不同玉竹种质资源多糖含量检测及ISSR分析

何海永， 罗芸芳， 杨雨环， 王金凤， 谭清群， 赵玳琳， 李继业， 吕 红， 赵诗灿

(1.贵州省农业科学院植物保护研究所， 贵阳 550009；2.贵州绿之源农业技术服务有限公司， 贵阳 550009；3.贵州医科大学， 贵阳 550025； 4.遵义师范学院， 贵州 遵义 563006)

玉竹[Polygonatumodoratum(Mill.) Druce]是百合科、黄精属植物，为根状茎，近圆柱形，根茎长且节多，故称玉竹，最早记载于《神农本草经》。是一种药食两用的中药材，在多本医书中均有记载，《本草纲目》中用于治疗风热湿毒，《本草便读》中记载其具有滋阴养肺的功效，现代医学研究发现，玉竹还具有治疗糖尿病、抗肿瘤、增强免疫系统等作用[1-5]；玉竹还可以做成药膳茶饮，如玉竹茶、玉竹粥、玉竹银耳汤等[6]。我国玉竹种质资源非常丰富，市场上主要将玉竹分为栽培品种和野生品种，栽培品种有湘玉竹[7]、西玉竹、东玉竹和海门玉竹[8]4种，调查发现，贵州各个地区均有大量野生玉竹资源分布。玉竹的化学成分主要为甾体皂苷、黄酮、多糖、挥发油、凝集素等[10-14]，其中多糖为主要的生物活性物质，也是关注最多的方向之一。肖岚等[2]在玉竹多糖对在体和离体肺癌肿瘤抑制作用中发现，玉竹多糖具有显著的抗肿瘤作用。单颖等[15]通过50只小鼠模型发现，玉竹多糖可以通过提高超氧化物歧化酶活性来清除自由基，减轻机体的损伤以延缓衰老。季峰等[16]研究发现，玉竹多糖可以提高血清胰岛素水平，达到降血糖的效果；Yan等[17]通过老鼠模型发现玉竹多糖可以降低肠道菌群数从而减轻肥胖。姜晓坤等[18]探索并明确了玉竹多糖微波超声提取法最佳提取条件；仇宏伟[19]对超声波辅酶法提取玉竹多糖进行优化；陈银霞[20]对玉竹水提取醇沉法探索和优化；Yong[21]等对玉竹多糖碱提取法进行探索和优化。

在玉竹遗传分析方面，主要采取分子标记技术建立系统发育树来进行分类[22]，潘清平等[23]探索发现，ISSR分子标记法可用于玉竹的品种鉴定和优良品种选育研究；周钰等[24]研究发现，微卫星标记在玉竹遗传多样性和遗传结构评价中具有较高的潜在价值。路放[25]对8个不同品种的玉竹采用ISSR分子标记技术可以从分子水平检测出玉竹的差异，同时也证明不同产地玉竹具有较丰富的遗传多样性；郝久程等[26]研究发现，海岛种群的遗传多样性高于大陆种群，说明独立环境下的遗传变异现象比开放环境下更为明显；卜静等[27]利用ISSR法对12个不同地区野生玉竹种质资源的遗传结构和亲缘性进行分析，发现不同产地玉竹有较高的遗传多样性，各产地个体差异较大可能与气候环境相关；周晔等[28]用ISSR法鉴别中药玉竹和小玉竹，为玉竹种质资源的鉴定与区别奠定基础。但关于贵州不同地区及周边省份的野生玉竹地方资源多糖含量和遗传多样性研究相对较少。 本试验以来自贵州省不同地区的13个野生玉竹种质资源和4个其他省份的玉竹种质资源为材料，进行不同玉竹种质资源的多糖含量和群体遗传结构特点研究，以期为玉竹种质资源的发掘、保护和利用提供参考。

1 材料和方法

1.1 试验材料

17个供试玉竹种质资源中，有13个样品来自贵州；2个来在四川省；1个来自湖北省；1个来自河南省，样品具体来源详见表1。2020年3月采集各地玉竹种质资源的根茎，带土进行包装，用冰袋保存运回实验室，再去除样品的须根、茎杆后，将根茎洗净后保存于-80 ℃超低温冰箱中备用，记录采集地点。

表1 玉竹种质资源的来源Table 1 Source of Polygonatum odoratum germplasm resources

试验材料包括植物基因组DNA提取试剂盒(离心柱形)、2×TaqPCR Master Mix、核酸染料，均购自天根生化科技(北京)有限公司、6×Loading buffer(蓝色)购自北京擎科新业生物技术有限公司、琼脂糖(Agarose)和核酸提取液(24∶1)分别购自BioWest和Solarbio公司、无水乙醇购自重庆川东化工(集团)有限公司。

1.2 试验器材

试验器材包括TGrinder第三代变速组织研磨器套装(天根生化科技(北京)有限公司)、thermo scientific/micro 17离心机(Denmark)、100-024 VAC PCR仪(新加坡BIO-RAD公司)、DYY-6 C型电泳仪(北京六一仪器厂)、凝胶成像系统BIO-RAD(美国BIO-RAD公司)、XK-1200型手掌式医用离心机(江苏新康医疗器械有限公司)、RADWAG天平(上海精密仪器仪表有限公司)、立式压力灭菌锅(上海博讯实业有限公司医疗设备厂)、制冰机IMS-30(常熟市圣海电器有限公司)、电热恒温鼓风干燥箱(宁波江南仪器厂)、超纯水机(四川沃特尔水处理设备有限公司)、MiniT-H 2 C三联多用途金属浴(成都浩康科技有限公司)、电子天平(奥豪斯仪器(上海)有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1玉竹多糖含量检测

将2020年3月保存备用的玉竹根茎在恒温干燥鼓风箱内60 ℃烘干3 d后送往遵义市精科信检测有限公司，根据《中华人民共和国药典》2020年第四版规定的相关检测方法，在温度为15 ℃、湿度为45%的条件下，采用紫外-分光光度法进行多糖含量的检测。

1.3.2玉竹DNA提取

取玉竹新鲜组织约100 mg，加入液氮充分研磨，将研磨好的粉末迅速转移到预先装有700 μL 65 ℃预热缓冲液GP 1的离心管中(实验前在预热的GP 1中加入巯基乙醇)，迅速颠倒混匀后，将离心管放在65 ℃水浴锅中水浴20 min，水浴过程中颠倒离心管数次以混合样品；再加入700 μL氯仿，充分混匀，12 000 r/min离心5 min；将所得上层水相溶液转入一个新的离心管中，加入700 μL缓冲液GP 2，充分混匀；将混匀的液体转入吸附柱CB 3中，12 000 r/min离心30 s，弃掉废液；向吸附柱CB 3中加入500 μL缓冲液GD(使用前先加入无水乙醇)，12 000 r/min离30 s，倒掉废液，将吸附柱CB 3放入收集管中；再向吸附柱CB 3中加入600 μL漂洗液PW(使用前先加入无水乙醇)，12 000 r/min离心30 s，倒掉废液，将吸附柱CB 3放入收集管中(重复操作一次)；将吸附柱CB 3放回收集管中12 000 r/min离心2 min，倒掉废液。将吸附柱CB 3置于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残余的漂洗液；将吸附柱CB 3转入一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位悬空滴加100 μL洗脱缓冲液TE，室温放置2～5 min，12 000 r/min离心2 min，将溶液收集到离心管中。

1.3.3引物筛选

试验所用引物选用哥伦比亚大学公布的100条通用引物序列中的41条，由擎科生物公司合成。选用4个凝胶条带清晰的DNA样品对引物进行筛选，共筛选出11条较清晰的引物(表2)。

表2 ISSR扩增引物序列Table 2 ISSR amplification primer sequence

1.3.4ISSR-PCR扩增

根据所选用的2×TaqPCR Master Mix确定PCR反应体系和扩增程序，反应体系为25 μL：mix 12.5 μL，模板1 μL，引物1 μL，双蒸水10.5 μL。反应程序的退火温度根据引物的Tm值设定，94 ℃预变性3 min；94 ℃变性15 s，50 ℃退火20 s，72 ℃延伸60 s，变性到延伸进行34个循环，72 ℃再延伸7 min，最后4 ℃保持。

1.3.5凝胶电泳

取PCR产物与2.0%的琼脂糖凝胶于120 V电泳85 min，制胶时加入TS-GelRed核酸凝胶染料用于对电泳条带染色。电泳结束后，用凝胶成像仪在紫外条件观察、拍照。

1.3.6ISSR分析

将有条带出现的显性位点用“1”表示，无条带出现的隐形位点用“0”表示，建立“1”和“0”的数据矩阵，采用NTSYS 2.10聚类软件计算遗传相似系数，再根据遗传相似系数利用UPGMA法建立系统发育树。

2 结果与分析

2.1 不同来源玉竹多糖含量

检测结果(表3)显示，17份玉竹多糖含量分别为9.33%、9.31%、9.18%、9.05%、8.37%、8.35%、8.33%、8.28%、7.74%、7.67%、6.43%、6.41%、6.38%、6.31%、6.25%、6.24%和6.12%。参试材料的多糖含量均高于《中华人民共和国药典》2020版四部所规定的药用玉竹多糖含量(不得低于6%)。玉竹多糖含量最高的是来自四川省泸州市叙永县的13号(9.33%)；最低的是来自贵州省遵义市湄潭县茅坪镇的15号(6.12%)。17份玉竹多糖含量平均值为7.63%，其中2号、3号、4号、6号、7号、8号、11号、12号、13号和14号均高于平均值，表明这几份玉竹种质资源的品质相对较好。

表3 不同玉竹种质资源的多糖含量Table 3 Polysaccharide content of different germplasm resources of Polygonatum odoratum

对不同玉竹种质资源多糖含量进行Duncan新复极差分析，结果表明，在5%显著水平下，不同玉竹种质资源之间的多糖含量均呈显著性差异。在1%显著水平下，5号贵州遵义绥阳玉竹和1号贵州毕节七星关玉竹，多糖含量相差不大，二者之间差异不显著，其余各个品种差异显著。

2.2 多态位点分析

将初筛的11条引物分别与17个样品模板进行PCR扩增，筛选出条带多且清晰的2条引物(表4)，将筛选出来的2条引物再次与17个模板进行PCR扩增。对筛选出的2个ISSR引物的PCR产物用2%的琼脂糖凝胶进行85 min的电泳，并用凝胶电泳成像系统在紫外条件下观察并拍照保存。如图1所示，2条引物共扩增出27组条带，其中27组为多态性条带，多态性条带比例为100%，扩增片段均在200～3 000 bp之间。同一引物对不同来源的玉竹样品的扩增条带不完全相同，说明这两条引物能较好地反映17个样品的多态性。

表4 ISSR引物扩增条带数Table 4 Number of bands amplified by ISSR primers

将引物单独使用时，能将一些玉竹样本与其他玉竹样本区分开，如图1B所示，4号玉竹在1 200 bp处与其他玉竹有区别；8号玉竹在500 bp处与其他玉竹有区别。将扩增出的条带放在一起对比时，也能看出玉竹之间的相似和区别，如图1 A，7号玉竹与5号、11号、12号在250 bp处都有条带，与5号、6号、11号、12号、15号、17号玉竹在500 bp处都有条带，与1号、2号、4号、5号、6号、7号、8号、9号、11号、12号、13号、15号玉竹在1 200 bp处都有条带，这些条带显示7号玉竹与其他玉竹在多态性上存在差异。同样，在图1 B中6号玉竹和7号玉竹在条带的多态位点上相同，推测6号玉竹和7号玉竹的遗传背景可能相同。

图1 引物UBC 844(A)和引物UBC 845(B)电泳图 Fig.1 The electrophoresis diagram of primer UBC 844(A), the electrophoresis diagram of primer UBC 845(B)

2.3 遗传相似性分析

使用NTSYSps 2.10 e软件对17份玉竹种质资源进行聚类分析，在0.56至0.63处分为三大类。结果(图2)表明，第Ⅰ类群含有10个品种，为1号、2号、3号、9号、10号、13号、15号、16号、17号，占总数的58.82%，7个品种来自贵州，其余3个分别来自四川和湖北。其中亲缘性最近的1号和15号分别来自贵州省毕节市七星关区、贵州省毕节市纳雍县；2号和13号分别来自四川省雅安市石棉县、四川省泸州市叙永县；9号和17号分别来自贵州省毕节市大方县、贵州省贵阳市花溪区。第Ⅱ类群含5个品种，为5号、6号、7号、11号、12号、14号，占总数的29.41%，均来自贵州。亲缘性最近的11号、12号分别来自贵州省贵阳市白云区和贵州省黔西南州兴义市万峰林镇。第Ⅲ类群只有1个品种为4号，占总数的5.88%，来自河南省洛阳市蒿县。

图2 引物UBC 845系统发育树 Fig.2 The phylogenetic tree of primer UBC 845

用NTSYS 2.10软件分析ISSR标记的0，1数据矩阵，计算出17份玉竹的遗传相似系数在0.163 8～0.923 0之间(表6)，平均遗传相似系数为0.639 6，说明17份玉竹之间存在遗传分化。其中1号与15号，2号与13、15号，10号与17号，11号与12号，13号与16号，15号与16号遗传相似系数最大为0.923 0，说明亲缘性最近。6号与8号的遗传相似系数最小，为0.163 8，说明亲缘性最远。

表6 不同玉竹种质资源遗传相似系数Table 6 Genetic similarity coefficients of different Polygonatum odoratum germplasm resources

3 讨论与结论

参试的17份玉竹的多糖含量范围为6.12%～9.33%，玉竹多糖含量极差分析表明，不同来源的玉竹多糖含量之间绝大多数都存在显著差异，其中在1%的显著水平下只有1号和5号玉竹的多糖含量没有显著差异。不同的玉竹多糖提取方法所检测的多糖含量不同，本次玉竹检测所用方法为水提醇法，并非玉竹多糖提取最高效的方法；同一种方法对不同产地的玉竹的提取效率也不同。检测结果表明，不同地区的玉竹多糖含量有所区别，贵州省毕节市大方县的6号玉竹、四川省泸州市叙永县的13号玉竹、湖北省宜昌市五峰土家族自治县的3号玉竹、河南省洛阳市蒿县的4号玉竹的多糖含量分别为9.31%、9.33%、8.28%、9.05%，具有明显的差异。同一省份不同地区的玉竹多糖含量也有一定的差异，贵州省毕节市大方县的6号玉竹、贵阳市的12号玉竹、安顺市的14号玉竹的多糖含量分别为9.31%、8.37%、9.18%，也具有显著的差异。同一省份同一地区的玉竹多糖含量也有区别，贵州省毕节市大方县的6号、8号和9号玉竹的多糖含量分别为9.31%、8.35%和6.41%，差异也同样明显。总之，来自不同省份、同一省份的不同地区或同一地区的不同玉竹种质资源之间的多糖含量都有显著差异，这与刘玉凤等[29]的研究结果相一致。

参试玉竹的平均遗传相似系数为0.636 9，多态性条带占比为100%，表明不同玉竹种质资源具有较高的遗传相似性，同时具有较丰富的遗传多样性。来自同一地区的玉竹大多数会聚为一类，1号与15号、10号与17号、11号与12号、15号与16号都来自贵州省、2号和13来自四川省，其遗传相似系数均为0.923 0，亲缘性最近。但也有例外，四川省13号与贵州省的16号，遗传相似系数为0.923 0，亲缘性也为最近。系统发育树将玉竹种质资源在遗传相似系数0.56处分为三类，除了第Ⅰ类群中的有省份混杂外，其余两类都是来在同一省份。就系统发育树而言，亲缘性最近的都是来自同一省份的玉竹种质资源。这与卜静等[27]在不同产地野生玉竹种质资源多样性与亲缘关系的ISSR分析中所得的结果相似。因此，玉竹的遗传亲缘性与生长地区之间有一定的相关性，也可能与人类活动导致玉竹种质资源的迁移有一定的关系。