灰茶尺蠖成虫复眼的超微结构及其明暗适应中的变化

许曼飞,李孟园,姜 岩,孟召娜,谭 畅,王国昌,边 磊,*

(1.河南科技学院资源与环境学院,河南新乡 453003;2.中国农业科学院茶叶研究所,农业部茶树生物学与资源利用重点实验室,杭州 310008)

灰茶尺蠖Ectropisgrisescens是我国茶园中发生最普遍、最严重的害虫之一，暴发期可致茶树叶片短时间内被全部食尽，造成茶叶的严重减产(张帅琪等,2020)。利用灰茶尺蠖趋光性的灯光诱控，是有效防治该害虫的重要手段之一(桑文等,2019)。

事实上，灰茶尺蠖的光反应行为复杂且多样，除了飞行过程中对光源的趋性，还具有一定的光适应性(乔利等,2020)，即部分成虫并不扑灯，而是聚集降落在光源周围的茶树上，似对光源产生了适应性，此特殊行为使其发生次生危害的可能性大增(边磊等,2012)。已有研究表明，鳞翅目昆虫的趋光行为会受到外界环境的明亮程度和自身生理状态的影响，如夜蛾(桑文等,2022)在低于适合其复眼生理状态的光环境中时，会产生趋光及扑灯行为。杀虫灯在茶园使用，会造成茶园光环境发生变化，昆虫视觉器官为应对环境的明暗变化，会发生结构上的调整，如黑带食蚜蝇Episyrphusbalteatus附属色素细胞内的色素颗粒会随光暗条件的变化而发生纵向位移，调节进入视网膜细胞的光强度来适应外界的光强变化(张胜杰,2015)。水生草螟Acentriaephemerella的雌雄虫在面对明暗环境变化时复眼会产生明显的色素移位和视网膜细胞体的迁移(Lauetal.,2007)。此外，杀虫灯对尺蠖的诱杀过程中，雄虫数量显著高于雌虫，该现象在舞毒蛾Lymantriadispar等其他鳞翅目害虫中也存在(Altermattetal.,2009;程文杰等,2011)。揭示这些现象发生的内在原因，对于深入理解昆虫趋光性尤其是创新灰茶尺蠖杀虫灯防控技术至关重要。

复眼是昆虫光视觉行为产生的结构基础(蒋月丽等,2016)。至今，灰茶尺蠖复眼的结构和调光机制研究未见报道。本研究利用超景深显微镜、组织切片、光学显微镜和透射电子显微镜技术系统观测了灰茶尺蠖成虫复眼的外部形态和内部结构，分析了明暗条件下复眼结构的变化，以期为深入开展灰茶尺蠖趋光行为机制研究和研发其杀虫灯防控新技术提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 试虫

灰茶尺蠖成虫源自于中国农业科学院茶叶研究所安全中心养虫室，幼虫食料为新采集茶枝，成虫羽化后饲以10%蜂蜜水。饲养温度为24～27℃，相对湿度为65%～75%，光周期为14L∶10D。

将试虫在500 lx条件下持续照射2 h，作为明适应样本；在黑暗条件下静置2 h，作为暗处理样本。

1.2 复眼外部形态观察

超景深显微镜(基恩士VHX-6000，日本；镜头VH-Z100UR)观测灰茶尺蠖两侧复眼外部形态，采集其3D图像。试虫前处理剪去多余组织，将头部固定在载物台，调整头部角度和位置，分别使复眼的背侧、腹侧、前、后及侧面5个区域位于视野中央。小眼数量采用指甲油印痕法观测计得，对复眼涂以指甲油，待干燥后剥下印痕干膜，超景深显微镜下观察并统计单个复眼的小眼数(张胜杰,2015)。

1.3 复眼内部结构观察

1.3.1样品准备：切取成虫复眼置于FAS眼球固定液中负压固定2 h，4℃冰箱过夜。样品固定完成后，用PBS磷酸盐缓冲液(0.1 moL/L，pH 7.0)清洗3次，每次15 min。1%锇酸溶液固定样品1 h，再用PBS漂洗样品3次，每次15 min。用30%,50%,70%和80%乙醇溶液对样品进行梯度脱水，每种浓度处理15 min。接着过渡至90%和95%丙酮溶液，分别处理15 min。最后用纯丙酮处理2次，每次20 min。Spurr包埋剂与丙酮1∶1(v/v)混合液处理样品1 h，Spurr包埋剂与丙酮3∶1(v/v)混合液处理3 h，最后转入纯包埋剂中室温下过夜。将经渗透处理的样品包埋，70℃过夜，得包埋好样品，备用。

1.3.2光学显微结构观察：将明暗适应的尺蠖成虫复眼固定和前处理后，通过超薄切片机(Leica EM UC7)获厚4 μm半薄切片，置于带1%甲苯胺蓝染液液滴的载玻片上，烤干，高倍光学显微镜(Olympus BX41)下观测复眼结构变化。

1.3.3透射电镜结构观察：尺蠖成虫复眼前处理后，用切片机切得厚70～90 nm切片，柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和液各染色5～10 min，透射电子显微镜(Hitachi H-7650)下观测复眼内部超微结构。

1.4 数据分析

采用VHX-6000(V3.2)分析复眼3D图像，计算小眼数量、小眼间角(相邻小眼纵轴间夹角)、小眼直径(六边形小眼角对角距离)、小眼曲率半径等参数。ImageJ(V1.8)计算小眼长度 (角膜远端到基膜的距离)、角膜厚度、晶锥长度、透明区宽度和感杆束宽度(感杆束最宽处)。采用独立样本t检验对雌、雄成虫复眼结构的参数进行差异显著性分析。

2 结果

2.1 眼外部结构

灰茶尺蠖成虫头部两侧的复眼呈规则的半球形，极大多数小眼呈规则的正六边形，少数呈五边形(图1)。复眼的外部形态参数如表1所示，雌雄成虫复眼的小眼数量之间有显著差异(t=-4.763,df=4,P<0.05)，小眼间角、小眼直径和小眼曲率半径均有极显著差异(小眼间角:t=-6.259,df=58,P<0.05;小眼直径:t=-4.613,df=58,P<0.05;小眼曲率半径:t=-5.308,df=58,P<0.05)。雌虫复眼长度(从角膜远端到基膜)为359.66±19.99 μm，雄虫复眼长度为457.86±35.33 μm。

图1 灰茶尺蠖雌成虫复眼中心部位Fig.1 Center area of the compound eye of female adults of Ectropis grisescensA:超景深显微镜下复眼的外部结构External structure of compound eyes under ultra depth of field microscope;B:解剖镜下复眼的外部结构External structure of compound eyes under anatomic microscope.箭头所示为五边形小眼。Arrowheads show pentagonal ommatidia.

表1 测定的灰茶尺蠖雌雄成虫复眼结构参数Table 1 Measured parameters of the compound eyes of female and male adults of Ectropis grisescens

2.2 内部超微结构

灰茶尺蠖成虫复眼具备透明区结构，属于叠置复眼，其雌、雄成虫复眼在整体结构上的组成并无差异，单个小眼结构从远端到近端依次为角膜(cornea,Co)、晶锥(crystalline cone,CC)、核区(nuclear zone,NZ)、感杆(rhabdomere,Rh)、基部视网膜细胞(basal retinula cell,BRC)以及基膜(basement membrane,BM)，小眼的外围包括初级色素细胞(primary pigment cell,PPC)和次级色素细胞(secondary pigment cell,SPC)(图2)，各结构的纵向长度如表1所示。

图2 灰茶尺蠖成虫复眼结构纵切观Fig.2 Longitudinal section view of the compound eye structure of Ectropis grisescens adultsA:小眼纵切结构示意图Longitudinal section sketch of ommatidium structure;B-E:分别为小眼晶锥、次级色素细胞、视网膜细胞核区及感杆束区域的横切透射电镜图Transverse sections of crystalline cone,secondary pigment cell,retinula cell nuclear zone and rhabdom regions of ommatidium,respectively,under transmission electron microscope.

2.2.1角膜：小眼最外层为外凸内平的角膜，约20层纤维层叠合而成(图3:A)，外表面着生微小锥状凸起，称为角膜锥突(corneal nipple,CN)，高0.31±0.01 μm(图3:A)。

2.2.2晶锥：角膜下方为一个形似子弹状的晶体，即晶锥，由4个晶锥细胞及其胞内分泌物形成，属真晶体类型(图3:B,C)。晶锥细胞核位于晶体的远心端(图3:B)。晶锥细胞核下方，晶锥细胞的分泌颗粒分布不均匀，形成两个同心区，其间存在一个微小囊泡密布的中间带，内部同心区颗粒分布致密，呈电子不透明状(图3:C)。晶锥纵切可看出，靠近近端的晶锥表面逐渐收缩(图3:B)。4个晶锥细胞的细胞质沿着核区的中央分泌区向下延伸，汇聚到晶体的近心端，在纵切水平上形成一个细长的晶体束(图3:D)。

图3 灰茶尺蠖雄成虫小眼远端透射电镜观察Fig.3 Distal parts of ommatidia of male adults of Ectropis grisescens observed under transmission electron microscopeA:小眼远端，可见角膜及其下晶锥Distal part of ommatidium,showing a cornea and an underlying crystalline cone;B:晶锥纵切，可见初级色素细胞及其内部的球状电子致密颗粒和次级色素细胞Longitudinal section of the crystalline cone,showing primary pigment cells and their internal spheroidal electron dense particles and secondary pigment cells;C:晶锥中部，可见4个晶锥细胞(箭头示微小囊泡)Middle part of crystalline cone,showing four crystalline cone cells (arrows showing microscopic vesicles);D:晶体束近端Proximal part of crystalline tract.CC:晶锥Crystalline cone;CN:角膜锥突Corneal nipple;Co:角膜Cornea；CT:晶体束Crystalline tract;N:细胞核Nucleus;PG:色素颗粒Pigment granule;PPC:初级色素细胞Primary pigment cell;SPC:次级色素细胞Secondary pigment cell;1-4:4个晶锥细胞Four crystalline cone cells.

2.2.3初级色素细胞：晶锥被两个初级色素细胞包围(图3:B,C)。两个初级色素细胞的远端和角膜内表面相接然后沿晶锥边缘一直向下延伸(图3:B)，直至视网膜细胞核区的远端(图3:D)。初级色素细胞外侧有一圈电子致密的直径0.54±0.04 μm球状色素颗粒(图3:B)。初级色素细胞的核位于晶锥中部位置。晶体束近端，两个初级色素细胞脱离晶体束(图3:D)。

2.2.4次级色素细胞：6个次级色素细胞填充在相邻小眼之间的空间，晶锥远端处，次级色素细胞位于相邻初级色素细胞外较狭窄的空间中(图3:B,C)。晶锥近端，次级色素细胞膨大，充满晶体束和视网膜细胞之间(图4:A)。次级色素细胞具有透明胞浆，无任何细胞器，因此形成一个透明区(图4:A)。

2.2.5透明区：透明区厚度为130.76±4.71 μm(图2:A)。小眼的视网膜细胞远端部分与晶体束末端相接并穿过透明区一直向下延伸至感杆束远端。晶体束下方，14个视网膜细胞围绕小眼轴聚集成束，呈辐射状排列，内侧细胞膜均未特化为微绒毛，故此区未见感杆。继则向内，即为视网膜细胞核区(图4:B)。该细胞核聚集区近心端，视网膜细胞急剧变细，形成细杆状的视网膜细胞束，穿过具球状色素颗粒透明区。

图4 灰茶尺蠖雄成虫小眼视网膜细胞透射电镜观察Fig.4 Retinula cell of ommatidium of male adults of Ectropis grisescens observed under transmission electron microscopeA:视网膜细胞远端横切Transverse section of the distal parts of retinula cell;B:在视网膜细胞无感杆层深区域可见其细胞核Nuclei of retinula cell can be found at the level of the retinula cell bundle without the rhabdomere.CZ:透明区Clear zone;N:细胞核Nucleus;SPC:次级色素细胞Secondary pigment cell.

图5 灰茶尺蠖雄成虫小眼视杆横切透射电镜观察Fig.5 Transverse sections of the rhabdom of ommatidium of male adults of Ectropis grisescens observed under transmission electron microscopeA-B:感杆束远端横切Transverse sections of the distal parts of rhabdom;C:14个视网膜细胞(用数字指示)形成中心闭合的感杆束Fourteen retinula cells (indicated by numerals) form a centrally-fused rhabdom;D:感杆束近端横切，数字示视网膜细胞Transverse section of the proximal parts of rhabdom,numbers indicating the retinula cells.Des:桥粒Desmosome;Rh:感杆束Rhabdom.

2.2.6感光层：衔接透明区的感光层近端，视网膜细胞束膨大，相邻的透明区范围缩小，且不具有色素颗粒(图5:A)。14个视网膜细胞的感杆聚集在一起，形成感杆束(图5:A-D)，感杆束末端与第15个视网膜细胞衔接，呈“14+1”模式。感杆束横截面积达到最大，直径7.74±0.63 μm，感杆束分支呈蝴蝶状(图5:A-B)，但大部分区域的感杆束呈不规则状(图5:C-D)。从横截面来看，单个感杆的微绒毛平行排列，但相邻感杆的方向不同(图5:A-D)。整个感杆束长度为92.43±2.76 μm。

2.2.7基部视网膜细胞：小眼的感杆束末端和基部视网膜细胞(basal retinula cell)即第15个视网膜细胞衔接(图6:A)。小眼感杆束末端和基膜之间，存在一个由基部视网膜细胞、基膜下方延伸来的气管和次级色素细胞共同组成得特殊区域，宽度为25.17±1.67 μm(图6:C)。

2.2.8基膜：位于小眼基部，厚度为0.69±0.05 μm，呈褶皱结构(图6:B)。

图6 灰茶尺蠖雌成虫小眼基膜透射电镜观察Fig.6 Basement membrane of ommatidium of female adults of Ectropis grisescens observed under transmission electron microscopeA:基部视网膜细胞横切Transverse section of basal retinula cell;B:基膜横切Transverse section of basement membrane;C:基部视网膜细胞纵切Longitudinal section of basal retinula cell.Ax:轴突Axon;BM:基膜Basement membrane;BRC:基部视网膜细胞Basal retinula cell;PG:色素颗粒Pigment granule;RC:视网膜细胞Retinula cell;Rh:感杆束Rhabdom;T:微气管Tracheole.

2.3 明暗适应中复眼结构的变化

因雌雄成虫复眼的组成结构间无明显差异，为方便描述，选其雄成虫的复眼进行以下描述。

2.3.1晶锥的开闭：明适应时，大部分晶锥细胞完全闭合(图7:A)；暗适应时，晶锥细胞间出现开裂，多数开裂为4部分，少数开裂为两部分(图7:B)。表明，相应于明暗条件的变化，晶锥可通过闭合或开裂调节进光量。

2.3.2色素颗粒的移动：明、暗条件下，次级细胞色素颗粒发生纵向移动。明适应时，次级细胞色素颗粒(PG)集中分布在视网膜细胞束远端至晶锥(CC)近端(图8:A)；基膜处色素颗粒(PG)集中在基膜(BM)周围，起保护神经节层(La)的作用(图8:C)。而在暗适应时，次级色素细胞颗粒向晶锥远端移动，聚集在晶锥周围，包裹初级色素细胞(图8:B)；基膜处色素颗粒则向感杆远端和神经节层扩散(图8:D)。表明在明适应时次级色素颗粒下移，接受入射本小眼上的光；暗适应时则上移，可接收邻近小眼的入射光。

图7 明暗适应中灰茶尺蠖雄成虫晶锥变化的横切Fig.7 Transverse section of the crystalline cone of male adults of Ectropis grisescens during light/dark adaptationA:明适应中During light adaptation;B:暗适应中During dark adaptation.Co:角膜Cornea；CC:晶锥Crystalline cone.箭头表示次级细胞色素颗粒。Arrowheads denote the secondary cell pigment granule.

图8 明暗适应中灰茶尺蠖雄成虫晶锥和基膜纵切Fig.8 Longitudinal sections of the crystalline cone and basement membrane of male adults of Ectropis grisescens during light/dark adaptationA:明适应中晶锥纵切Longitudinal section of the crystalline cone during light adaptation;B:暗适应中晶锥纵切Longitudinal section of the crystalline cone during dark adaptation;C:明适应中基膜纵切Longitudinal section of the basement membrane during light adaptation;D:暗适应中基膜纵切Longitudinal section of the basement membrane during dark adaptation.BM:基膜Basement membrane;CC:晶锥Crystalline cone;Co:角膜Cornea;La:神经节层Lamina;PG:色素颗粒Pigment granule.

3 讨论

灰茶尺蠖雌、雄成虫在小眼数量和小眼直径上存在显著差异，雄虫比雌虫拥有更多的小眼及更大的小眼面积，主要原因是雄虫体型较大。这种小眼尺寸上的雌雄二型现象在鳞翅目昆虫中很常见，如亚洲玉米螟Ostriniafurnacali雄虫复眼直径显著大于雌虫，雄虫和雌虫复眼直径分别为0.96±0.01和0.87±0.01 mm(Chenetal.,2019)。古毒蛾Orgyiaantiqua雄虫有大约2 200个小眼且眼宽为0.77 mm，而雌虫仅有900个小眼，眼宽也仅为0.56 mm(Lau and Meyer-Rochow,2007)。

在内部组成结构上，灰茶尺蠖雌雄成虫复眼无显著差别，其小眼在晶锥与感杆之间均存在一个透明区，符合重叠型复眼的结构特征(Warrant and Dacke,2011)。透明区是夜行性昆虫特有复眼的结构，常由次级色素细胞的透明胞质组成，借助该区色素颗粒的移动可以调节进入小眼的光量(Horridge,1977;Land and Nilsson,2012)。因此，重叠复眼具有更高的光能利用率和视觉灵敏度，提高了复眼的夜视能力(兰英和魏琮,2020)。如Lau等(2007)报道水生草螟A.ephemerella复眼在明适应时色素颗粒从晶锥远心端移入透明区，暗适应时色素颗粒则在晶锥周围聚集，使更多的光线进入小眼；美国白蛾Hyphantriacunea复眼中的次级细胞色素颗粒在明暗条件下会发生纵向位移，以调节透明区的受光面积，适应环境中的光强变化(陆苗等,2013)。这些现象与本研究中灰茶尺蠖的调光机制是一致的。

灰茶尺蠖属于鳞翅目尺蛾科，其成虫复眼内15个视网膜细胞呈“14+1”式排列，即远心端14个视网膜细胞的感杆聚集在一起，形成一个中心闭合的感杆束，第15个为基底视网膜细胞，同样具有这种“14+1”视网膜结构的还有冬尺蠖蛾Operophterabrumata(Meyer-Rochow and Lau,2008)。在夜蛾科中，视网膜细胞多呈“7+1”式排列(高慰曾和郭炳群,1983)，如亲土苔夜蛾Manuleaaffineola(陈庆霄,2020)和非洲黏虫Spodopteraexempta(Meinecke,1981)中。水生草螟A.ephemerella复眼内9个视网膜细胞呈“8+1”式排列(Lauetal.,2007)。这些结构特征说明小眼视网膜细胞的排列模式与其种属存在相关性，同种属昆虫的排列结构大概率保持一致，不同种属昆虫的排列方式呈多样性变化。

感杆束是昆虫复眼最重要的感光结构，有复杂的视觉定向功能(冷雪和那杰,2009)。夜行性昆虫可通过增大感杆束的横切面来增加对光的吸收，从而使小眼的敏感性和光感受能力提高(Meyer-Rochow,1977)。灰茶尺蠖的感杆束属闭合型，其感杆束远端部分的横切面积最大，能够提高尺蠖在夜晚对光的感知能力，使其能在黑夜中正常活动(张玲,2010)。感杆束内微绒毛的排列方式会影响昆虫分辨偏振光的能力(Kuwabara,1959;Shaw,1969)，灰茶尺蠖单个视网膜细胞内的微绒毛平行排列，但相邻视网膜细胞内微绒毛的方向发生改变，暗示其可能也具有识别偏振光的能力。

本研究初步观测了灰茶尺蠖成虫复眼外部形态、内部超微结构以及不同明暗适应其内部结构的变化，但未深入研究小眼结构与尺蠖视觉行为之间的内在关系等问题，全面深入地揭示其感光和趋光行为机制，尚需进一步开展其电生理学和行为学等后续研究。