白头翁种子休眠机制及破眠技术研究

董燕婧， 钟国跃， 秦 倩， 牛艺鸣， 陈咪咪， 张寿文

(江西中医药大学中药资源与民族药研究中心， 南昌 330004)

白头翁毛茛科植物白头翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regei)的干燥根，其活性成分总皂苷及单体具有广泛的抗癌活性，临床和兽用中医药领域应用广泛[1-2]。目前，关于白头翁的相关研究多集中在化学成分、药理活性等方面，药用资源混乱，正品白头翁资源量少且价格高，野生资源急剧减少，商品白头翁掺假严重，质量不稳定、不均一现象严重，还未形成成熟的资源再生繁殖利用技术体系。

种子休眠是一种复杂的植物适应性特性，能够使种子长期贮存并保持一定的生活力，从而保证物种的繁殖与生存[3-4]。作为一种保护机制，植物种子在自我保护的同时也为农业、林业生产甚至是濒危野生物种的保存方面带来一定的挑战[5]。大量研究表明，种子成熟时仍处于休眠状态，延迟萌发的种子存在多种先天调控机制，即休眠类型不同[6-10]。形态生理休眠(MPD)种子较为常见，此类型种子没有完整的胚结构，还有一定的萌发抑制物，常见于百合科、五加科以及部分毛茛科植物，如重楼[11]、细辛[12]、五加[11]、黄连[13]等药用植物。白头翁种子细小，纺锤形，表面被绒毛，成熟时胚发育不完全，存在生理后熟的现象，自然状态下萌发率低，且易霉烂[14-15]。目前主要通过GA3、低温、超声波、PEG-6000等处理方法打破白头翁种子休眠，未见关于其休眠特性、休眠类型、休眠机制等方面的研究。

基于此，本试验以野外采集的白头翁种子为材料，对种子吸水特性、种皮透性、种胚成熟度、种子萌发抑制物以及种子破眠方法进行研究，分析白头翁种子休眠机制，确定种子休眠类型，寻找有效打破白头翁种子休眠的方法，为白头翁种子播种育苗技术的完善提供理论基础和技术支持。

1 材料、仪器和试剂

野外采集白头翁种子，经江西中医药大学钟国跃教授鉴定为毛茛科植物白头翁(Pulsatillachinensis(Bge.)Regei)的种子。

主要仪器和试剂：数显游标卡尺150 mm(德国美耐特)，电子天平FA 2004 G(上海菁还仪器有限公司)，光照培养箱LRZ-260 A(杭州绿博仪器有限公司)，过氧化氢(西陇科学股份有限公司)，TKY-BMB型石蜡包埋机(湖北泰康医疗设备有限公司)，RM 2245型切片机(德国徕卡)，生物显微镜(麦克奥迪实业有限公司)，SMZ 745体视变焦显微镜(尼康仪器(上海)有限公司)，赤霉素(上海蓝季科技发展有限公司)。

2 方 法

2.1 种子吸水特性研究

随机选取种子100粒，室温条件下浸泡在水中，分别于0，2，4，6，8，10，12，24，48 h后取出，滤纸吸干表面水分，称重，测量种子横径(mm)、纵径(mm)，重复3次，取平均值。

2.2 种皮透性研究

随机选取种子100粒，分别浸泡在质量分数为0.00%，1.00%，2.00%，3.00%，4.00%的过氧化氢溶液中1 h后取出，流水下洗净表面残留过氧化氢后浸泡在水中，每隔2 h后测定其重量，每个处理3次重复，取平均值。

2.3 种子种胚成熟度研究

取外观饱满坚实、无虫洞的白头翁种子进行解剖，观察并对种子胚发育结构进行动态监测。成熟种子石蜡切片制作方法如下：

1) 固定。随机选取白头翁种子若干，剪去羽毛，FAA固定液中固定24 h以上。

2) 脱水。将固定好的种子进行抽气处理，把组织里气泡排出，然后放在流水中冲洗一昼夜。最后将种子按次序放进不同梯度浓度的乙醇中逐步脱水。如果一天不能完成全部脱水，可进行到70%乙醇中过夜保存。

3) 透明。将上述种子放在不同浓度梯度透明剂中透明。

4) 浸蜡。将完全透明的材料放在不同浓度梯度的石蜡中进行浸蜡。

5) 包埋。待包埋机里石蜡完全溶化后，将要包埋的材料放进包埋机理两侧的任意一个蜡室中，把模具放在载物台正对出蜡口处，先往模具滴1～2滴蜡，把组织迅速夹到模具中间，横切面朝上，盖上包埋盖子，再往模具上慢慢滴蜡直至没出盖子底0.2 cm时将模具移到冷却台冷却。全凝固后，将蜡块取出保存等待切片。

6) 切片。

7) 展片、粘片、烘片。先把蜡片分片置于42 ℃水浴锅中展开，再用涂有蛋清的载玻片捞起，注意材料要与玻片上下边缘平行，最后置于35 ℃烘箱中烘干。

8) 脱蜡与染色制片。二甲苯与乙醇梯度脱蜡，番红、固绿染色，乙醇冲洗，加拿大树胶封片。

9) 显微镜下观察种胚结构。使用1.0% TTC对不同萌发阶段的种子进行染色，解剖后在体式显微镜下观察种胚发育情况。

2.4 萌发抑制物研究

称取白头翁种子1.0 g，研磨，加入一定量的蒸馏水，超声提取30 min，冷却至室温后过滤，最后定容至25 mL，制备获得白头翁种子抑制物粗提液。粗提液设置20%、40%、60%、80%、100%等5个浓度梯度，以纯水为对照。随机选取白菜种子100粒，光照培养，并分别加入5 mL不同浓度的白头翁种子抑制物粗提液，分别于12 h、24 h、36 h、48 h、60 h记录白菜种子发芽情况，计算发芽率。

2.5 破眠方法研究

2.5.1层积处理

取河沙，筛去大颗粒杂质后置于高温高压灭菌锅中灭菌30 min(103.4 kPa(1.05 kg/cm2)，121 ℃)。河沙灭菌后取出，加入一定量的无菌水至手握成团，捏之即散的状态后，备用。随机取白头翁种子100粒，100 mg/L的GA3浸泡12 h(置于4 ℃冰箱中)后取出，再用1 000倍的多菌灵浸泡30 min，流水下冲洗干净，滤纸吸干表面水分，剪去羽毛，于河沙中层积处理。层积方法如下：

1) 暖层积3 d；

2) 暖层积3 d+较低温暖层积3 d；

3) 暖层积3 d+较低温暖层积3 d+冷层积3 d；

4) 冷层积3 d；

5) 暖层积3 d+冷层积3 d；

6) 冷层积3 d+暖层积3 d+冷层积3 d。

层积温度[16]为：暖层积30 ℃/15 ℃、较低温暖层积20 ℃/10 ℃，冷层积15 ℃/6 ℃。

层积处理后去除明显干瘪、发霉、虫洞的种子，进行萌发培养，每天观察种子萌发情况，并补足水分。保持滤纸为湿润状态，以胚根冲破种壳视为萌发，重复3次，取平均值。

2.5.2种子GA3处理

随机选取100粒种子，分别用50、100、150、200 mg/L GA3浸泡12 h，以蒸馏水浸泡12 h为对照。处理后取出，1 000倍的多菌灵浸泡种子30 min，流水下冲洗干净，滤纸吸干种子表面水分，剪去羽毛，在智能光照培养箱中萌发培养，每天观察种子萌发情况，并补足水分。保持滤纸为湿润状态，以胚根冲破种壳视为萌发，重复3次，取平均值。

3 结果与分析

3.1 种子吸水特性研究

通过测定不同浸泡时间下种子百粒重、横径、纵径变化，研究种子吸水规律。方差分析结果(表1)显示，不同浸泡时间下种子百粒重存在显著性差异(p<0.05)。

表1 白头翁种子吸水曲线测定指标方差分析Table 1 Analysis results of variance analysis of water absorption curve of Pulsatilla chinensis seeds

从图1可以看出，白头翁种子吸水过程中呈现出3个阶段：快速吸水期、缓慢吸水期、吸水饱和期。种子浸泡处理6 h内为快速吸水期，吸水率从0.00%急剧上升到95.41%；6～10 h逐渐变为缓慢吸水期，吸水量达107.10%；10 h后种子重量几乎无变化，吸水率趋缓，吸水饱和，进入吸水饱和期。

图1 白头翁种子吸水曲线Fig.1 Water absorption curve of Pulsatilla chinensis seeds

3.2 种皮透性研究

白头翁种子在浸泡10 h后吸水饱和，继续浸泡，种子百粒重变化差异不显著，基于此，测量过氧化氢处理下10 h白头翁种子重量变化数据。

重复测量方差分析[17]：Mauchly’s 球形度检验中p<0.05(表3)，数据非对称，多变量检测结果(表4)表明，不同浸泡时间对种子百粒重具有显著影响(p<0.05)，随着浸泡时间的推进，种子百粒重发生显著性变化。浸泡时间与不同浓度之间存在一定的交互作用(p<0.05)，随着时间的推进，不同组别百粒重变化情况不一致。成对比较结果显示，同一浸泡时间下与0.00%过氧化氢组对比，其余组别白头翁种子百粒重差异不显著(表2，图2)，白头翁种皮透性良好。

表2 过氧化氢处理白头翁种子百粒重成对比较结果Table 2 Pairwise comparison results of 100-seed weight of Pulsatilla chinensis treated with hydrogen peroxide

表3 莫奇来球形度检验Table 3 Moqilai sphericity test

图2 不同浓度过氧化氢处理下种子百粒重变化Fig.2 Changes in 100-grain weight of seeds treated with different concentrations of hydrogen peroxide

3.3 种胚成熟度研究

图3结果显示，种子处理前，胚乳丰富，充斥着种子的绝大部分体积，不同程度地包裹了胚结构；种胚则发育不完全，部分种胚处于球形胚阶段(图3 A、图3 C、图3 E，图4 a)，部分处于心形胚阶段(图3 B)，有些种子甚至未出现胚结构，种子内部完全被胚乳占据(图3 D、图3 E)。

表4 多变量检验Table 4 Multivariate test

图3 白头翁成熟种子解剖观察 Fig.3 Anatomical observation of the mature seeds of Pulsatilla chinensis

通过TTC染色，手工解剖种子跟踪观察其发育过程发现，成熟种子胚结构较小，胚乳占据绝大部分空间(图4 a)；层积处理后，种胚开始发育，胚结构由心形期逐渐发育成鱼雷型胚结构(图4 b)；进一步培养白头翁种子，胚分化，形成了明显的2片子叶结构(图4 f)。下一阶段，胚根开始形成，并逐步冲破种壳，种子萌发(图4 d～图4 f)。

图4 白头翁种子种胚发育情况 Fig.4 Embryo development of Pulsatilla chinensis seeds

3.4 种子萌发抑制物研究

由表5可知，不同浓度的白头翁种子浸提液处理白菜种子，随着处理时间的延长，白菜种子发芽率结果不同。萌发处理12 h、24 h时后，浸提液浓度对白菜种子发芽率无显著性影响，当萌发时间为36 h、48 h、60 h时，白菜种子萌发率差异显著。萌发处理36 h时，与ck组相比，浓度为80%、100%的浸提液处理下，白菜种子发芽率显著降低。48 h处理下，浸提液对白菜种子萌发均具有抑制作用，与ck组相比，白菜种子发芽率显著降低。60 h处理下，浸提液浓度对白菜种子抑制程度减弱，与ck组相比，除浓度为80%、100%处理对白菜种子萌发抑制明显外，其余组发芽情况与ck组差异不显著。

表5 同一时间下白头翁种子浸提液处理白菜种子发芽率成对比较结果Table 5 The pairwise comparison results of the germination rate of Chinese cabbage seeds treated with different Pulsatilla chinensis seed extracts at the same time point

表5(续)

数据服从莫奇来球形度检验(p>0.05)，故以主体内效应检验为最终的检验结果(p<0.001)，不同时间点发芽情况具有显著性差异。成对比较结果显示，12 h、24 h下，与ck相比，各组别处理下白菜种子发芽率无显著变化。36 h时，与ck相比，60%、80%浸提液处理白菜种子发芽率差异显著。48 h下，处理组与ck白菜种子发芽率差异显著。60 h下，100%浓度浸提液处理白菜种子，与ck相比，种子发芽率差异显著。不同浓度的白头翁种子浸提液处理白菜种子，各处理时间下的白菜种子发芽率均低于ck(图5)。不同浓度的浸提液对白菜种子发芽有抑制作用，表明白头翁种子内存在萌发抑制物。

图5 不同浓度白头翁种子浸提液处理下白菜种子萌发情况 Fig.5 Germination of Chinese cabbage seeds treated with different concentrations of Pulsatilla chinensis seed extract

3.5 种子破眠方法研究

3.5.1层积处理

对白头翁种子进行层积处理，对比不同条件下种子发芽率、发芽势、发芽指数等指标，结果见表8、表9、图6。单因素方差结果显示，不同层积方法处理下白头翁种子发芽率、发芽势、发芽指数存在显著性差异(p<0.05)。与ck组相比，暖层积、冷层积、暖层积+冷层积、冷层积+暖层积+冷层积发芽率降低，存在显著性差异；暖层积+较低温暖层积、暖层积+较低温暖层积+冷层积处理条件下白头翁种子发芽率有所下降，但与ck组相比，差异不显著。从发芽势角度分析，ck组的发芽势显著高于其他处理组，为(0.78±0.04)。对比不同组的发芽指数发现，暖层积+较低温暖层积、暖层积+较低温暖层积+冷层积处理条件下种子发芽起始萌发时间缩短，发芽较集中，显著高于ck组，与其他层积处理组相比差异显著。

表6 莫奇来球形度检验Table 6 Moqilai sphericity test

表7 主体内效应检验Table 7 Intra-subject effect test

表8 不同层积处理条件下白头翁种子发芽率、发芽势、发芽指数方差分析Table 8 Variance analysis of germination rate,germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis seeds under different stratification conditions

单因素方差结果(表9，图6)显示，不同层积方法处理下白头翁种子发芽率、发芽势、发芽指数存在显著性差异(p<0.05)。与ck组相比，暖层积、冷层积、暖层积+冷层积、冷层积+暖层积+冷层积发芽率降低，存在显著性差异；暖层积+较低温暖层积、暖层积+较低温暖层积+冷层积处理条件下白头翁种子发芽率有所下降，但与ck组相比，差异不显著。从发芽势角度分析，ck组的发芽势显著高于其他处理组，为(0.78±0.04)。对比不同组的发芽指数发现，暖层积+较低温暖层积、暖层积+较低温暖层积+冷层积处理条件种子发芽起始萌发时间缩短，发芽较集中，显著高于ck组，与其他层积处理组相比差异显著。

图6 不同层积处理条件下白头翁种子发芽率、发芽势、发芽指数情况Fig.6 The germination rate, germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis seeds under different stratification conditions

图7 不同浓度GA3处理下白头翁种子发芽率、发芽指数情况 Fig.7 Seed germination rate and germination index of Pulsatilla chinensis under different concentrations of GA3

表9 层积处理对白头翁种子发芽的影响Table 9 Seed germination rate, germination potential and germination index of Pulsatilla chinensis under different stratification conditions

3.5.2GA3处理研究

表10结果表明，不同浓度的GA3处理种子后，种子发芽率、发芽指数存在显著差异。

表10 不同浓度GA3处理白头翁种子发芽率、发芽指数方差分析Table 10 Variance analysis of germination rate and germination index of Pulsatilla chinensis seeds treated with different concentrations of GA3

单因素方差分析结果显示，不同浓度GA3处理白头翁种子发芽率、发芽指数差异显著，发芽率、发芽势呈先上升后下降的趋势，150 mg/L GA3处理下白头翁种子发芽率、发芽指数达到最大值，分别为(36.67±8.82)%和(2.03±0.56)，与ck组相比差异显著。

4 小结与讨论

研究表明，种子成熟时仍处于休眠状态，延迟萌发的种子存在多种先天调控机制，即休眠类型不同[6-10]。然而，大多数研究都未指出正在调查的休眠类型，或者最终属于哪种休眠。一方面，种子处于休眠状态还是非休眠状态因物种和个体而异；另一方面，同一批次的种子可能含有休眠、非休眠以及条件选择型休眠等多种类型。

在文献研究的基础上设计实验，研究白头翁种子种皮透性、种胚类型、萌发抑制物以及层积处理、GA3处理条件下种子萌发情况，从而综合判断白头翁种子休眠类型。结果显示，种子浸泡10 h左右吸水饱和，种子百粒重达到峰值。不同浓度过氧化氢处理种子，与ck组相比，种子吸水曲线趋势一致；同一时间下，种子百粒重差异不显著。白头翁种子种壳透性较好，不会阻止种子吸收水分。显微切片观察白头翁种胚类型发现，胚多处于球形胚、心形胚阶段，发育不完全。白头翁种子浸提液对白菜种子有一定的抑制作用，白菜种子发芽初期(12 h、24 h)，不同浓度的浸提液抑制作用不明显；36 h下，高浓度浸提液(80%、100%)处理白菜种子发芽率显著低于ck。随着时间的推移，48 h下白菜种子萌发受到严重抑制，不同浓度浸提液的萌发抑制作用显著。继续延长处理时间，浸提液对白菜种子萌发抑制作用减弱，仅高浓度(80%、100%)作用下,白菜种子发芽率降低。绘制不同时间、不同浸提液浓度处理下，白菜种子发芽率变化趋势曲线发现，浸提液处理组发芽率显著低于ck组，不同浓度的浸提液对白菜种子发芽有抑制作用，白头翁种子内有一定的萌发抑制物。层积处理、GA3处理对白头翁种子萌发潜力具有一定的影响。GA3处理下，种子发芽率、发芽势变化趋势一致，先升后降，150 mg/L GA3处理下白头翁种子发芽率、发芽指数达到最大值。不同层积处理白头翁种子时发现，暖层积+较低温暖层积、暖层积+较低温暖层积+冷层积处理条件下种子发芽率、发芽势、发芽指数表现均较好，且与ck组相比种子发芽时间提前，发芽时滞较短，发芽相对较集中，缩短萌发周期，但实验过程中也发现，层积处理下，白头翁种子更易发霉，种子霉变情况明显。

综上，白头翁种子种皮透性良好，种子成熟时，胚发育不完全，多处于球形、心形阶段，有的种子甚至没有胚。不同浓度的白头翁浸提液可以抑制白菜种子萌发，白头翁种子内有一定的萌发抑制物。一定浓度的GA3处理白头翁种子，种子发芽率、发芽指数显著提高，GA3可以促进白头翁种子萌发。暖层积+较低温暖层积的处理方法可以缩短种子萌发时间，种子萌发相对较集中，萌发周期缩短。故白头翁种子成熟时胚发育不完全，存在萌发抑制物是导致其休眠的主要原因，GA3可以促进白头翁种子萌发，变温层积可以促进种子萌发。初步判断白头翁种子休眠类型为中度简单形态生理休眠。