氮水平对雪菊幼苗中黄酮类化合物和矿质营养累积的影响

李志元，江虹，马艳，姜秀梅，张力方，梁志国，王泽鹏，唐亮，梁肖，秦勇*

（1.新疆农业大学园艺学院，乌鲁木齐 830052；2.新疆农业科学院农业机械化研究所，乌鲁木齐 830091）

雪菊（Coreopsis tinctoriaNutt.）起源于美国中西部地区，属于菊科金鸡菊属一年生草本植物，我国主产区在新疆和田地区。雪菊花中含有丰富的黄酮类化合物，具有抗癌、抗氧化、降三高等多种药理疗效[1]。研究证明，雪菊中的黄酮类物质含量远高于市售的其他菊花品种[2]，在花茶市场中显示出了特有的药用价值。因此，深入研究和改善雪菊中黄酮类物质积累的农业措施对雪菊产业的可持续发展以及促进人类健康具有重要意义。

黄酮类物质作为食品和传统药物的重要成分，在人体体内或体外系统中均具有较强的抗氧化能力，可减缓退行性疾病对人体的危害[3-5]，如槲皮素是常见的黄酮类化合物，它可以降低脂质过氧化、蛋白质羰基化和活性氧水平[6]；木犀草素可保护神经系统，改善记忆力，并通过抑制肿瘤细胞增殖、促进凋亡达到抗肿瘤作用[7]；芦丁具有降低血糖、尿糖和血脂等功效[8]。目前，关于改善雪菊中黄酮类物质积累的研究报道还十分有限。

环境因子能诱导植物中黄酮类化合物的生物合成和积累，一些植物中缺氮诱导了黄酮类物质显著增加，如菊花[9]、青钱柳[10]和拟南芥[11]。本课题组前期研究发现，低氮水平可诱导雪菊叶片（或茎）黄酮类化合物的积累，且其积累与苯丙氨酸解氨酶（phenylalnine ammonialyase，PAL）活性密切相关[12]。在药用植物、果蔬以及大田作物的栽培系统中，施氮肥可以促进生物量的增加，同时减少黄酮类、萜类物质等生理活性物质的生物合成和积累，从而影响产品质量和目标次生代谢产物的产生。在此过程中，植物体内矿质营养（包括磷、钾、钙、镁、铜、铁）的变化可能参与了黄酮类物质的积累，然而目前涉及两者相关性的研究尚未见报道。因此，本研究以采自和田地区克里阳乡的昆仑雪菊种子为材料，设置5个氮素处理水平并进行水培试验，在人工控制条件下，探讨雪菊幼苗黄酮类化合物的积累与氮素水平以及植株内部矿质营养积累的关系，为促进雪菊黄酮类化合物的积累以及建立雪菊最佳种植策略提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料和设计

试验在新疆农业科学院农业机械化研究所的连栋温室内进行。雪菊种子于2019年在新疆皮山县克里阳乡采集。首先对雪菊种子仔细筛选；然后采用Fang等[13]的方法利用外源赤霉素对种子进行处理。雪菊穴盘育苗的基质为蛭石与珍珠岩（2∶1）。

雪菊幼苗在穴盘培养25 d后，即幼苗长至4片真叶时，用海绵块包裹植株根系，定植于含有8 L营养液的培养箱中。定植7 d后进行氮素处理。设置5个氮素施用水平，分别为0（N1）、0.625（N2）、1.250（N3）、2.500（N4）和5.000（N5）mmol·L-1Ca(NO3)2。每个处理3次重复，每个重复30株，处理30 d后取样用于相关指标的测定。营养液成分包 括：160 mg·L-1Ca（NO3）2、408 mg·L-1KH2PO4、136 mg·L-1CaSO4、120 mg·L-1MgSO4、8.4 mg·L-1EDTA-Fe（乙 基 二 胺 四 乙 酸）、3.8 mg·L-1KCl、1.6 mg·L-1H3BO3、0.3 mg·L-1MnSO4、0.3 mg·L-1ZnSO4、0.1 mg·L-1CuSO4、0.1 mg·L-1Na2MoO4，并用NaOH或HCl将营养液pH调至7.0±0.1。培养期间，每隔2天用营养液对所散失的水分进行补充，每5天更换一次营养液；保持幼苗培养期间氧气泵24 h不间断工作，30 d后采收材料，光强设置为620μmol·m-2·s-1，光周期为12 h，昼夜温度分别为25和15℃，并保持幼苗在60%恒定相对湿度的条件下生长。

1.2 测定方法

1.2.1 植株碳和氮的测定 将样品（包括根、茎、叶）在70℃条件下完全干燥后磨成粉末，冷却至室温，取1 mg样品粉末置于锡罐（2 mm×5 mm）中采用元素分析仪（EA3000，意大利）测定幼苗总碳（carbon，C）和氮（nitrogen，N）含量，每个处理重复3次。

1.2.2 矿质元素的测定 使用原子吸收分光光度法测定磷（P）、钾（K）、钙（Ca）、镁（Mg）、铜（Cu）和铁（Fe）等矿质元素的含量[14]。首先称取样品粉末0.2 g置于消解管中，加入7 mL HNO3和HClO4（V∶V=2∶1）消化液进行消化，控制温度，使消煮液保持沸腾，当液体呈现透明且没有糊状时表示消煮完毕，之后将其冷却至常温。将消解后的溶液过滤至50 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，充分摇匀，待测。

1.2.3 株高和生物量的测定 在样品采收时测定幼苗的株高，同时对生物量进行分析。所有样品在70℃条件下干燥后称重。生物量为植株根、茎和叶的总干质量。

1.2.4 黄酮类物质测定 根据Liu等[9]的方法测定雪菊中总黄酮含量。将叶、根和茎的新鲜组织各0.5 g分别置于70%乙醇中35℃超声处理45 min，用比色法测定其含量；将1 mL溶液和5 mL去离子水加入到25 mL的试管中，在该反应混合物中加入1 mL 5%（质量体积分数）NaNO2，在室温下保持6 min；然后加入1 mL 10%（质量体积分数）AlCl3·6H2O，置于室温下再保持6 min；然后加入1 mL 1 mol·L-1NaOH，用去离子水将最终体积定容至25 mL。在512 nm处立即读取溶液的吸光度。

对根、茎、叶组织进行木犀草素、槲皮素、芦丁共3种黄酮类化合物单体的分析。取完全研磨样品1.0~2.0 g置于15 mL加入甲醇（80%）的棕色离心管中，振荡混合5 min，超声提取3 min，4 000 r·min-1离心15 min；将上清液转移到新的离心管中，重复提取2次；收集上清液，最后用5 mL 20%乙腈水溶解，振荡样品。上清液通过45μm过滤器过滤以供进一步分析。

采用Agilent-1200系列高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）系 统（美国加利福尼亚州安捷伦农业技术公司）进行分析，该系统配备了真空除气器、四元泵、自动进样器和二极管阵列检测器，并连接到Agilent化学站软件。在AgilentEclipsexdb-c18柱（4.6 mm×250 mm，I.D.3.5μm）分离，柱温保持在30℃。用0.2%甲酸（A）和乙腈（B）的梯度洗脱，以1 mL·min-1的流速分离分析物。梯度洗脱为：0~5 min，10~15%B；5~15 min，15~22%B；15~25 min，22~48%B；最后分别在260和320 nm处测定吸光度。采用木犀草素、槲皮素和芦丁（中国北京国家药物和生物制品控制研究所）标准品建立校准曲线。

1.2.5 酶活性测定 使用ELISA试剂盒测定PAL、肉 桂 酸 4-羟 化 酶（cinnamic acid 4-hydroxylase，C4H）、4-香豆酸辅酶A连接酶（4-coumaric acid CoA ligase，4CL）、查尔酮合成酶（chalcone synthase，CHS）、黄 烷 酮3-羟 化 酶（flavanone 3-hydroxylase，F3H）和类黄酮合成酶（flavonoid synthase，FLS）活性。用纯化的植物PAL（或C4H，4CL，CHS，F3H，FLS）抗体涂敷微滴板井，然后将PAL加入井中形成抗体抗原酶标记的抗体复合物。样品孔完全洗涤后，加入TMB底物溶液，37℃孵育15 min。然后用浓硫酸溶液终止反应，在450 nm处读取吸收值。

1.3 数据分析

采用Microsoft Excel 2019进行数据整理和分析，采用用SPSS21.0分析差异显著性。

2 结果与分析

2.1 不同氮素处理对雪菊幼苗碳和氮含量及碳/氮的影响

对幼苗根、茎、叶中碳、氮含量进行测定，计算碳/氮值，结果（表1）表明，随着氮素施用水平的增加，根、茎、叶中氮含量显著提高（P＜0.05），增幅分别为1.0%~1.9%、0.8%~1.5%和1.6%~2.6%；而根、茎、叶中碳含量相对稳定，除N5处理叶片碳含量显著降低，其余处理间均无显著差异。随着氮素施用水平的增加，根、茎、叶中氮含量的线性增加导致碳/氮比值显著下降（P＜0.05）。与N1处理相比，N5处理根、茎和叶中的碳/氮值分别下降了46.2%、49.4%、44.4%。

表1 不同氮素水平下雪菊幼苗根、茎和叶片中碳、氮含量及碳/氮比Table 1 Concentsof carbon，nitrogen and carbon/nitrogen in root，stalk and leaf of Coreopsistinctoria under different treatment

2.2 不同氮素处理对雪菊幼苗P、K、Ca、Mg、Cu、Fe含量的影响

在不同氮素处理下，幼苗根、茎和叶片中P、K、Ca、Mg、Cu、Fe含量如图1所示。不同氮素处理叶片中P含量为1 480.29~2 422.77 mg·kg-1；茎和根中P含量分别为1 087.82~1 873.60和1 619.95~3 008.64 mg·kg-1。随着氮素施用水平的升高，不同器官的P含量均呈显著下降趋势（P＜0.05），N1处理的P含量均高于其他处理。叶片和茎的K含量分别为5 972.60~10 864.15 mg·kg-1和5 212.78~7 170.78 mg·kg-1，且呈现出与P含量类似的变化规律；而根中K含量随氮素施用水平的增加而提高，N1、N2和N3处理根中K含量显著低于N4和N5处理（P＜0.05）。此外，根、茎、叶中Ca、Mg、Cu、Fe含量基本呈现为低水平氮抑制、高水平氮促进的变化趋势。根、茎、叶中Ca含量为1 084.78~7 130.86 mg·kg-1，平均2 828.44 mg·kg-1；Mg含量为596.16~1 347.41 mg·kg-1，平均915.73 mg·kg-1；积累量最低的Cu含量为34.05~85.51 mg·kg-1，平均57.56 mg·kg-1；根、茎、叶中Fe含量为318.32~708.15 mg·kg-1，平均492.86 mg·kg-1。

图1 不同氮素水平下雪菊各器官的P、K、Ca、Mg、Cu和Fe含量Fig.1 Contents of P，K，Ca，Mg，Cu and Fe in different organs of Coreopsistinctoria under different treatments

2.3 不同氮素处理对雪菊幼苗株高和总生物量的影响

对不同处理各器官的生物量进行分析，结果（图2）表明，N4处理的根干质量显著高于其他处理；N3和N4处理的茎干质量显著高于N1和N5处理；N2、N3和N4处理的叶干质量显著高于N1和N5处理；N3和N4处理的植株总干质量显著高于N1和N5处理。随着氮素施用水平的升高，株高呈先升后降的趋势，N4处理株高最高，为20.95 cm；N5处理的株高最低，为17.67 cm，较N4处理减少15.85%。

图2 不同氮素水平下雪菊的干质量和株高Fig.2 Dry weight and plant height of Coreopsistinctoria under different treatments

2.4 不同氮素处理对雪菊幼苗类黄酮含量的影响

由表2可知，在不同氮素水平下，茎和根中总黄酮积累量相对稳定，变幅分别为2.72~2.90和5.52~5.84 mg·g-1；而叶中总黄酮类积累量则表现出不同的变化，即低、中氮水平(N1、N2和N3处理)的总黄酮积累量较高，高氮水平（N4和N5处理）总黄酮积累量较低，其中，N3处理叶片总黄酮含量为16.23 mg·g-1，较N5处理增加26.6%。分别对木犀草素、槲皮素和芦丁在不同器官中的积累量进行分析，结果（表2）表明，芦丁的平均积累量较高，为1.32 mg·g-1，其次是木犀草素（0.24 mg·g-1），槲皮素含量较低，为0.16 mg·g-1。不同器官进行比较，叶中黄酮类物质积累量较高，而根中较低。

表2 不同氮素水平下雪菊各器官类中黄酮物质含量Table 2 Contents of flavonoids in different organsof Coreopsistinctoria under different treatments

由表3可知，木犀草素积累量和P含量呈显著正相关；K含量与黄酮类物质积累量呈显著正相关；Ca、Fe、Cu含量均与黄酮类物质积累量呈显著负相关；Mg含量和木犀草素积累量呈显著负相关。

表3 黄酮类化合物含量与矿质元素的相关性分析Table 3 Correlations between flavonoids content and mineral element

2.5 不同氮素处理对雪菊幼苗黄酮类物质代谢关键酶活性的影响

氮素水平对不同器官黄酮类化合物的关键酶活性有显著影响（图3）。在低、中氮水平（N1、N2和N3处理）下，叶中PAL、C4H、4CL和CHS的活性较高，显著高于高氮水平（N4和N5处理）。N4处理中F3H和FLS活性较高，显著高于低、中氮水平（N1、N2和N3处理）。根和茎中C4H、4CL、CHS和F3H在N4和N5处理中的活性显著高于其他处理；而PAL在N3处理中的活性显著高于其他处理，FLS在N4处理中的活性显著高于其他处理。

图3 不同氮素水平下雪菊各器官中类黄酮关键酶的活性Fig.3 Activities of key enzymes on flavonoids in different organs of Coreopsistinctoria under different treatments

3 讨论

3.1 氮素水平对黄酮类物质积累的影响

近年来，天然抗氧化剂，特别是来自于植物中的黄酮类化合物，因其在治疗退行性疾病中的独特疗效引起人们的广泛关注。黄酮类化合物的积累易受环境因素影响，如温度[15]、光照[16]和矿质元素[17]等。雪菊是新疆地区广泛栽培的药用植物，且被广泛应用于食品和医药领域。然而，关于氮素水平对雪菊黄酮类化合物积累量和产量影响的研究十分有限。本研究表明，随着氮素施用水平的增加，雪菊茎和根中黄酮类化合物积累量未发生显著性变化，但在低、中氮水平下，叶中黄酮类化合物积累量显著高于高氮水平，此研究结果进一步证实了高氮水平会抑制植物黄酮类物质的积累[18]。

碳和氮代谢是涉及植物次生代谢的基础代谢。与青钱柳[19]、甘蓝[20]、烟草[21]等植物的研究结果一致，施用氮肥同样使雪菊的碳氮平衡发生改变。植物内部碳/氮平衡的改变会进一步影响植物的生长发育，包括参与氮同化的相关基因的表达以及次生代谢物质的生物合成等。研究发现，氮素缺乏会影响植物生长和防御之间的碳分配[19]。当植物的生长量下降时，植物中用于防御的化合物（如类黄酮）会得到大量积累。在烟草中，氮消耗可以增加其叶片中氨基酸和碳水化合物含量，并进一步抑制光合作用。由此可见，氮在初级代谢和次级代谢中发挥重要作用，通过改变植物所需的碳资源，进而影响碳氮平衡，而这种平衡的改变具体表现在氮同化[11]、代谢物积累[22]及形态发育[10]等方面。本研究中,不同氮素水平下雪菊黄酮类物质积累量和产量的变化趋势进一步验证了这一观点。叶中总黄酮、木犀草素、槲皮素和芦丁的产量分别为46.41~62.32、0.64~0.89、0.57~0.96和5.28~6.69 mg·g-1；叶中总黄酮和3种单体类黄酮物质的产量均以低、中氮水平时较高，而高氮水平时产量较低；单株黄酮类物质积累的变化趋势与叶中变化规律一致，与产量最低的N5处理相比，总黄酮、木犀草素、槲皮素和芦丁的平均产量分别增加了34.3%、39.4%、68.5%和26.8%；且与幼苗株高状态相对应，即氮素含量过高会抑制植株的生长。以上结果进一步验证了生长分化假说，即当植物处于营养缺乏的环境时，其生长受到营养的限制，光合作用较低，更多的同化物会优先供应给次生代谢，而不是生长；相反，在高氮素水平下，更多同化物会优先分配给生长，而不是分化[23]。

不同器官中黄酮类物质的积累存在差异。雪菊根和茎中黄酮类物质的积累受氮素水平影响较小；而叶中黄酮类物质在低、中氮水平下积累量较多。可能是由于叶片是植物主要的光合器官，因此，也是黄酮类物质合成的主要部位，它们能够通过维管束组织从合成部位长距离运输到远距组织（根尖）[24-25]。

植物在响应环境胁迫后，黄酮类物质的积累受苯丙烷代谢途径的调控，包括营养胁迫、光照胁迫和真菌感染等[26]，因此，不同氮素处理会影响雪菊黄酮类物质生物合成中关键酶的活性。Liu等[9]研究表明，高氮素水平会抑制菊花叶片PAL活性，并抑制黄酮类化合物的积累。本研究也表明，低、中氮水平下PAL活性显著高于高氮水平；且C4H、4CL和CHS均在低、中氮水平下活性较高，与黄酮类物质的变化趋势相一致。由此说明，位于黄酮类化合物合成途径上游的基因可能对黄酮类物质积累起主要调控作用。此外，研究表明，黄酮类物质含量的增加通常伴随着碳水化合物的累积[27]，可能是编码PAL、C4H、4CL和CHS的基因受碳水化合物调控，最终促进了黄酮类物质的积累，与生菜中的研究结果相似[28]。氮素对雪菊碳氮平衡和黄酮类化合物的积累起一定的调控作用，但其调控机理有待进一步研究。

3.2 氮素水平对矿质营养平衡的影响

矿质元素是植物生长不可或缺的重要成分，例如，缺P或K会影响植物光合作用[29-30]，高Cu不利于酚类化合物的积累[31]。本研究表明，氮素对雪菊幼苗的矿质元素含量影响显著。在植物生长发育过程中，不同矿质元素间存在协同或拮抗作用，其中，N的积累会抑制P或K的吸收。研究发现，缺P可激活黄酮类生物合成基因的表达[32]；且在缺P条件下，烟草中黄酮醇积累量增加[33]。本研究表明，雪菊中木犀草素积累量和P含量呈显著正相关，说明N和P间的相互作用对雪菊中黄酮类物质的积累有一定影响。Liu等[30]研究发现，高K有利于促进菊花叶片中黄酮类化合物的积累，与本研究结果一致。缺K使叶片中碳水化合物（蔗糖）的转运受到限制，导致叶片中可溶性糖大量累积；而植物体内碳水化合物富余时，有利于将更多的能量用于黄酮类物质的合成[34]。综上所述，雪菊黄酮类物质的积累受氮水平以及植物内部矿质营养平衡的影响，较低的氮水平有利于雪菊叶片中黄酮类物质的积累。