甲基转移酶SETDB1在口腔癌中的表达及临床意义

郝妍 白相宇 霍峰 陈喜波

口腔癌是我国的一种高发癌症，其发病率和死亡率逐年增加，对于患者的健康具有严重影响[1]。口腔癌经过综合治疗后患者的生存期有所提高，但是总体预后依旧较差[2]。SET结构域分支型1(SET domain bifurcated1，SETDBl)是赖氨酸甲基转移酶SUV39家庭中重要一员，参与基因的甲基化修饰，与多种肿瘤密切相关[3-9]。但是SETDB1在口腔癌发生发展中作用的相关研究却鲜有文献报道。本文通过检测SETDB1在口腔癌中的表达并探讨其与临床病理特征的相关性，以期探讨其在口腔癌的发生、发展中的作用机制。

1 资料与方法

1.1 标本来源

纳入2019 年1 月～2021 年1 月于承德医学院附属医院口腔外科手术切除的口腔鳞癌及癌旁组织47 例，术前均未接受过任何治疗；取癌组织为实验组，癌旁正常口腔黏膜组织为对照组。47 例患者中(男36 例，女11 例)；≥60 岁42 例，<60 岁5 例；TNM分期：I期18 例，Ⅱ期18 例，Ⅲ期11 例；高分化10 例，中分化32 例，低分化5 例;有淋巴结转移9 例，无淋巴结转移38 例。本研究涉及人体组织标本经医院伦理委员会批准通过。

1.2 主要试剂

SETDBl单克隆抗体(Abcam公司，英国)；DNA提取试剂盒(北京伊塔生物科技有限公司)；免疫组化SP试剂盒、浓缩型DAB试剂(沈阳万类生物科技有限公司)；RNA引物(上海博湖生物科技有限公司设计)。

1.3 实验方法

1.3.1 实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)

RNA提取试剂盒提取组织总RNA。取300 ng RNA，应用反转录试剂盒进行反转录。应用SYBR®Green qPCR Master荧光定量试剂盒(广州锐博生物科技有限公司)检测PCAF、KAT5及P300/CBP mRNA的表达，相对表达量为2-ΔΔCt。

1.3.2 免疫组织化学染色SP法 石蜡切片脱蜡，3%甲醇-H2O2溶液及枸橼酸钠缓冲液加热处理组织切片、山羊血清封闭后，I抗温育(SETDB1单克隆抗体，1∶1 000)，II抗温育，中间 PBS洗涤,DAB显色，苏木素染色，酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

1.3.3 Western blot 提取总蛋白，测定蛋白浓度；制备电泳蛋白上样液，行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。电泳后，转膜，加I抗4 ℃过夜(SETDB1单克隆抗体，1∶1 000；GAPDH抗体1∶2 000)；次日孵育II抗，重复洗膜3 次后显影。

1.3.4 免疫组化结果评分标准 根据切片染色程度和着色阳性细胞所占百分率进行评价计分(每张切片高倍镜下随机观察10 个视野)；染色强度评分标准(A)：无色(0 分)，淡黄色 (1 分)，棕黄色(2 分)，棕褐色(3 分)。着色阳性细胞所占百分率评分标准(B)：<10%为1 分，10%～50%为2 分，50%～75%为3 分，>75%为4 分。以A+B所得分数作为评判标准：0～2分为阴性，≥3分为阳性。

1.4 统计学分析

2 结 果

2.1 口腔癌和癌旁组织中SETDB1 mRNA的相对表达

qRT-PCR结果显示口腔癌组织中SETDB1 mRNA相对表达量(3.54±0.12)显著高于癌旁组织(0.42±0.07)(P<0.05)。

2.2 口腔癌组织和癌旁组织中SETDB1蛋白的表达

免疫组化结果显示，口腔癌组织中SETDB1阳性表达率为 87.23%(41/47)，癌旁组织阳性表达率仅为17.02%(8/47)(P<0. 05)(表 1，图 1)。Western blot实验结果显示，口腔癌组织中SETDB1的蛋白表达量为(72.36±3.46)%，癌旁组织为(14.53±1.76)%(P<0. 05)(图 2)。

表 1 口腔癌组织和癌旁组织SETDB1蛋白表达

图 1 口腔癌和癌旁组织中SETDB1蛋白表达 (SP, ×200)

图 2 口腔癌和癌旁组织中SETDB1蛋白表达 (Western blot)

2.3 口腔癌组织中SETDB1表达与临床病理特征的相关性

SETDB1阳性与口腔癌TNM分期、组织分化及淋巴结转移相关(P<0.05)，与性别、年龄与否无关(P>0.05)(表 2)。

表 2 口腔癌组织中SETDB1表达和临床病理特征的关系

3 讨 论

口腔癌是全世界范围内第六大常见的癌症，也是我国一种常见的头颈部恶性肿瘤，严重影响人民群众的生命健康[10-12]。在恶性肿瘤的发生发展过程中，基因功能紊乱可以引起癌基因的激活和抑癌基因的失活[13-14]。多种不良因素均可引起口腔黏膜基因变异，导致调控失常，从而引起口腔癌的发生与发展。因此，从基因分子水平探究诊治口腔癌已成为本领域的研究热点。

研究表明，赖氨酸甲基转移酶与多种肿瘤的形成有关，甲基转移酶活性缺失或失调可能是导致肿瘤发生的原因[15]。SETDB1是赖氨酸甲基转移酶SUV39家族中重要一员，可以催化组蛋白3第9位点的赖氨酸残基发生甲基化[16]。近年来的研究发现, SETDB1在多种恶性肿瘤中均呈现高表达转态，且与肿瘤的恶性程度和转移程度密切相关[17]。Xiao等[18]通过生物信息学分析及系列实验发现在乳腺癌中SETDB1显著扩增并高度表达且下调SETDB1基因能够显著抑制乳腺癌细胞的生物学功能。进一步研究显示，SETDB1编码的mRNA 3′UTR区与MiR-7存在部分互补, 过表达MiR-7会下调SETDB1, 同时上调c-MYC和cyclin D1，并通过抑制STAT3信号通路, 逆转乳腺癌细胞的转移途径[19]。

SETDB1可以作为组蛋白甲基转移酶通过与TIAM1相互作用促进肝癌细胞的增殖和迁移[20]，同时在结直肠癌中，SETDB1可能促进 Wnt/β-catenin 信号通路激活，促进结直肠癌EMT进程，进而促进结直肠癌发生[21]。早期非小细胞肺癌组织中SETDB1呈高表达状态, 与肺癌的病理学特征具有强相关性[22]。在肺癌组织中SETDB1呈现高表达状态，且与肺癌的增殖、侵袭和转移相关；体外干扰下调SETDB1可以抑制肺癌细胞生物学功能，且抑制裸鼠模型中的肺肿瘤生长，而过表SETDB1则可以增加肺癌细胞的侵袭性[23]。但其他研究者发现，在非小细胞癌中，SETDB1可以通过调控c-MYC表达而激活Wnt/β-caterin信号通路，进而增强IRES介导与翻译， 这表明SETDB1增强IRES介导的翻译可能具有癌症特异性[24]。董红玲[25]研究发现卵巢癌中SETDBl表达水平异常升高，并与患者不良预后密切相关，SETDBl对卵巢癌患者具有一定的预后评价作用。

目前，SETDBl在口腔癌中的表达情况及临床意义尚未见相关报道。本研究发现，口腔癌组织中SETDB1 mRNA相对表达量明显高于癌旁正常口腔黏膜组织；进一步通过免疫组化和Western blot证实癌组织中SETDB1蛋白水平亦呈显著增高，并与肿瘤分期、组织分化和淋巴结转移临床病理特征密切相关。SETDB1在口腔癌Ⅰ期的阳性表达低于Ⅱ期和Ⅲ期，而Ⅱ期的阳性表达率低于Ⅲ期，即随着口腔癌TNM分期的增加SETDB1阳性表达也逐渐增加，说明SETDB1可能与口腔癌的恶性程度具有密切的相关性。随着口腔癌分化程度的降低，SETDB1蛋白的阳性表达却随之增加，同时有淋巴结转移同无淋巴结转移相比具有明显差异性，淋巴结转移中SETDB1蛋白的阳性表达显著升高，说明SETDB1的阳性高表达可能促进了口腔癌的恶性转化，或抑制了口腔癌细胞自身的凋亡过程，使得口腔癌恶性程度增强，导致其发生淋巴结转移。因而，本研究推断口腔癌中SETDB1的高表达抑制了癌细胞凋亡，促进口腔癌细胞无限制生长及肿瘤的恶性转化，导致了其局部浸润和远处迁移，最终导致患者的生存期下降。同时也说明SETDBl参与了口腔癌的发生和发展，是一种重要的促癌蛋白，在促进肿瘤转移等方面具有重要作用。

综上所述，SETDBl在口腔癌中高表达以及诊断具有一定的潜在价值。随着分子生物学的发展，深入探讨SETDBl与口腔癌发生发展、侵袭、转移及预后的关系，对口腔癌的早期诊断及预后判断提供分子生物学指标意义重大。