表观遗传调控及其在支气管哮喘中的作用机制研究进展

杨 漾 苏 畅 张秋雁 黄舒淳 匡慧芳

1.湖南中医药大学中医学院，湖南长沙 410208；2.湖南中医药大学湘杏学院，湖南长沙 410208；3.湖南中医药大学校医院，湖南长沙 410208

支气管哮喘（简称“哮喘”）是一种以气道高反应性和可逆性的气流受限为基本特征的慢性炎症性疾病，由多种细胞（嗜酸性粒细胞、肥大细胞等）和细胞组分参与。中国最新哮喘流行病学调查结果显示，我国成人（≥20 岁）哮喘患者超过4 000 万[1]。环境因素与哮喘的发生密切相关，研究已证实接触过敏原、空气污染物、病毒感染等环境因素在哮喘发病过程中扮演着重要角色[2]。表观遗传学是指除基因序列改变之外，基因功能可逆的、可遗传的改变，主要有DNA 甲基化、组蛋白甲基化、组蛋白乙酰化、微小RNA（microRNA，miRNA）的改变等。近年来，越来越多的证据表明，环境因素影响哮喘的发病可能通过改变表观遗传学机制来实现。在细胞分化和发育过程中，表观遗传变化与细胞的程序性基因表达及可塑性有关，使细胞重新编程并对环境作出改变。总之，表观遗传机制可从细胞水平上整合遗传与环境因素，阐明哮喘发生的表观遗传调控，有助于阐明哮喘发生的病理基础。

1 DNA 甲基化

组蛋白甲基化包括写入、擦除和读取3 个过程，分别由相关的甲基转移酶、去甲基化酶、甲基化识别蛋白主导。表观基因组关联分析发现，哮喘患者与正常人群的DNA 序列存在大量差异化的甲基化位点，且与哮喘效应细胞（如淋巴细胞、气道内皮细胞及平滑肌细胞）和哮喘相关基因FOXP3、γ 干扰素（interferonγ，IFN-γ）及白细胞介素4（interleukin，IL-4）等的表达密切相关[3]。然而，现有研究多针对哮喘患者的全血细胞或外周血单核细胞（包含淋巴细胞和单核细胞），存在的问题就是如果表观遗传标记特定的组织/细胞类型，且带有标记的细胞在病例组和对照组间以不同的比例存在，这种分析可能会出现明显偏差[4]。因此，研究者开始对单一细胞群体（如T/B 淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、单核细胞、气道上皮细胞以及气道平滑肌细胞等）进行甲基化差异研究。研究发现，哮喘患者嗜酸性粒细胞中的胶原蛋白相关基因、视网膜母细胞瘤基因1、SLC25A33 等与气道功能和免疫系统密切相关的基因存在明显的低甲基化状态，而单核/巨噬细胞中的神经调节蛋白1、SYNM、TBX5 及序列相似家族19 成员A4 等则显示出明显的高甲基化状态[5]；气道上皮细胞中IL-33[促进2 型辅助型T 细胞（Th2）分化发育]启动子区域的甲基化是明显减少的，其IL-33分泌明显增多[6]；转录激活因子5 基因鸟嘌呤岛的高甲基化则导致转录激活因子5 表达明显降低[7]。

DNA 甲基化也参与T 细胞亚群的分化与发育，而Th0 细胞向Th2 细胞分化是哮喘发病的重要环节。研究发现，哮喘患者和非哮喘患者的IL-4 和IFN-γ基因存在甲基化差异，IL-4 基因在幼稚T 细胞及Th1细胞中通常为高甲基化[8]，过敏源可以诱导Th0 细胞IL-4 基因启动子区域的去甲基化而促进IL-4 表达，促使Th0 细胞向Th2 细胞分化，引起炎症因子的进一步表达，促进哮喘的发生发展[9]。早期营养不良可增加哮喘的易感性，其机制可能与诱导Th0 细胞中Th2 相关细胞因子位点的低甲基化，引起Th0 细胞向Th2 细胞分化有关[10]。转录因子FOXP3 调控原始T 细胞向调节性T 细胞（Treg）分化发育，其启动子区域鸟嘌呤岛的甲基化可以影响Treg 细胞的形成和活性，驱动FOXP3 表达的cAMP 效应元件结合蛋白/录激活因子结合位点附近鸟嘌呤岛的甲基化与FOXP3 表达呈负相关，而下调DNA 甲基转移酶1 或使用DNA 甲基化酶抑制剂可以抑制鸟嘌呤甲基化而促进FOXP3 的表达[11]。

2 组蛋白修饰

核小体是由DNA 和组蛋白形成的染色质基本结构单位，其通过物理阻隔和改变染色体构象阻碍转录因子与DNA 的结合，可抑制基因表达[12]。然而，组蛋白的翻译后修饰，如乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、ADP 核糖化和脱胺化等可改变染色质的疏松程度和可及性，影响DNA 转录[13]。其中，组蛋白的乙酰化常常导致基因表达上调，而组蛋白的甲基化则有激活或抑制基因转录的双重作用，取决于修饰氨基酸的位置、状态等。

2.1 组蛋白甲基化

组蛋白甲基化修饰就是在组蛋白甲基转移酶的作用下，以硫腺苷甲硫氨酸为甲基供体，在组蛋白的赖氨酸发生单、双甚至三甲基化或者精氨酸单或双（对称或非对称）甲基化（如H3K4me3 表示组蛋白H3 的第4 位赖氨酸的三甲基化，以此类推）[14]。不同组织和细胞的组蛋白甲基化修饰各有不同。气道平滑肌细胞（airway smooth muscle cells，ASMCs）在哮喘病理过程的发展和维持中（炎症、重塑和收缩/高反应性）发挥着重要作用，其通过分泌包括组胺、类前列腺素、白三烯、细胞因子、趋化因子和内皮素等多种炎症因子参与哮喘的发生发展[15]。哮喘患者的肺组织及分离的ASMCs中PRMTs 明显增高，抑制PRMTs 可减少ASMCs 的增殖、迁移、胶原沉积和细胞外基质的形成[16]。哮喘患者ASMCs 的血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）基因启动子区域缺乏G9A 和SUV39H1等转录抑制复合物的形成，反而形成由H3K4me3、RNA 聚合酶Ⅱ、肿瘤血管生长因子和高水平的Sp1 组成的转录激活复合物，使VEGF 的表达上调，促进哮喘的发生发展[17]。单核细胞来源的树突状细胞（dendritic cells，DCs）受到过敏原刺激后会活化，通过抗原提呈并分泌Th2 型细胞因子刺激Th0 细胞向Th2 细胞分化，H3K4me3 及H3K27me3对DCs 的活化及其在炎症状态下的基因表达发挥重要作用[18]。

Th0 细胞分化为Th 亚群是哮喘的典型特征，而T细胞的分化发育也受组蛋白甲基化的表观遗传调控[19]。研究发现，H3K4me3 与启动子激活相关，H3K4me1/2与基因增强子相关，H3K36me3 在激活基因的转录区域被发现，而H3K9me3 及H3K27me3 被发现与基因表达沉默相关[20]。H3K27me3 水平升高与基因表达抑制相关，这些基因包括Th2 细胞中的IFN-γ 和Tbx21，Th1 细胞中的IL-4 和Gata3[21]。Zeste 基因增强子同源物2（Ezh2）是H3K27 位点的甲基转移酶，Ezh2形成的PRC2 复合体可直接结合Tbx21 和Gata3 基因座，使Tbx21 和Gata3 在Th1 和Th2 细胞分化中正确表达，并伴有大量的H3K27me3[22]。Ezh2 通过调控H3K27me3 对IL-4、IL-13 等基因的转录沉默起重要作用[22]，其缺乏会导致IFN-γ 的分泌减少及Th2 型细胞因子的增加，加重哮喘的病理过程[23]。

2.2 组蛋白乙酰化

与组蛋白甲基化机制相似，组蛋白的乙酰化也存在写入、擦除和读取的过程，分别受组蛋白乙酰转移酶（histone acetyltransferase，HATs）、组蛋白脱乙酰酶（histone deacetylase，HDACs）和Bromodomains 调控。研究表明，哮喘患者中组蛋白H4 的乙酰化上调与多种炎症基因表达上调一致，支气管组织中HATs 的活性上调，而HDACs（尤其是HDAC2）活性降低，其所导致的组蛋白乙酰化改变与气道上皮细胞和ASMCs 中多种促炎因子（嗜酸性粒细胞趋化因子、IL-8/10 等）的生成密切相关[24]。趋化因子是吸引白细胞移行到感染部位的一些低分子量蛋白，包括IL-8、肿瘤坏死因子-α、内皮素-1 和IL-1β 等。其中，哮喘患者ASMCs 中由p300 介导其启动子区域H3K18 的乙酰化导致IL-8大量分泌[25]；肿瘤坏死因子-α 可以诱导ASMCs 中嗜酸性粒细胞趋化因子基因启动子区域H4 赖氨酸5和12 的乙酰化，促进其基因转录，β2 肾上腺素受体激动剂和糖皮质激素可通过逆转其启动子区域H4的乙酰化而发挥治疗作用[26]。需要注意的是，其他非组蛋白成分，如GATA3 和NF-κB 的p65 组分，也可以成为乙酰化和去乙酰化的靶点，例如组蛋白乙酰基转移酶CBP 可乙酰化p65 上的特定赖氨酸残基，增加其与DNA 的结合，引起转录激活，而HDACs 则反转这个程，HDAC1 和HDAC2 能够将乙酰化的NF-κB去乙酰化，并促进其与细胞核内IκB-α 结合，从而促进其转位至细胞质中并终止NF-κB的活性[27]。

组蛋白的乙酰化也参与了Th0 细胞的分化。在Th1 和Th2 细胞的分化发育中，分别观察到Th1 和Th2细胞因子基因座组蛋白乙酰化的增加[28]。在Th2 型细胞分化发育中，GATA3 通过其保守的GATA3 响应元件与靶基因DNA 结合并与CBP/p300 及RNA聚合酶Ⅱ形成具有组蛋白乙酰转移酶活性的转录复合物，促进IL-4/13 的转录[29]。相反，组蛋白去乙酰化参与基因表达的负调控，HDACs 也与Th0 细胞的分化有关。如HDAC1 缺失能促进Th2 型细胞分化和Th2 型细胞因子的产生，HDAC6 和沉默信息调节因子2 相关酶1也可以通过去乙酰化和降低Foxp3 的表达来调节Treg 的功能[30]。

3 非编码RNA

非编码RNA 包括长链非编码RNA（lncRNAs）、MicroRNAs、内源性小干扰RNA（endo-siRNAs）等多种类型，它们不编码蛋白质，但可以调控蛋白质编码基因的转录、翻译及其稳定性[31]。其中，lncRNA 参与调控多种免疫细胞如树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、T 淋巴细胞的功能，同时通过多种机制调节气道平滑肌细胞的增殖和迁移，在哮喘病理过程中发挥着重要作用[32-35]。例如，lncRNA PTPRE-AS1 在IL-4刺激的巨噬细胞中选择性表达，敲减PTPRE-AS1 可通过丝裂原活化蛋白激酶/细胞外蛋白调节激酶途径促进M2 巨噬细胞激活[36]。LncRNA MEG3 通过靶向microRNA-17/视黄酸相关的孤儿受体γt 调节哮喘患者的Treg/Th17 平衡[35]。LncRNA GAS5 通过控制miR-10a/脑源性神经营养因子信号通路促进哮喘患者气道平滑肌细胞增殖[37]。

miRNA 参与多种哮喘相关细胞的活化、增殖、迁移、气道炎症、气道平滑肌的过度收缩和气道重塑等过程。miRNA-155 在哮喘患者的上皮和气道平滑肌细胞中明显上调，下调或敲除miRNA-155 可减少Th2 型细胞/嗜酸性粒细胞浸润和细胞因子/黏液的分泌[38]。miR-24 和miR-27 则可通过调节IL-4 的分泌调节T 细胞的分化发育而抑制气道炎症[39]。其次，多个miRNA 参与调控ASCMs 的功能，如miR-143-3p、miR-145 等调控其生物合成，miR-145、miR-133a 等调控其收缩；miR-150、miR-139-5p 等调控其增殖[40]。

4 小结

表观遗传修饰如DNA 甲基化和组蛋白的翻译后修饰调控哮喘相关基因的表达及哮喘相关细胞的功能，在哮喘发生发展中发挥着重要作用。但基因表达是一个极其精密的过程，受到多种形式的精密调控，DNA 甲基化、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA 等多种表观遗传形式之间也存在着极其复杂的交互作用，共同形成基因表达的表观遗传调控网络，仍需更深入的研究来进一步阐明。其次，检测痰液或血液中miRNA 水平有望成为诊断哮喘的生物标志物，值得进一步研究。此外，哮喘的表观遗传学研究虽已取得长足的进展，但将表观遗传学用于哮喘治疗的研究才刚刚起步。目前，研究者开始针对表观遗传学进行药物研究，如针对HDACs 的抑制剂、miRNA 的靶向药物等。然而，这些药物因缺乏特异性而不可避免地存在着副作用，高选择性药物的研发将是未来研究的重点问题。