基于生物信息学分析骨质疏松症与炎症性肠病的相关性

常裕绅，张子鸣，李振宇，安 娟，何瀚威，匡建军

骨质疏松症(osteoporosis, OP)是一种系统性代谢性骨病，其特点是骨量低、骨微结构被破坏、同时成骨不全增加，容易发生骨折[1]。随着我国人口老龄化日益严重， OP已成为威胁中老年人群的最大健康问题，并且骨质疏松性骨折相关的医疗活动给社会卫生保健系统带来巨大的经济负担。目前对于OP相关疾病的研究主要集中在内分泌、免疫、消化系统领域，其中炎症性肠病(inflammatory bowel disease, IBD)是不容忽视的重要一环。IBD是一种慢性肠道炎症性疾病，主要包括溃疡性结肠炎和Crohn病。有报道，IBD患者同时患有OP的概率为18%～42%，IBD骨质疏松患者骨折风险比正常人高1.4倍[2]。因此二者在临床上包括发病机制、致病因素、易发人群的内在关联性受到越来越多的关注。有研究显示，IBD相关OP的发生发展与众多因素关系密切，最常见的是胃肠道持续慢性感染、肠道菌群失调、钙和维生素D吸收障碍等[3-4]，然而，其发病机制至今尚未明确，很少有IBD患者能及早接受适当的抗骨质疏松治疗。因此本研究通过生物信息学方法分析并阐述OP与IBD的基因相关性，并为相关治疗药物的研发提供依据。

1 材料与方法

1.1数据收集 从DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM数据库分别以“Osteoporosis”和“Inflammatory bowel disease”为关键词查询疾病相关靶点。其中DisGeNET筛选评分≥0.1，GeneCards筛选相关度≥10。整合各数据库的基因后进行去重，去重后的基因通过R 4.2.0软件“RSQLite”“BiocManager”包转换成entrez ID，获得疾病两组基因靶点。

1.2蛋白相互作用(PPI)网络的构建和关键基因的筛选 将两组靶点导入在线网站Venny 2.1.0取交集绘制韦恩图，得到OP与IBD间的共病靶点，将共病靶点借助string平台(https://string-db.org/)制作PPI网络，以最低交互分数0.7筛选，保存.tsv文件，将表格数据导入Cytoscape 3.8.2软件实现网络可视化，应用cytoHubba插件中的最大团体中心(MCC)算法，从而获得调控OP与IBD的关键基因。

1.3GO功能及KEGG通路富集分析 将“1.2”中共病靶点通过R软件的“DOSE”“clusterProfiler”“pathview”程序包，筛选条件为P<0.05，Q<0.05，进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。

1.4关键基因的miRNA基因网络构建 将获得的关键基因借助网络分析工具Networkanalyst预测关联miRNA，并绘制miRNA基因关系网络。

2 结果

2.1疾病基因搜集 经DisGeNET、TTD、GeneCards及OMIM疾病数据库检索，整合各数据库的重复靶点，获得与“OP”和“IBD”相关靶点分别为1779和2779个，可见每种疾病的作用靶点庞大，调控机制复杂。

2.2PPI的构建和关键基因筛选 通过韦恩图获得共病靶点869个(23.6%)，说明OP与IBD间确实存在相似作用机制。依托string数据库构建PPI网络图，以“high confidence(0.700)”为筛选标准得到的网络图中具有756个节点，8353条相互作用连线，说明靶点间协同发生诸多调控作用。通过Cytoscape中cytoHubba插件分析PPI网络，根据MCC算法，认为前10个基因是关键基因，以颜色变化代表基因的关键程度，分别为IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13。见图1。

2.3GO功能及KEGG通路富集分析 将共病靶基因导入R软件，获得4278项GO富集结果及173条KEGG信号通路。取各富集结果前10个条目以气泡图显示，见图2。

图2 OP与IBD共病靶基因GO功能及KEGG通路富集分析气泡图

2.4关键基因miRNA网络的构建 Networkanalyst预测关键基因关联的miRNA，通过Cytoscape 3.8.2软件构建了由83个节点和104条边组成的基因-miRNA网络(图3)。IL6、IL10、CXCL8能与miR-106a-5p和miR-98-5p相互作用，miR-24-3p能与TNF、IL4、IFNG、IL1B基因相互作用，miR-335-5p能与IL6、CXCL8、IL4、IL17A基因相互作用。

图3 OP与IBD关键基因-miRNA网络

3 讨论

OP是一种全身性骨病，破骨细胞骨吸收超过成骨细胞骨形成导致骨量减少是OP发生的关键[5]。目前研究发现一些胃肠道疾病与骨质减少关系密切，包括IBD、乳糜泻和结直肠癌。IBD是OP一大诱发因素，到目前为止，IBD和OP间的相关机制尚不完全清楚。因此，探索IBD和OP的分子机制用于早期识别与干预具有重要的临床意义。

本研究采用生物信息学方法阐述IBD与OP间分子机制的相关性。PPI网络分析得到了IL6、IL10、IL17A、TNF、CSF2、IL4、IL1B、CXCL8、IFNG、IL13这10个核心靶点，IBD与炎性因子的关系已有报道，IL6、IL1B、IL17A和TNF-α都是促炎因子，而IFN-γ、IL10、IL4、IL13为抗炎因子，是由巨噬细胞、T淋巴细胞和单核细胞等免疫细胞合成和分泌，单独或共同参与自身免疫性和炎症性疾病。

有研究发现，IL6、IL1、IL17、TNF-α和NF-κB在IBD患者肠道黏膜中大量表达，多种促炎因子不断发生级联反应，进一步加重肠组织微循环障碍[4]。抗TNF-α制剂现已纳入治疗IBD的常用药物。有研究表明，抗TNF-α制剂可以改善IBD患者骨代谢及骨密度[6]。此外，OP患者体内IL1、IL6、TNF-α和IL17水平较正常人群也显著升高，促炎因子可通过促进NF-κB受体活化因子(RANK)和(或)通过抑制骨保护素(OPG)的表达增强其对NF-κB受体活化因子配体(RANKL)的敏感性[7]，增加破骨细胞活性，促进骨吸收，打破骨代谢平衡来加重OP，而IFN-γ、IL10、IL4等抗炎因子能够显著抑制破骨细胞生成，抑制骨吸收[8]。RANK-RANKL-OPG轴是OP的关键调节通路，这些细胞因子通过该途径共同发挥骨吸收和骨形成的作用。ZHANG等[9]研究发现，健脾清肠补肾煎剂可通过抑制结肠黏膜炎症，促进黏膜愈合，抑制该信号轴的激活达到抗骨质疏松的目的。CSF是集落刺激因子，可促进巨噬细胞、中性粒细胞、嗜酸粒细胞、肠上皮细胞和树突细胞的活化[10]，其中粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)可以改善肠黏膜损伤和炎症反应，调节肠道免疫功能，有研究显示，缺乏GM-CSF的小鼠更易出现非甾体抗炎药导致的肠道炎症反应[11]。同时GM-CSF在破骨细胞生成和发育方面起关键作用，可以结合破骨细胞前体上的受体(c-Fms)更有利于破骨细胞的存活与成熟[8]。CXCL8又称IL8，是一种趋化因子，主要由巨噬细胞、上皮细胞和肿瘤细胞分泌，其可以诱导中性粒细胞随着肠上皮细胞IL8表达的升高而被吸引到肠黏膜的炎症部位积聚和活化，加重炎症反应[12]。IL8在骨代谢方面还具有双重效应，一方面是通过促进甲状旁腺激素的生成刺激破骨细胞分化，增加骨吸收，有研究发现绝经后OP患者体内血清IL8水平变化与骨密度呈负相关[13]。另一方面，也有学者认为IL8能够通过缺氧诱导因子-1α通路促进骨形成从而抑制OP进程[14]。

GO功能和KEGG通路富集分析能够使共表达基因间的作用关系更加清晰。GO分析主要富集于细胞因子生成的调节、炎性因子的调节和信号传导受体激活剂活性方面，说明OP与IBD间的关系与免疫和炎症密切相关，这与大部分研究结果一致。KEGG富集主要与细胞因子-细胞因子受体相互作用、PI3K-Akt、脂质和动脉粥样硬化、Th17细胞分化等特异性信号通路有关。而这些通路作用途径不仅参与免疫炎症过程，而且还与动脉粥样硬化相关的心血管疾病有关[15]，这些结果或许能提供一个新观点:IBD骨质疏松患者也更容易患有心血管疾病。

对核心靶点预测相关miRNA发现，miR-98-5p、miR-335-5p、miR-24-3p和miR-106a-5p可能对于IBD诱发OP的诊治具有潜在价值。有研究表明，miR-98-5p通过靶向酪蛋白激酶2相互作用蛋白-1促进小鼠胚胎成骨细胞前体细胞向成骨细胞分化[16]，同时miR-98-5p的下调能够增加Trib1蛋白表达改变了巨噬细胞对M2表型的极化，从而缓解了IBD症状[17]。而miR-335-5p具有调节小鼠间充质干细胞软骨分化和促进软骨生成的能力，同时通过靶向HBP1基因和促进软骨细胞凋亡来介导骨关节炎的发病[18]。且miR-335-5p调节连接IBD和结肠癌促炎因子的表达，从而作为结肠癌的生物标志物[19]。miR-24-3p可与lncRNA:LEF1-AS1相互作用，通过调节Wnt/β-catenin和TGF-β/BMP途径来介导成骨[20]。同时miR-24-3p还是2型糖尿病的临床生物标志物[21]，而诸多研究表明2型糖尿病可能损害骨基质形成和生化能力，从而降低骨骼韧性，引发骨质疏松，增加骨折风险[22-24]。有研究表明，miR-106a-5p通过介导GAS5来控制和维持糖皮质激素敏感性和耐药性，从而达到抗炎的目的[25]，且miR-106a-5p能够作为阿尔兹海默症(AD)与帕金森症的临床生物标志物[26]。有学者认为OP与AD作为老年常见疾病有着共通的关系[27]，存在共同致病因素并促进两病的发展[28-29]。目前研究表明，miR-98-5p、miR-335-5p与OP及IBD有关，证实其能够影响OP及IBD的发生及发展，或许通过进一步的研究能够发现这两种miRNA是改善OP与IBD的药物或治疗手段。而miR-24-3p与miR-106a-5p目前与OP及IBD具有一定的关联但缺乏强相关性的文献报道，因此具有潜在的研究价值。

综上所述，本研究通过生物信息学方法探讨了OP与IBD共病调控的关键基因，发现炎症通路的激活或许是两病的共同病因，同时筛选了关键靶向的4个miRNA可能作为治疗IBD和OP的新手段。