竹子快速生长过程中糖分代谢与运输机制研究

刘 毅 邓 琳 李鹏程 裴佳龙 唐国建 赵景威 王曙光,3*

(1 云南省高校丛生竹生物学重点实验室 西南林业大学生命科学学院 昆明 650224；2 国家林草局科技创新团队 西南林业大学生命科学学院 昆明 650224；3 竹藤科学研究院 西南林业大学林学院 昆明 650224)

竹子是世界上生长最快的植物，竹秆可以在一个生长季节内完成高生长，没有其他植物具有可比的生物量产量。有关竹子快速生长的机制是一个热门的研究课题。目前大多数的研究都集中在竹子快速生长分子调控机制上，筛选相关的基因，但忽略了竹子在快速生长过程中关键的解剖与生理学特征。

在植物的营养组织中，可溶性糖和淀粉是碳水化合物储存的2种主要形式。竹子与其他自养植物一样，蔗糖、葡萄糖和果糖是可溶性碳水化合物的主要构成组分，与淀粉一起构成参与生理代谢和渗透调节等过程的非结构性碳水化合物。在竹笋快速生长过程中，由于竹笋生长迅速，内源可溶性糖和淀粉的消耗是巨大的。竹子几乎将其叶、枝、秆和地下竹鞭的所有非结构碳水化合物运输到竹笋上。尽管一些研究人员已经将重点放在竹笋快速生长过程中碳水化合物的变化上，但很少有关于蔗糖和淀粉代谢的研究。蔗糖作为叶片光合作用的主要终产物之一，在植物生长发育中起着核心作用。蔗糖在叶片细胞质中合成，并装载到韧皮部运输到库组织。韧皮部卸载有共质体卸载和质外体卸载2种途径。但在同化物转运中，共质体运输途径占主导地位，因为它具有较高的转运能力，且对同化物转运的阻力较小。

为了进一步深入研究竹子快速生长过程中的糖分代谢与转运机制，课题组系统研究了云南箭竹快速伸长过程中的糖分代谢变化，分析了幼竹快速伸长过程中节间韧皮部卸载和卸载后运输的机制，以及光合同化物在纵向和横向不同时间的运输速率，并探讨了韧皮部卸载和韧皮部后运输的影响因素，以期更好地理解糖分代谢与运输及水分运输在竹子的快速生长过程中所扮演的重要角色。相关研究成果分别发表在《Tree Physiology》[1]、《Physiologia Plantarum》[2]和《Frontiers in Plant Science》[3]，本文综合介绍了3篇文章的研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料处理

云南箭竹为合轴散生型竹种，平均高度约为10 m，通常9月份发笋。实验选择云南箭竹未伸长、快速伸长和成熟阶段的节间作为材料。

根据云南箭竹竹子节间的伸长程度，获得不同发育阶段的样品。为了测定内源可溶性糖、淀粉以及蔗糖和淀粉代谢酶的活性，每个秆的样品首先分为外部区域(靠近竹青)和内部区域(靠近竹黄)，然后分为上部(靠近箨环)、中部和下部(靠近秆环)，液氮冷冻保存。其他样品FAA固定剂(1.85%甲醛、45%乙醇和0.25%乙酸)固定。

1.2 内源可溶性糖和淀粉含量测定

每个样品取2 g幼竹节间组织在液氮中充分研磨，然后在70 ℃下用10 mL去离子水提取，收集上清液以测定可溶性糖含量。用5 mL去离子水第2次提取后，将沉淀物储存在-20 ℃中测定淀粉含量。将上清液冷冻干燥，再溶于1 mL去离子水中，保存在-20 ℃，用高效液相色谱法测定葡萄糖、果糖和蔗糖含量。采用苯酚-硫酸法测定不同发育阶段节间的淀粉含量，离心提取的沉淀物干燥、称重并用去离子水煮沸，取上清液用于测定淀粉含量。

1.3 淀粉粒、蔗糖和葡萄糖的组织定位

采用高碘酸-希夫(PAS)反应法对节间发育过程中的淀粉粒进行定位。采用Martinelli(2008)和Polit(2012)的方法进行葡萄糖和蔗糖原位染色。

1.4 蔗糖和淀粉代谢酶活性测定

为了测定蔗糖代谢酶活性，将处于不同发育阶段的节间样品在液氮中研磨，并在12 000 r.p.m.、4 ℃下离心30 min。用1 mL的提取缓冲液，包括50 mM KPO4(pH值为7.5)，1 mM EDTA和5 mM MgCl2组成的提取缓冲液。将上清液收集在透析管中，并对1 L的10 mM KPO4(pH值为7.5) 在4 ℃下透析。

为测定淀粉代谢酶活性，将处于不同发育阶段的节间样品(1 g)在液氮中研磨，用1 mL提取缓冲液在12 000 r.p.m、4 ℃下离心30 min。其中包含100 mM HEPES缓冲液(pH值为7.4)，10%(v/v)甘油，2 mM EDTA，2 mM EDTA，3 mM EDTA(v/v)甘油，EDTA 2 mM，0.1%牛血清白蛋白(BSA)，DTT 5 mM，MgCl25 mM和2%(w/v)PVP。上清液保存在4 ℃以备活性测量。

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1.5 韧皮部卸载和韧皮部后运输途径观测

为了明确韧皮部卸载和韧皮部后运输途径，对幼竹第8节间的箨叶施加200 μL CFDA的溶液。实验分别在09∶00、12∶00、18∶00和00∶00进行。每次使用3株幼笋进行重复。荧光显微镜(尼康E400)荧光观察，并计算了CF在幼秆中向上和向下方向的纵向运输速率。

1.6 伸长节间中的水分运输观测

采用酸性品红示踪伸长竹节间的水分运输。分别在09∶00、12∶00、18∶00和00∶00时通过在伸长节间中注入酸性品红溶液(4 g/L)持续测定第8节间的水分传输速率。所有样本立即放入-20 ℃冰箱里带回实验室徒手切片，光镜观察。采用PSY1 Stem Psychrometer系统和液体压力传感器，测定伸长节间的原位水势和原位水压。实验以6株幼竹为实验对象，连续测量3 d。

2 结果与分析

2.1 竹子生长过程中的糖分代谢

在竹子节间快速伸长生长期间，淀粉含量持续下降，未伸长的节间淀粉含量最高，成熟节间淀粉含量最低。这意味着竹子在节间伸长过程中消耗了大量的淀粉。此外，在幼竹节间伸长过程中，竹青处的淀粉含量始终高于竹黄处的淀粉含量。可溶性糖含量随着节间快速伸长而显著增加，然后显著减少，快速伸长阶段的内源可溶性总糖含量最高。

蔗糖含量和内源可溶性总糖含量的变化趋势相似。蔗糖含量在迅速伸长的节间最高，然后随着节间的停止生长而急剧下降。在未伸长和快速伸长阶段，竹青的蔗糖含量显著高于竹黄，在成熟阶段略高于竹黄。在可溶性糖中，葡萄糖在节间伸长过程中含量最高，表现出先升高后降低的变化趋势。在横切面上，外部区域的葡萄糖含量也高于内部区域。果糖和麦芽糖在所有发育阶段的节间也表现出相同的变化趋势。这些结果表明，在快速伸长的节间发生强烈的淀粉和可溶性糖的分解代谢，节间伸长消耗了大量的淀粉和可溶性糖。

在竹子快速伸长过程中，节间糖分含量的动态变化通常与节间伸长过程中的相关酶活性变化有关。蔗糖代谢关键酶，如酸性转化酶SAI、细胞壁转化酶CWI和蔗糖合成酶SUSY的活性与节间伸长表现出明显一致变化的趋势。SAI、CWI和SUSY在快速伸长的节间表现出最高的活性，随着节间伸长的完成，活性也显著降低。在节间伸长过程中，竹壁外侧的活性也显著高于竹壁内侧，这也与可溶性糖在横切面上的分布一致。此外，在节间伸长过程中，SAI和SUSY的活性远远高于CWI，表明在竹子节间快速伸长过程中SAI和SUSY对蔗糖降解发挥了更重要的作用。

AGPase与淀粉的合成有关，淀粉磷酸化酶(STP)和α-和β-淀粉酶参与淀粉降解。AGPase活性随节间伸长而持续下降，而STP和α-和β-淀粉酶则在快速伸长的节间表现出最高的活性，这表明随着节间的快速伸长，淀粉降解显著。由于α-淀粉酶和β-淀粉酶的活性远低于STP，因此，STP在节间伸长过程中对淀粉降解起着关键作用。

通过对淀粉粒、蔗糖和葡萄糖的组织定位发现，在竹子快速伸长的节间维管束内和维管束周围的薄壁细胞中分布着大量淀粉粒、蔗糖和葡萄糖，形成了碳水同化物的运输/储存的分布网络。竹青处维管束内与维管束间薄壁细胞比竹黄处维管束中的薄壁细胞碳水同化物的含量更高。在快速伸长节间靠近竹黄处的维管束中，碳水同化物沿4个方向分布，即后生导管和原生导管之间的2条薄壁组织线路，以及后生导管与韧皮部之间的2条薄壁组织线路。在竹青处，由于原生导管和后生导管纤维鞘的闭合，碳水同化物只分布在韧皮部与后生导管之间的2条线路。这意味着糖分在竹壁内部区域的维管束中沿4个方向进行卸载运输和贮存，在外侧区域沿着2个方向向外进行卸载运输与贮存，它们共同构成了竹子节间碳水同化物的网络分布。

此外，通过对蔗糖与淀粉代谢的关键酶活性进行组织定位，也表现出相同的变化趋势，说明维管束内及维管束间的薄壁细胞是竹子节间组织糖分代谢的主要场所，且竹壁外侧高于内侧。

2.2 糖分卸载机制及运输途径分析

在箨叶上施用CFDA后，在阳光下，靠近纵切面节点的内部区域的维管束中观察到明显的浅黄色。这表明CF被径向运输到内部区域的维管束中，说明箨片中的糖分可以直接被运输至幼笋或者幼竹快速伸长节间内侧的维管束中。在横切面上，可以看到CF的荧光主要分布维管束内及维管束间的薄壁组织中。透射电子显微镜观察，伴胞与周边的薄壁细胞以及薄壁细胞与薄壁细胞之间通过胞间连丝连接。这些观察揭示了竹子节间韧皮部与维管束内和维管束周围的薄壁细胞，共同构成了一个共质体卸载与运输路径。

通过记录幼笋中CF的运输速率，发现CF染料在伸长的幼竹节间，能够同时向上和向下输送。白天，CF向下运输速率高于向上运输速率。夜间，向上运输率却显著高于向下运输速率。此外，在中午12∶00，CF向上和向下方向的运输速率均低于夜间的运输速率。这些研究结果表明：快速生长幼竹中的同化物，在白天以向下运输为主，而在夜间主要以向上运输为主。中午强烈的蒸腾作用抑制幼竹中的同化物运输。

此外，在竹壁横切面上，CF由内侧竹壁向外侧的运输速率远远高于由竹壁外侧向内侧的运输速率。CF的横向运输速率也随时间变化而变化，在中午12∶00最低，在夜间00∶00最高。因此，竹壁内侧维管束间的薄壁细胞与竹壁外侧的维管束间薄壁细胞在横切面上构成了一个由内向外的径向运输网络，作为韧皮部卸载后的碳水同化物的径向运输和贮存的场所。竹壁维管束间的薄壁细胞扮演着“维管射线”的角色，行使横向运输功能。节间纤维和薄壁细胞壁的木质化与栓质化阻碍了质体外的运输。

当CFDA施加于母竹的样本时，在竹笋所有发育阶段，包括未伸长、快速伸长和成熟阶段的幼竹中均观察到羧基荧光素的分布，但CF由母竹向竹笋的运输速率也与竹笋自身的发育程度相关。在未伸长竹笋中的运输速率最小，快速伸长中竹笋的运输速率最大，成熟幼竹的运输速率次之。此外，从母竹到幼笋的CF运输速率也表现出在夜间00∶00高于中午12∶00的变化趋势。因此，糖分由母竹运输至竹笋的速率既与竹笋自身的发育程度相关，也与昼夜的时间变化相关。

2.3 竹子快速伸长节间中的水分运输与糖分运输的相关性分析

与CF不同的是，酸性品红在快速伸长的枝条中只是向上运输。因此，只记录向上的运输速率。酸性品红注入后，酸性品红呈放射状经维管束内和维管束间的薄壁细胞在竹壁内进行横向运输。此外，竹壁内的薄壁细胞的染色比大多数纤维细胞深，韧皮部和靠近维管束的纤维细胞被染成淡红色，显示少量酸性品红随着水的流动扩散到这些细胞中。因此，竹子节间维管束内及维管束间的薄壁细胞不仅构成了竹壁内同化物径向运输的主要路径，也是水分径向运输的主要路径。

通过比较CF运输与水分运输速率，可以发现韧皮部中的CF运输速率的变化动态与木质部中水分运输的变化动态在傍晚19∶00至次日09∶00 一致。但在中午12∶00，水分运输速率很高，CF运输速率却很低。为了分析韧皮部糖分运输和水分运输之间的关系，对不同时间伸长节间的CF运输速率和水分运输速率以及水势和水压进行了相关分析。结果显示，韧皮部向上的CF运输速率，在19∶00次日09∶00与水分运输速率和水压呈显著正相关(P<0.01)，但在中午12∶00 与水分运输速率呈显著负相关。在19∶00次日09∶00，CF在横切面向外的运输速率与水压和水分运输速率也呈显著正相关(P<0.01)。CF向下输送也表现出同样的趋势。中午，快速伸长的竹笋表现出更高的水分运输速率，但具更低的水压值和CF运输速率，这主要是由于中午更高的蒸腾速率造成的。因此，认为夜间的水分运输可以促进韧皮部的糖分运输，但在中午抑制韧皮部中的糖分运输。

2.4 箨鞘是竹笋快速生长过程中的糖分与水分运输控制器

竹节间伸长主要依赖于水分和总可溶性糖浓度的增加。当秆箨被纵向切除时，快速生长的竹笋节间会在一夜间向节间裸露侧弯曲。竹秆节间大部分水分会在秆箨的切割处流失，这便抑制了弯曲侧的水压、水分和同化物运输速率的增加，甚至阻碍了淀粉和可溶性糖的水解，降低了SAI、CWI、SUSY和节间裸露侧的STP。而在背弯侧的节间外侧，较高含量的可溶性糖进一步促进了水分的流入和液泡的膨胀。在背弯侧的薄壁细胞中，观察到了较薄的细胞质层，这也表明这些细胞中的水压较高。在裸露侧(弯曲侧)中水分和同化物的运输速率也有所降低。

与背弯侧相比，较高的水分流入、糖分运输和分解代谢提高了背弯侧的膨胀压力，促进了背弯侧细胞的扩张，而弯曲侧有水分的丧失、水压的下降，以及糖分代谢的抑制，限制了细胞的伸长生长，然后节间变得弯曲。在夜间，无论是弯曲的节间还是正常伸长的节间，葡萄糖在总可溶性糖中所占的比例都是最大的。因此，葡萄糖代谢在细胞扩张和节间弯曲生长中不起关键作用。竹子节间弯曲生长的主要原因是节间内外伸长区的水分压力和糖分水解(包括淀粉和蔗糖)水平的差异导致了细胞扩张的显著差异。笋鞘在竹笋快速生长过程中起着重要的调控作用，它通过调节节间水分运输和压力以及糖分的运输和代谢来实现竹笋的快速生长。

3 结论

云南箭竹的笋芽一般在5月中旬形成，在土壤中的发育期长达4～5个月，通常到雨季中期9月左右才能破土而出。竹笋一旦萌发出土，就能快速生长，在一个季度内完成高生长。传统的观点认为，竹笋在地下生长阶段是地上部分快速生长的养分积累阶段。根据我们的实验结果同样显示，笋芽中的淀粉含量显著高于其他可溶性糖的含量，竹子在节间伸长过程中消耗了竹笋中的淀粉。此外，在节间快速伸长过程中，由母竹运输至竹笋的碳水同化物的运输速率也显著提升。随着节间伸长，淀粉含量和AGPase活性不断下降，STP在淀粉降解过程中扮演主要角色。可溶性糖，包括蔗糖、葡萄糖、果糖和麦芽糖等，在快速伸长的节间中含量最高，然后随着节间伸长生长的完成显著下降。

在竹子快速伸长节间的内部区域，碳水同化物沿维管束薄壁细胞向4个方向卸载和径向运输，但在外部区域的维管束中仅沿2个方向运输。在横切面上，同化物从竹子节间的内部区域向外部区域径向运输。维管束内外的薄壁细胞是糖分代谢的主要场所，这些薄壁细胞构成了糖分的共质体径向运输网络。竹子节间维管束间的薄壁细胞扮演着“射线”细胞的角色。SAI、CWI和STP的活性随节间伸长显著增加，促进了糖分的卸载和卸载后运输。竹子节间卸载后的径向运输和纵向运输均和水分运输相关。在快速伸长时，竹子节间维管束内及维管束间的薄壁细胞也是水分径向运输的主要路径。从晚上19∶00到次日09∶00，木质部CF运输速率与水分运输速率基本一致，但中午12∶00水分运输速率很高，CF运输速率很低。说明在夜间，水分运输促进了同化物的转运，但在中午却抑制了同化物的转运。

竹子节间的伸长生长主要依赖于水分的组织压力与总可溶性糖的浓度。一旦箨鞘被切除，大部分水分会从切口处泄露，就会限制了水压的提高与糖分及水分的运输速率，甚至是降低了糖分与淀粉的水解，并降低了相关的酶活性。相对于裸露的秆壁，箨鞘包裹的秆壁的高浓度的可溶性糖促进水分的流入及液泡的膨胀与细胞的伸长生长，进而引起秆壁的弯曲生长。在竹笋的快速生长过程中，箨鞘起到控制器的功能，在调节水分运输与压力、糖分运输与代谢方面扮演重要角色。