代材料。各个亲本在7个性状上均有不同程度的加性效应，相同亲本不同性状的GCA效应值表现出的较大差异,说明各亲本各性状的加性效应作用程度不同。

2.2.3组合SCA效应分析

各杂交组合的SCA值均存在较大差异(表5)。10个杂交组合中，株高SCA效应值为正效应的组合有5个，其中较优的组合为CY-35×HB、CY-35×ZB、CY-5×XJ-3、XJ-3×CY-5；分枝数变幅为-1.28～0.40，具有正向SCA效应值的组合数4个，其中较优的组合为XJ-3×CY-5、CY-5×ZB，SCA效应值均在0.30以上；节间数与节间长SCA效应值为正值的有6个，节间数较高的组合为CY-35×XJ-3、CY-5×XJ-3，SCA效应值均在1.35以上；节间长较优的组合是CY-35×HB、CY-5×XJ-3，SCA效应值均在1.0以上；单株产量变幅为-0.05～0.04，具有正向SCA效应值的组合数5个，其中较高的组合是XJ-3×CY-5、CY-35×CY-5。叶长与叶宽SCA效应值均为正值的组合有CY-5×HB、CY-35×ZB。

表5 10个组合农艺性状SCA效应值Table 5 Special combining ability effect values of agronomic traits in 10 combinations

综合分析可看出，在10个杂交组合中，XJ-3×CY-5单株生物量GCA及株高、分枝数、节间数、叶宽的SCA均较高，表明XJ-3×CY-5为最优组合；其次是CY-35×HB和CY-5×XJ-3两个组合，株高GCA较高，其中CY-35×HB的分枝数、节间长、单株产量SCA较高，CY-5×XJ-3节间数、节间长，叶长SCA较高，且这些亲本的多个指标也具有较大的GCA值，表明上述杂交组合在对应性状上有较大突破潜力，可以作为优良组合加以利用。

2.3 杂种优势表现

10个杂交组合各性状的杂种优势差异较大(表6)，其中单株产量的杂种优势变异幅度最大，为-32.48%～81.93%，CY-35×HB组合在单株产量、节间长、叶长三个性状上杂种优势都表现最高。XJ-3×HB组合在株高上杂种优势最高，为45.63%；XJ-3×CY-5、CY-35×CY-5、CY-5×XJ-3组合在分枝数上杂种优势表现正向优势，其余组合都为负向优势；节间数除XJ-3×ZB、CY-35×CY-5组合表现为负向优势外，其余组合都为正向优势。组合XJ-3×CY-5、CY-35×XJ-3、CY-5×XJ-3有6个性状呈正向优势。

表6 苜蓿10个杂交组合杂种优势Table 6 Heterosis for each trait in 10 cross combinations of alfalfa单位：%

2.4 遗传距离与配合力、杂种优势的相关性

对苜蓿各性状杂种优势、配合力与亲本间遗传距离进行相关性分析(结果见表7)。在苜蓿7个性状中，单株地上生物量、叶长及叶宽的杂种优势与GCA呈显著相关，株高、节间数、节间长的杂种优势与SCA呈显著相关，相关系数达0.680以上。遗传距离仅与节间数的GCA呈显著的正相关，与其他性状的SCA、GCA均无显著的相关性，此外，遗传距离与叶宽的杂种优势呈显著的负相关(γ=-0.758)，与其他性状相关性不显著，这表明亲本间的遗传距离与配合力对后代的杂种优势并没有直接影响。

表7 各性状的遗传距离与配合力、杂种优势的相关性Table 7 Correlation of genetic distance for each trait with combining ability and hybrid advantage

3 讨 论

配合力分析是亲本组配杂交组合最有效的一种方法，被广泛应用于小麦、玉米[17]等作物。一般配合力主要由基因的加性效应决定，它是指某一亲本品种和其他若干品种杂交后，在某个数量性状上杂交后代所表现的平均值[18]。能够稳定遗传的材料，亲本性状一般配合力较高，性状向后代传递的能力也较强[19]。一般来说，特殊配合力较高的杂交组合，亲本的一般配合力效应值也较高，但陈小龙等[20]，Kimbeng等[21]研究认为，一般配合力与特殊配合力高无明显的对应关系。本研究表明，双亲具有较低的一般配合力所组配的杂交组合的特殊配合力也不一定低，而一般配合力高的亲本所组配杂交组合的特殊配合力不一定高；例如XJ-3和CY-5单株生物量的一般配合力很低，而XJ-3×CY-5组配的特殊配合力很高，CY-5与HB分枝数的一般配合力最高，而CY-5×HB特殊配合力却很低。本研究对苜蓿与扁蓿豆各组合的配合力进行方差分析，株高、节间数、单株地上生物量主要受加性基因控制，仅有节间长同时受加性基因和非加性基因共同影响。本研究还发现，杂交组合具有较高的特殊配合力，则至少有一个亲本的一般配合力较高，如株高组合CY-35×HB的特殊配合力为最高，亲本CY-35的一般配合力为亲本中最大，而HB一般配合力效应值较小。这与陈森等[22]、吴立东[23]的结论相同；因此在实际育种中，既要考虑亲本的一般配合力，同时也要重视组合的特殊配合力。同一亲本材料分别为父母本时在组合中的性状表现不同，如CY-5为父本时，参与组配杂交组合平均干草产量为253.5 g/株，杂种优势均表现为正向优势，组合XJ-3×CY-5分枝数的效应值为0.316 7，是正效应，而为母本时杂种优势表现为负向优势，CY-5×XJ-3分枝数的效应值为-0.350 0,是负效应，因此CY-5更适合作为父本材料。对于同一性状，同一父本与不同母本所组配的杂交组合的特殊配合力效应值也存在差异。比如XJ-3×HB株高的效应值为0.238 9，呈正效应，而CY-5×HB株高的效应值为-0.861 1，呈负效应。这与苑少华等[24]、宋旭东等[25]的结论相同。因此，配合力效应值必然会受到性状间的互作效应的影响，在杂交种组配上，要根据育种目标综合考虑所有重要性状，只有找到各平衡点时，才能确定最优杂交组合，这种根据亲本所具备的优缺点有针对性地进行组配组合，可以提高育种效率。

杂种优势是植物界中一种基本的生物学现象，它的基础是两个亲本间的遗传差异，其特征是在一定的范围内杂种的表现优于其父母本，而优势的大小取决于双亲的遗传差异和性状的互补，差异越大杂种优势越明显[26]。近年来，国内外学者利用SSR和SRAP分子标记等方法分析亲本间的遗传距离预测杂种优势，但结论均不一致。Lee等[27]和姚艳梅等[28]将分子标记技术研究玉米自交系和甘蓝型油菜等，众多类似例子发现遗传距离与杂种优势间存在相关性，然而SSR分子标记用于大豆遗传多样性的分析研究中，亲本间杂种优势相关程度难以预测[28]。刘宏伟等[29]利用RAPD分子标记技术对18个杂种小麦进行遗传差异分析，发现遗传距离不能预测杂种小麦的杂种优势；本研究结果表明，SRAP标记遗传距离除了叶宽外与其他性状均无相关性，这表明分子标记估算遗传距离具有一定的局限性，除了可以预测叶宽的杂种优势，其他性状的杂种优势都难以预测。乌云塔娜等[30]也得到了类似的结果，因此，如何提高分子标记技术在二倍体苜蓿杂种优势预测中的准确性仍是一个难题。同时，这也是未来苜蓿杂种优势研究的一个重要方向，有待开展。

4 结 论

杂交组合XJ-3×CY-5和CY-35×HB在多个指标性状上都表现为较高的SCA效应值，且其亲本的GCA值也较高，单株生物量杂种优势也较强，可作为优良杂交组合加以利用。结合配合力分析可知，杂交组合XJ-3×CY-5和CY-35×HB在各性状杂种优势上均表现较优，是后期杂交育种的首选组合。说明通过各性状配合力的分析及杂种优势的规律可以组配出强优势的杂交组合，但以SRAP遗传距离还不足以准确地预测杂种优势。