三氯生对峨眉林蛙蝌蚪的毒性效应研究

李馨雨，魏顺鑫，张雨娟，钟栎，夏雪梅，冯俊宁，刘琦，袁洁，陈凤仪，唐家兴，陈贵英

（四川师范大学生命科学学院，成都610101）

据不完全统计，三氯生（TCS）作为一种广谱抗菌剂，全球年产量约1 500 t，被大量添加于个人护理品（香皂、牙膏、除臭剂等）、纺织纤维（玩具、内衣等）中（Daughton，1999），因具有较强的疏水性和脂溶性，在环境中难以挥发降解（梁丽萍等，2021）。TCS 主要通过生活污水排放进入环境，现有污水处理工艺不能将其完全去除（Chenet al.，2014），近年来在湖底沉积物（Wuet al.，2015）、地表水（Yavuzet al.，2015）、污水（Zhouet al.，2015）中被频繁检测到，如表层水体中的质量浓度高达478 ng·L−1，沉积物中的高达 2 723 ng·L−1（Zhaoet al.，2013）。早在 2011 年我国 TCS 排放量就达到了66.1 （t张芊芊，2015）。水生生物是TCS 的主要作用对象（杨雅淇等，2019），TCS 对水生生物的毒性比其对细菌的毒性大100~1 000 倍（Chalew &Halden，2009），对水生生物个体以及在分子水平上都有毒害作用（郑欣等，2016）。南美牛蛙Leptodac⁃tylus pentadactylus蝌蚪在 0.15 µg·L−1TCS 中饲养18 d 后，T3 调控的发育变形过程受到干扰（Binelliet al.，2009）；斑马鱼Danio rerio胚胎在0.5 mg·L−1TCS中培养6 d 后的孵化时间显著延迟（Oliveiraet al.，2009）；太平洋树蛙Pseudacris regilla幼体在30 µg·L−1TCS 中饲养7 d 后，体长和体质量发育均受到抑制（Marlattet al.，2013）。据统计，全球约有60%以上的两栖动物正遭受灭绝的威胁（麦春兰，2021）。

两栖动物幼体在水中发育至完全变态，期间主要摄食浮游动植物，依靠皮肤和鳃呼吸，对水环境变化十分敏感，能够在短时间内通过其形态、行为等对水环境变化做出响应，从而成为研究水污染的重要模式生物。峨眉山地处四川盆地西南部，为亚热带季风气候，是中国重要的生物资源库，动物资源丰富，两栖动物种类繁多（孙子健，2021）。峨眉林蛙Rana omeimontis属两栖纲Am‑phibian 无尾目 Anura 蛙科 Ranidae 林蛙属Rana，广泛分布于峨眉山报国寺、清音阁农家附近的浅水域中，其蝌蚪在水中发育至完全变态需要8个月左右，易受到农家排出的含有TCS 生活污水的影响。目前TCS影响峨眉林蛙蝌蚪的研究鲜见报道，本研究以峨眉林蛙蝌蚪（G22 期）为实验对象，研究了TCS对蝌蚪的急性毒性和慢性毒性效应，以期为当地水资源的治理及保护提供基础数据。

1 材料与方法

1.1 受试生物与材料

峨眉林蛙受精卵于2020 年10 月17 日采自峨眉山报国寺旁的溪流中。TCS 购自Sigma 公司，纯度99.99%。无水乙醇购自成都市科隆化学品有限公司。

1.2 方法

峨眉林蛙受精卵于室温（20 ℃±1 ℃）下在曝气3 d 的自来水中培育至孵出。待卵黄吸收完全之后，利用鸡蛋黄喂食3 d，然后以0.05 g/10只蝌蚪的比例喂食螺旋藻，期间昼夜交替光照12 h。

实验用水采用曝气3 d 的自来水。实验期间利用螺旋藻悬液喂食蝌蚪。实验前将TCS 用无水乙醇配置成 5 mg·mL−1TCS 母液，4 ℃保存备用。使用时按照目标浓度将TCS 母液加入500 mL 自来水中。

1.2.1 急性毒性实验室温（20 ℃±1 ℃）下，采用半静态换水法进行预实验，根据致死浓度和零死亡浓度，结合等间距原则将TCS 设置为13个浓度处理组（150 µg·L−1、200 µg·L−1、250 µg·L−1、300 µg·L−1、350 µg·L−1、400 µg·L−1、450 µg·L−1、500 µg·L−1、550 µg·L−1、600 µg·L−1、650 µg·L−1、700 µg·L−1和750 µg·L−1），另设空白对照组与乙醇对照组，乙醇对照组的乙醇浓度与750 µg·L−1相当，每组3 个平行。实验开始时随机投入15 只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL 实验液中，实验期间昼夜交替光照12 h，每隔24 h 换水投毒投料，记录蝌蚪的死亡状况，并清除死亡个体。

1.2.2 慢性毒性实验根据急性毒性实验结果，在死亡率最低浓度下设置慢性毒性实验TCS 浓度（10 µg·L−1、30 µg·L−1、60 µg·L−1、90 µg·L−1、120 µg·L−1），另设空白对照组，每组3个平行。实验前每组随机投入18只大小一致的蝌蚪（G22期）于500 mL实验液中，实验期间昼夜交替光照12 h，每24 h 换水投毒投料。分别于0 d、7 d、14 d、21 d 测量蝌蚪生长发育的主要形态量度指标，包括体质量、全长、头体长、尾长、吻长、眼间距（费梁等，2012），并利用体视镜观察组织器官发育（肝脏、心脏、鳃等）的情况。

1.2.3 统计分析急性毒性实验数据使用Excel 2019 和Probit 分别进行数据整理和回归分析，建立“剂量-效应”线性方程，得到24 h、48 h、72 h、96 h 的半致死浓度（LC50）。蝌蚪存活安全浓度（SC）=48 h LC50×0.3（/24 h LC50/48h LC50）（2程剑等，2020）。

慢性毒性实验数据使用Excel 2019 进行统计整理，并用SPSS 19.0 处理。采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）比较0 d、7 d、14 d、21 d 空白对照组与实验组蝌蚪的体质量、全长、头体长、尾长、吻长、眼间距。为了减小初始形态量度指标对结果造成误差，进一步分析了以上形态量度指标每周增长量间的差异。显著性水平设为α=0.05。

2 结果

2.1 急性毒性实验结果

空白对照组与乙醇对照组的死亡率为0，因此排除乙醇溶剂对蝌蚪死亡率的影响。蝌蚪暴露24 h时，150 µg·L−1、400 µg·L−1、450 µg·L−1、600 µg·L−1、650 µg·L−1、700 µg·L−1、750 µg·L−1浓度组出现死亡，750 µg·L−1浓度组全部死亡，表现为腹部发白、尾部卷曲、下沉；48 h 时，300 µg·L−1、350 µg·L−1、500 µg·L−1、550 µg·L−1浓度组出现死亡，600 µg·L−1和 700 µg·L−1浓度组全部死亡；72 h时，200 µg·L−1、250 µg·L−1浓度组出现死亡，400 µg·L−1、450 µg·L−1、500 µg·L−1、550 µg·L−1、650 µg·L−1浓度组全部死亡 ；96 h 后 ，150 µg·L−1浓 度 组 的 死 亡 率 最 低（2.2%）（表1）。

表1 不同三氯生浓度下峨眉林蛙蝌蚪的死亡率Table 1 Mortality of Rana omeimontis tadpoles by different concentrations of triclosan

利用Probit 建立线性方程，结果显示，LC50分 别 为 613 µg·L−1（24 h）、482 µg·L−1（48 h）、289 µg·L−1（72 h）和 266 µg·L−1（96 h），96 h-SC为 89 µg·L−1（表 2）。

表2 急性毒性实验线性方程Table 2 Linear equation of acute toxicity test

2.2 慢性毒性实验结果

2.2.1 峨眉林蛙蝌蚪组织器官发育（肝脏、心脏、鳃）比较观察暴露21 d，空白对照组、10 µg·L−1、30 µg·L−1、60 µg·L−1浓度组进入 G25 期，鳃盖褶生长发育至全部遮盖外鳃，心脏为暗红色、形状清晰，皮肤颜色逐渐加深（图 1）。90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度组进入G24 期，与同期空白对照组相比，鳃泛红充血，心脏较小且泛红充血，肝脏未见异常。

图1 空白对照组峨眉林蛙蝌蚪（G25期）背面、腹面Fig. 1 Dorsal and ventral views of Rana omeimontis tadpoles（G25 stage）

2.2.2 峨眉林蛙蝌蚪形态量度指标每周结果比较暴露前，30 µg·L−1浓度组的体质量极显著大于空白对照组（P<0.01）；暴露7 d，10 µg·L−1浓度组的体质量、眼间距，30 µg·L−1浓度组的体质量，90µg·L−1和120 µg·L−1浓度组的吻长均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）大于空白对照组；14 d 时，10 µg·L−1浓度组的体质量、吻长均显著（P<0.05）大于空白对照组，60 µg·L−1、90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度组的头体长显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）小于空白对照组；21 d 时，60 µg·L−1浓度 组的 吻长 ，90 µg·L−1浓度组的体质量、头体长，120 µg·L−1浓度组的体质量、全长、头体长、吻长均显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）小于空白对照组（图2）。

图2 TCS对峨眉林蛙蝌蚪形态量度指标的影响Fig. 2 Effects of TCS on the morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

2.2.3 峨眉林蛙蝌蚪形态量度指标每周增长量比较暴露7 d，10µg·L−1浓度组的眼间距，60 µg·L−1、90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度组的吻长均被显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）地促进发育；14 d 时，10 µg·L−1浓度组的眼间距，60 µg·L−1浓度组的头体长、吻长，90 µg·L−1浓度组的体质量、头体长、吻长、眼间距，120 µg·L−1浓度组的体质量、头体长、吻长、眼间距均被显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）地抑制发育；21 d 时，30 µg·L−1浓度组的体质量，60 µg·L−1浓度组的体质量、吻长，90 µg·L−1浓度组的体质量、吻长、眼间距，120 µg·L−1浓度组的体质量、全长、头体长、尾长、吻长、眼间距均被显著（P<0.05）或极显著（P<0.01）地抑制发育，且60 µg·L−1、90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度组的吻长发育几乎停滞（图3）。

图3 TCS对峨眉林蛙蝌蚪形态量度指标每周增长量的影响Fig. 3 Effects of TCS on the changes of morphological indicators of Rana omeimontis tadpoles

3 讨论

3.1 峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性实验

峨眉林蛙蝌蚪的急性毒性实验96 h-LC50为266 µg·L−1，96 h-SC 为 89 µg·L−1。根 据《化 学 农药环境安全评价试验准则GB/T 31270.18-2014》：急性毒性实验中，LC50<100 µg·L−1为剧毒、100~1 000 µg·L−1为高毒、1 000~10 000 µg·L−1为中毒、>10 000 µg·L−1为低毒。可知，TCS 对于峨眉林蛙蝌蚪为高毒化合物。TCS 对黑斑蛙Pelophylax nigromaculatus蝌蚪、非洲爪蟾Xenopus laevis蝌蚪（高昆等，2016）、伍德豪斯蟾蜍Bufo woodhousii woodhousii蝌 蚪 、南 方 豹 蛙Rana sphenocephala蝌蚪、板球青蛙Acris crepitans blanchardii蝌蚪（Palen‑skeet al.，2010）均为高毒化合物。

3.2 峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性实验

峨眉林蛙蝌蚪的慢性毒性实验结果显示，90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度的 TCS 使其发育速度减 慢 ，变 态 发 育 减 缓 ；60 µg·L−1、90 µg·L−1、120 µg·L−1浓度的 TCS 对蝌蚪吻长的发育呈现前期促进、后期抑制的效应。非洲爪蟾蝌蚪经32.3 µg·L−1TCS 饲养 21 d 后，生长发育受到抑制（Fortet al.，2010），与本研究结果一致。许杰（2017）指出，中华大蟾蜍Bufo gargarizans蝌蚪（G3 期）在150 µg·L−1TCS 中暴露 40 d 后的体质量与全长发育被促进。这可能是因为不同物种对TCS 的应激不同。

TCS 能干扰水生动物的甲状腺激素、雌激素、雄激素分泌而影响其生长发育（左超等，2020），如非洲爪蟾蝌蚪经TCS慢性暴露21 d后，甲状腺受体TR-β 的表达受到影响（Fortet al.，2010）；非洲爪蟾（G46 期）饲养在TCS 中一段时间后，甲状腺发育被抑制（高昆，2016）。由此推测，本研究中TCS 对峨眉林蛙蝌蚪生长发育的影响可能是通过影响其相关激素水平或其受体表达，具体原因有待进一步深入研究。

TCS的危害研究集中在急性致死、慢性影响甲状腺激素和生殖激素，以及体外细胞毒性效应：高浓度（一般300~800 µg·L−1）对鱼类、两栖类等均有致死、致畸效应（Binelliet al.，2009；Nassefet al.，2010；高昆等，2016）。低浓度（一般10~150 µg·L−1）对鱼类（Kimet al.，2015；闫亮等，2018；张灵等，2019）、两 栖 类（Fortet al.，2010；Palenskeet al.，2010；Marlattet al.，2013；许杰，2017）表现出一定的毒性，影响其相关激素水平。甚至人类血浆和母乳中均有较高的检出率，具有较高的潜在生态风险（Adolfsson-Ericiet al.，2002；高海萍等，2012；Chenet al.，2014；杨雅淇等，2019）。科学使用TCS对保障动物的正常生长繁殖、生态安全、人类健康都具有重要意义。