甲基转移酶SETDB1在口腔癌中的表达及临床意义

2022-11-28 10:57郝妍白相宇霍峰陈喜波
实用口腔医学杂志 2022年6期
关键词:口腔癌基转移酶免疫组化

郝妍 白相宇 霍峰 陈喜波

口腔癌是我国的一种高发癌症,其发病率和死亡率逐年增加,对于患者的健康具有严重影响[1]。口腔癌经过综合治疗后患者的生存期有所提高,但是总体预后依旧较差[2]。SET结构域分支型1(SET domain bifurcated1,SETDBl)是赖氨酸甲基转移酶SUV39家庭中重要一员,参与基因的甲基化修饰,与多种肿瘤密切相关[3-9]。但是SETDB1在口腔癌发生发展中作用的相关研究却鲜有文献报道。本文通过检测SETDB1在口腔癌中的表达并探讨其与临床病理特征的相关性,以期探讨其在口腔癌的发生、发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源

纳入2019 年1 月~2021 年1 月于承德医学院附属医院口腔外科手术切除的口腔鳞癌及癌旁组织47 例,术前均未接受过任何治疗;取癌组织为实验组,癌旁正常口腔黏膜组织为对照组。47 例患者中(男36 例,女11 例);≥60 岁42 例,<60 岁5 例;TNM分期:I期18 例,Ⅱ期18 例,Ⅲ期11 例;高分化10 例,中分化32 例,低分化5 例;有淋巴结转移9 例,无淋巴结转移38 例。本研究涉及人体组织标本经医院伦理委员会批准通过。

1.2 主要试剂

SETDBl单克隆抗体(Abcam公司,英国);DNA提取试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司);免疫组化SP试剂盒、浓缩型DAB试剂(沈阳万类生物科技有限公司);RNA引物(上海博湖生物科技有限公司设计)。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

RNA提取试剂盒提取组织总RNA。取300 ng RNA,应用反转录试剂盒进行反转录。应用SYBR®Green qPCR Master荧光定量试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)检测PCAF、KAT5及P300/CBP mRNA的表达,相对表达量为2-ΔΔCt。

1.3.2 免疫组织化学染色SP法 石蜡切片脱蜡,3%甲醇-H2O2溶液及枸橼酸钠缓冲液加热处理组织切片、山羊血清封闭后,I抗温育(SETDB1单克隆抗体,1∶1 000),II抗温育,中间 PBS洗涤,DAB显色,苏木素染色,酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.3.3 Western blot 提取总蛋白,测定蛋白浓度;制备电泳蛋白上样液,行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后,转膜,加I抗4 ℃过夜(SETDB1单克隆抗体,1∶1 000;GAPDH抗体1∶2 000);次日孵育II抗,重复洗膜3 次后显影。

1.3.4 免疫组化结果评分标准 根据切片染色程度和着色阳性细胞所占百分率进行评价计分(每张切片高倍镜下随机观察10 个视野);染色强度评分标准(A):无色(0 分),淡黄色 (1 分),棕黄色(2 分),棕褐色(3 分)。着色阳性细胞所占百分率评分标准(B):<10%为1 分,10%~50%为2 分,50%~75%为3 分,>75%为4 分。以A+B所得分数作为评判标准:0~2分为阴性,≥3分为阳性。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 口腔癌和癌旁组织中SETDB1 mRNA的相对表达

qRT-PCR结果显示口腔癌组织中SETDB1 mRNA相对表达量(3.54±0.12)显著高于癌旁组织(0.42±0.07)(P<0.05)。

2.2 口腔癌组织和癌旁组织中SETDB1蛋白的表达

免疫组化结果显示,口腔癌组织中SETDB1阳性表达率为 87.23%(41/47),癌旁组织阳性表达率仅为17.02%(8/47)(P<0. 05)(表 1,图 1)。Western blot实验结果显示,口腔癌组织中SETDB1的蛋白表达量为(72.36±3.46)%,癌旁组织为(14.53±1.76)%(P<0. 05)(图 2)。

表 1 口腔癌组织和癌旁组织SETDB1蛋白表达

图 1 口腔癌和癌旁组织中SETDB1蛋白表达 (SP, ×200)

图 2 口腔癌和癌旁组织中SETDB1蛋白表达 (Western blot)

2.3 口腔癌组织中SETDB1表达与临床病理特征的相关性

SETDB1阳性与口腔癌TNM分期、组织分化及淋巴结转移相关(P<0.05),与性别、年龄与否无关(P>0.05)(表 2)。

表 2 口腔癌组织中SETDB1表达和临床病理特征的关系

3 讨 论

口腔癌是全世界范围内第六大常见的癌症,也是我国一种常见的头颈部恶性肿瘤,严重影响人民群众的生命健康[10-12]。在恶性肿瘤的发生发展过程中,基因功能紊乱可以引起癌基因的激活和抑癌基因的失活[13-14]。多种不良因素均可引起口腔黏膜基因变异,导致调控失常,从而引起口腔癌的发生与发展。因此,从基因分子水平探究诊治口腔癌已成为本领域的研究热点。

研究表明,赖氨酸甲基转移酶与多种肿瘤的形成有关,甲基转移酶活性缺失或失调可能是导致肿瘤发生的原因[15]。SETDB1是赖氨酸甲基转移酶SUV39家族中重要一员,可以催化组蛋白3第9位点的赖氨酸残基发生甲基化[16]。近年来的研究发现, SETDB1在多种恶性肿瘤中均呈现高表达转态,且与肿瘤的恶性程度和转移程度密切相关[17]。Xiao等[18]通过生物信息学分析及系列实验发现在乳腺癌中SETDB1显著扩增并高度表达且下调SETDB1基因能够显著抑制乳腺癌细胞的生物学功能。进一步研究显示,SETDB1编码的mRNA 3′UTR区与MiR-7存在部分互补, 过表达MiR-7会下调SETDB1, 同时上调c-MYC和cyclin D1,并通过抑制STAT3信号通路, 逆转乳腺癌细胞的转移途径[19]。

SETDB1可以作为组蛋白甲基转移酶通过与TIAM1相互作用促进肝癌细胞的增殖和迁移[20],同时在结直肠癌中,SETDB1可能促进 Wnt/β-catenin 信号通路激活,促进结直肠癌EMT进程,进而促进结直肠癌发生[21]。早期非小细胞肺癌组织中SETDB1呈高表达状态, 与肺癌的病理学特征具有强相关性[22]。在肺癌组织中SETDB1呈现高表达状态,且与肺癌的增殖、侵袭和转移相关;体外干扰下调SETDB1可以抑制肺癌细胞生物学功能,且抑制裸鼠模型中的肺肿瘤生长,而过表SETDB1则可以增加肺癌细胞的侵袭性[23]。但其他研究者发现,在非小细胞癌中,SETDB1可以通过调控c-MYC表达而激活Wnt/β-caterin信号通路,进而增强IRES介导与翻译, 这表明SETDB1增强IRES介导的翻译可能具有癌症特异性[24]。董红玲[25]研究发现卵巢癌中SETDBl表达水平异常升高,并与患者不良预后密切相关,SETDBl对卵巢癌患者具有一定的预后评价作用。

目前,SETDBl在口腔癌中的表达情况及临床意义尚未见相关报道。本研究发现,口腔癌组织中SETDB1 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常口腔黏膜组织;进一步通过免疫组化和Western blot证实癌组织中SETDB1蛋白水平亦呈显著增高,并与肿瘤分期、组织分化和淋巴结转移临床病理特征密切相关。SETDB1在口腔癌Ⅰ期的阳性表达低于Ⅱ期和Ⅲ期,而Ⅱ期的阳性表达率低于Ⅲ期,即随着口腔癌TNM分期的增加SETDB1阳性表达也逐渐增加,说明SETDB1可能与口腔癌的恶性程度具有密切的相关性。随着口腔癌分化程度的降低,SETDB1蛋白的阳性表达却随之增加,同时有淋巴结转移同无淋巴结转移相比具有明显差异性,淋巴结转移中SETDB1蛋白的阳性表达显著升高,说明SETDB1的阳性高表达可能促进了口腔癌的恶性转化,或抑制了口腔癌细胞自身的凋亡过程,使得口腔癌恶性程度增强,导致其发生淋巴结转移。因而,本研究推断口腔癌中SETDB1的高表达抑制了癌细胞凋亡,促进口腔癌细胞无限制生长及肿瘤的恶性转化,导致了其局部浸润和远处迁移,最终导致患者的生存期下降。同时也说明SETDBl参与了口腔癌的发生和发展,是一种重要的促癌蛋白,在促进肿瘤转移等方面具有重要作用。

综上所述,SETDBl在口腔癌中高表达以及诊断具有一定的潜在价值。随着分子生物学的发展,深入探讨SETDBl与口腔癌发生发展、侵袭、转移及预后的关系,对口腔癌的早期诊断及预后判断提供分子生物学指标意义重大。

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