无菌松材线虫对华北落叶松、油松和马尾松的致病性1)

方天雨 刘厚言 冯源 陈友梅 叶建仁 朱丽华

(南方现代林业协同创新中心( 南京林业大学) ，南京，210037) (南京林业大学)

病原研究是疾病和病害研究的基本问题。病原确诊是揭示致病机制的前提，也是科学制定防控措施的基础。2003年的“非典”事件(严重急性呼吸道综合症，SARS)充分证明病原的准确鉴定对防控措施制定的重要性。SARS出现早期，专家将其病原诊断为衣原体，然而大量病例抗生素治疗无效，进一步深入研究将SARS病原准确确定为冠状病毒。最终，通过采取针对病毒的防控策略，该新发全球流行性疾病的扩散传播才得以有效控制[1-2]。

松材线虫病是一种毁灭性松树流行病，不仅造成严重的经济损失[3]，且导致严重的生态破坏，堪称松林“SARS”或“新冠肺炎”。目前该病害在美洲[4]、亚洲[5-6]、欧洲[7-8]，以及非洲[9]多国有分布。北美洲被认为是松材线虫病的原发地[4，10]，亚洲是松材线虫病流行危害最严重的地区，其中我国受害尤其严重[11]。自1982年首次在南京发现以来，该病害迅速向中国南方扩散，并逐步向北蔓延，截止2020年，全国共计17个省(区、市)722个县级行政区发生松材线虫病(国家林业和草原局2021年第5号公告)；其在我国自然感染的树种也从松属(Pinusspp.)跨越到了落叶松属(Larixspp.)，包括黑松(P.thunbergii)、赤松(P.densiflora)、马尾松(P.massoniana)、油松(P.tabuliformis)、红松(P.koraiensis)、樟子松(P.sylvestrisvar.mongolica)、长白落叶松(L.olgensis)、日本落叶松(L.kaempferi)、华北落叶松(L.principis-rupprechtii)等17个松种[11-14]。松材线虫病的发生涉及多个生物因子[15]，病害系统相当复杂[16]。虽然该病害最早于1905年在日本首次报道，但直到1971年，松材线虫(Bursaphelenchusxylophilus)才被鉴定为该病害的病原[17]。随后，有学者提出松树快速萎蔫与松材线虫携带细菌产生的毒素有关[18]，有学者进一步报道不携带任何细菌的松材线虫失去了对松苗的致病性[19-20]，无菌松材线虫或致病力相对弱的拟松材线虫(Bursaphelenchusmucronatus)与致病细菌共同接种则导致松苗萎蔫[21-23]，因此，认为松材线虫伴生细菌才是该病害的真正病原[21-22]，也有学者提出松萎蔫病是松材线虫与细菌共同侵染引起的复合侵染病害[23]。然而，有些研究则显示，无菌松材线虫并未失去其对松苗的致病性[24-28]。由于松材线虫病病原尚未彻底弄清，致病机制也不十分清楚[10，16]，导致防控措施上也存在一定混乱。目前采取的主要防控措施有检疫和疫情监测、疫木除治、媒介昆虫防治，以及针对病原松材线虫的树干注射[11]；此外，也有针对细菌作为病原的防控措施[29-30]。为了进一步明确松材线虫病的病原问题，本研究以华北落叶松、油松和马尾松无菌苗为试验材料，探讨了无菌松材线虫的致病性，以期为病害致病机制研究及防控策略制定提供理论依据。

1 材料与方法

供试松材线虫为强致病力虫株AMA3c1经无菌化处理获得的不携带细菌的松材线虫(简称无菌松材线虫)，使用前于冰箱4 ℃保存[27]。致病性测定试验开始前15 d，将无菌松材线虫从冰箱取出，接种于生长旺盛的马尾松愈伤组织上，培养10 d后于无菌条件下分离获得线虫悬液，取0.5 mL线虫悬液于LB培养液中振荡培养5 d，检验无任何细菌生长后，用于后续致病性测定试验。

供试马尾松成熟种子采集自广东信宜(2019年)、油松成熟种子采集自河北承德平泉(2017年)、华北落叶松成熟种子采集自河北围场(2017年)。所有种子，使用前于冰箱4 ℃条件下保存。

无菌松苗的制备：于超净工作台中，将无菌水冲洗1 h后的马尾松、油松和华北落叶松种子分别放入下端四周及底部戳有小孔(孔径小于种子)的灭菌50 mL离心管内，将离心管浸入装有75%酒精的灭菌100 mL烧杯中，浸泡30 s后取出，排尽酒精后将离心管转入装有30% H2O2的灭菌烧杯中浸泡20 min，期间不时用灭菌镊子搅动种子以保证充分灭菌，待灭菌结束，将离心管取出，无菌水冲洗直至干净(持续2～3 min)，将灭菌后种子置于灭菌滤纸上，待种子表面干燥后，将种子间隔接种于水琼脂平板上，10粒/皿，25 ℃，暗培养。每次处理种子300粒左右，试验重复3次。7 d后统计其污染率及萌发率。14 d后将无菌萌发的种子转入装有40 mL DCR+30 g/L蔗糖+活性炭1.0 g/L的培养基中(pH=5.8)[25]，25 ℃，光照培养，备用。

无菌松材线虫对华北落叶松、油松和马尾松的致病性测定及线虫的再分离：无菌松材线虫的致病性测定参照朱丽华等[31]的方法，即截顶法。于超净工作台中将无菌松苗取出，用灭菌手术刀截去顶端分生组织，再将松苗重新种植于新鲜培养基中，将一灭菌棉球置于松苗顶端伤口处，随后用移液器将50 μL无菌松材线虫悬液(约含线虫500条)接种于小棉球上，每个松种接种10～20株苗，以接等体积无菌水为对照。试验重复3次。接种后，将松苗置于(25±2)℃光照培养箱中培养，观察松苗萎蔫情况，统计松苗萎蔫率，即萎蔫率=(萎蔫植株数/接种植株数)×100%。

接种25 d后，对发病植株进行线虫的再分离，每个松种分离6～10株。于超净台中，将松苗取出，用手术剪将其剪成若干5 mm左右小段，采用贝尔曼漏斗法进行线虫再分离，24 h后收集线虫悬液，并对再分离线虫进行无菌检验；显微镜下统计线虫数量，计算每株松苗中的线虫数量。

采用GraphPadPrism6.01软件对数据进行统计分析。

2 结果与分析

2.1 30% H2O2对华北落叶松、油松和马尾松成熟种子无菌化及其萌发的影响

试验结果表明，30% H2O2处理3种松树种子均能够取得较好的灭菌效果，其中马尾松和华北落叶松平均污染率均低于5%，油松污染率稍高，平均污染率为7.6%；不同松种之间种子萌发率有一定差异，由高到低依次为马尾松、华北落叶松和油松，其无菌萌发率平均分别为67.7%、60.1%和47.5%(表1)。经30% H2O2处理的松种在无菌条件下萌发、发育正常(图1)。

表1 30% H2O2处理时3种松树种子的无菌萌发

2.2 无菌松材线虫对华北落叶松、油松和马尾松的致病性

接种6 d后，首先观察到马尾松苗针叶褪色，随着时间推移，针叶黄化最后变成红褐色，萎蔫症状与野外发病症状一致(图2A)；油松和华北落叶松表现发病症状较马尾松晚，均于第12天出现针叶褪色、黄化现象，最后亦变成红褐色(图2B、C)，油松和华北落叶松针叶变红褐色的时间进程与马尾松相比，相对更慢。接种无菌松材线虫的马尾松和油松发病率相对较高，25 d后，其平均萎蔫率分别为89.2%和78.3%，而华北落叶松苗平均萎蔫率为53.3%(表2)。接种无菌水的对照松苗始终保持健康状态(图2D～F)。

A.萌发7 d；B.萌发14 d。图1 无菌萌发的马尾松成熟种子

A～C.马尾松、油松和华北落叶松接种无菌松材线虫(25 d后)；D～F.对照马尾松、油松和华北落叶松(无菌水接种)。图2 无菌松材线虫接种马尾松、油松和华北落叶松的发病症状

表2 无菌松材线虫对马尾松、油松和华北落叶松的致病性及再分离线虫数量

2.3 萎蔫植株中再分离线虫的数量

接种25 d后，线虫再分离结果表明，无菌松材线虫接种发病的松苗中均分离到了松材线虫，马尾松和油松萎蔫植株中再分离的线虫数量高于华北落叶松；同一松种内，不同植株间再分离线虫数量差异较大(表2)。马尾松萎蔫植株中再分离线虫数量平均为(2 628±3 321)条/株(N=6株)，单株最低线虫数量为400条，最高达9 267条；油松萎蔫植株中再分离线虫数量平均为(2 627±2 287)条/株(N=10株)，单株最低线虫数量为133条，最高达6 800条；华北落叶松萎蔫植株中再分离线虫数量平均为(1 144±608)条/株(N=6株)，单株最低线虫数量为433条，最高为1 900条(表2)。经LB液体培养基检验，未发现有任何细菌生长。

3 讨论

自从Mamiya et al.[17]1971年首次将松材线虫鉴定为该病害的病原，已经过去了整整50 a。期间，松材线虫在松树萎蔫过程中的作用、及作为唯一病原引起松树萎蔫的能力和松材线虫携带细菌在松树萎蔫过程中的地位，一直倍受关注。为了准确界定松材线虫及其携带细菌在该复杂病害系统中的作用，多项研究对无菌松材线虫的致病性进行了评价，结果不尽相同。

早在1977年，Tamura[32]发现无菌松材线虫接种赤松可致其萎蔫，萎蔫率与带菌松材线虫无异；且在石蜡油中保存1 a后的无菌松材线虫依然保持致病性。Bolla et al.[33]亦报道，无菌松材线虫接种欧洲赤松(P.sylvestris)可导致其萎蔫，其程度与带菌松材线虫接种相同。1983年，Tamura[24]进一步证实无菌松材线虫接种可致无菌黑松苗及3年生盆栽赤松苗萎蔫。近年来，多位研究者采用无菌松材线虫接种马尾松和赤松[25，27]、海岸松(P.pinaster)[34]、黑松[26]、地中海松(P.halepensis)[35]，均获得相同的结果，证明松材线虫作为唯一病原，可以引起松树萎蔫，松材线虫携带细菌并非松树萎蔫的必需因子。本研究中，无菌松材线虫接种可导致华北落叶松、油松和马尾松无菌苗萎蔫。

然而，Kawazu et al.[19]的研究结果显示，无菌松材线虫单独接种未能引起赤松苗萎蔫，即无菌化处理使松材线虫失去了致病性[21]。随后，郭道森等[20]也报道，无菌松材线虫单独接种不能使黑松苗发病，与细菌混合接种却可使松苗萎蔫。洪英娣等[36]以及Han et al.等[22]进一步证实，无菌松材线虫单独接种不能使松苗发病，但若与松材线虫携带细菌混合接种则均能导致松苗萎蔫；并且，弱致病力拟松材线虫与细菌混合接种后引起了松苗严重萎蔫，因此认为松苗萎蔫由松材线虫携带细菌种类所决定，而与线虫种类不大。此后，也有学者报道不携带细菌的松材线虫对黑松没有致病性[23，37-38]。虽然Kawazu et al.[19]无菌条件下的接种结果显示无菌OKD-3失去了致病性，但其开放条件下的接种结果却表明无菌OKD-3依然能导致非无菌赤松苗的枯萎。对此，Kawazu et al.[19]认为，由于在开放条件下接种，使无菌松材线虫重新感染了具有致病性的细菌，因此使其重新获得了致病性。

综上所述，有多项研究证实无菌松材线虫对6种松属树种，即欧洲赤松、黑松、赤松、马尾松、海岸松、地中海松具有致病性；同样也有多项试验表明无菌化处理使松材线虫失去了致病性，其间的差异可能与试验所用的虫株有关，也可能与其他因素，例如致病性测定所用接种方法及观察时间等有关。本研究于无菌条件下对无菌松苗进行无菌松材线虫接种，再次证实，无菌松材线虫不仅对松属树种有致病性，对落叶松属树种同样具有致病性。今后应采用更多虫株、更多松种、更统一的方法在完全无菌的条件下进行接种，以充分评估松材线虫及其携带细菌在松树萎蔫过程中的作用。

4 结论

再次证实无菌化处理的松材线虫并未失去对松属树种的致病性，同时对落叶松属树种同样具有致病性。因此，松材线虫是导致松树萎蔫的真正原因，其致病性与其伴生细菌无关，并且其危害致病的树种范围也进一步扩大。