结核分枝杆菌分泌性抗原在结核诊断中的研究进展*

段绍琪 孙 杰 刘凤君

1 川北医学院国际教育交流学院，四川省南充市 637000； 2 川北医学院附属医院感染科

结核病，是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)所引起的一种严重危害人民健康的慢性传染病，是目前已知传染病中最致命的传染病。根据世界卫生组织《2020年全球结核病报告》，2019年全球约有1 000万人患结核病，特别是结核病高负担国家未能实现“终止结核病策略”既定目标[1]，寻找高效、准确、简便的诊断方法是控制结核病疫情的关键。目前已知的细菌学检测、分子生物学检测、免疫学检测和病理诊断受结核分枝杆菌本身特性及卡介苗广泛接种的影响，灵敏度和特异性较低，尚不能达到理想的诊断率。1998年结核分枝杆菌基因序列公布，针对结核分枝杆菌特异性抗原的检测方法越来越受到国内外研究者的重视，张敦熔在2000年《现代结核病学》也指出：如果我们掌握了结核分枝杆菌主要蛋白质的氨基酸序列,就可以合成一系列多肽，用单克隆抗体作为探针鉴定的具有免疫优势的抗原决定簇, 其诊断的敏感性、特异性分别高达90%、100%[2]。随着科学技术的进步，目前已报道的结核分泌抗原多达800多种，但其中只有13种被确定为主要结构[3]。因此，选择特异性和敏感性均高的抗原是重中之重。本文就已报道的具有重要诊断意义的结核分枝杆菌分泌性抗原在结核检测方法中的应用研究进展情况加以概括。

1 结核分枝杆菌菌属抗原

1.1 Ag85复合体 Ag85复合体又称为MPT54，属于胞外蛋白，是存在于结核杆菌对数生长期早期滤液中的主要组成成分，是分枝杆菌共有抗原，由Ag85-A、Ag85-B、Ag85-C3种相对分子质量相近，且抗原性有交叉的蛋白质组成的异三聚体复合物[4]。其中，Ag85-A和Ag85-B具有较强的细胞和体液免疫活性，由于其具有多种T细胞的抗原决定因子，可诱导产生皮肤迟发型超敏反应(DTH)和保护性免疫应答。Ag85复合体参与MTB细胞壁脂质的生物合成、补体介导的结核分枝杆菌吞噬作用以及结核分枝杆菌侵袭力的组成[5]，Ag85复合体属于纤连结合蛋白，其受体是人类细胞表面纤连蛋白，在结核病的急性感染期产生重要作用[6]。

姬祥等[7]研究发现结核病人血清中，以Ag85A+Ag85B或Ag85C血清IgG抗体阳性为诊断标准，采用ELISA法检测血清结核分枝杆菌IgG抗体敏感性和特异性分别为60.4%和86.1%，提示Ag85复合体对结核病血清学诊断具有一定的临床意义。Ernst JD等[8]采用ELISA法研究发现Ag85B在结核分枝杆菌复合体不同的菌株和谱系分泌具有显著差异，在结核分枝杆菌感染的小鼠的肺细胞匀浆中可以找到大量的Ag85B，这些差异可能影响T细胞反应的频率和幅度，提示Ag85B不仅可以鉴别活动性结核病、既往感染、卡介苗接种人群，还可能参与调节细菌环境以促进新宿主细胞的感染。满昌军等[9]研究发现Ag85复合体免疫组化染色(IHC)对肾结核的敏感度为100%，特异性为69.38%，提示Ag85复合体可以作为诊断肾结核的补充检查。车南颖等[10-11]通过免疫组化法检测石蜡包埋组织标本中Ag85B的表达，并与Ziehl-Neelsen染色进行比较。结果表明，Ag85B的表达位点和表达强度与抗酸杆菌的分布位点和数量一致，且Ag85B免疫组化产生的信号及免疫组化的敏感性明显强于Ziehl-Neelsen染色，提示Ag85B免疫组化在结核的病理诊断中具有良好的应用价值。而且，免疫组化还具有不需使用油镜观察结果的优点，大大提高了病理医生的诊断速度，是一种简便、灵敏的结核病理诊断方法。

1.2 16Ku蛋白 16Ku蛋白属于膜蛋白，是hsp X基因编码的早期分泌蛋白，它是一种小分子热休克蛋白，可耐高温，是结核分枝杆菌处于静息期时分泌的主要膜蛋白。在高温环境中，转录因子Rv3133v/dosR通过与16Ku蛋白的核心功能区crystallin结合发挥其抑制热凝集功能。16Ku蛋白不仅能激活B细胞，还能诱导T细胞引导细胞免疫应答，其独特之处在于它具有不依赖ATP分子伴侣的活性，这对结核杆菌的稳定性和存活起着重要的作用。

在85%肺结核病人的血清中都可以检测到16Ku蛋白。Raja A等[12]研究发现运用ELISA法检测联合检测结核病患者血清中IgA和IgG的16Ku，敏感度可达到82%，特异性可达到97%,提示16Ku蛋白在结核病的血清学诊断中具有临床应用价值。有研究发现，对于结核病患者检测16Ku和PPD抗体差异无统计学意义，但在卡介苗阳性患者中，16Ku的特异性较高，提示16Ku可区分结核患者和卡介苗接种者。

1.3 38Ku蛋白 38Ku蛋白(pab)属于膜蛋白，是由Pst S基因编码的一种早期分泌蛋白，占比为10%，为一种磷酸盐转运蛋白，仅在结核分枝杆菌复合体(MTBC)和部分卡介苗中。38Ku蛋白含有T和B淋巴细胞的抗原决定因子，其中有2种特异的B细胞原决定簇，对应于单克隆抗体TB71和TB72[13]，可刺激机体产生细胞免疫和体液免疫应答，抗原性较强，能诱导早期反应。

38Ku血清学活性较强，与其他抗体相比，痰涂阳性的结核病患者，抗38Ku阳性率最高，但总结目前已报道的研究结果，其敏感度为16%～89%，特异性为93%～100%，结果不全一致，在痰涂阴性结核病患者种敏感度仍有明显局限，提示抗38Ku蛋白仍需与其他敏感度较高的抗体联合检测以提高诊断率。Ihama Y等[14]对采用福尔马林固定石蜡包埋的肠道结核组织样本使用38-kDa抗原的单克隆抗体进行免疫组化染色，结果显示除了经典的检查方法外，结核分枝杆菌单克隆抗体免疫组化染色可能是一种有效和简单的诊断工具。

2 卡介苗缺失抗原

2.1 MPT64蛋白 MPT64蛋白(MPB64)属于胞内蛋白，是结核分枝杆菌早期培养滤液(ST-CF)的主要组成成分，是一种分泌蛋白，占8%，是最早被发现的结核分枝杆菌特异抗原，只存在于MTBC中，卡介苗菌株在传代过程中丢失了编码该蛋白的MPT基因。在人类特异性T细胞应答中，MPT64蛋白是最重要的结核分枝杆菌抗原之一，T细胞决定簇分布在整个蛋白分子序列中，包含CD4+和CD8+细胞表位[15]。MPT64对宿主细胞具有抗凋亡的功能。

在结核病或PPD阳性患者中，天然和重组MPT64均能诱导其产生T细胞反应和DTH，而卡介苗接种者或环境分枝感染患者对MPT64皮肤试验无应答。丁志鑫[16]发现，采用ELISA法检测结核性胸腔积液样本中IgG抗体的敏感性为26.3%，特异性为95.6%；MPT64-Rv1958c融合蛋白的敏感性和特异性分别为54.9%和91.2%，提示MPT64作为单一抗原诊断结核病的敏感性低于其与Rv1958c结合的融合蛋白。杨瑜等[17]发现利用胶体金免疫层析法(GICA)检测MPT64可在7d时准确、快速地鉴定结核分枝杆菌的耐药情况。Purohit MR等[18]通过免疫组化法检测采用福尔马林固定的腹部结核和淋巴结结核标本中MPT64的表达，其总体敏感性、特异性、阳性预测值和阴性预测值分别为92%、97%、98%和85%，表明MPT64免疫组化技术对结核分枝杆菌感染建立早期和特异性诊断是一种简单、敏感的技术。

2.2 ESAT-6 ESAT-6蛋白属于胞内蛋白，是从ST-CF中分离出的另一种早期分泌蛋白，由卡介苗缺失的基因片段R1区的Rv3875基因编码[19]，Harboe等研究证实ESAT-6蛋白仅存在于致病性结核分枝杆菌中，而不存在于卡介苗等非致病性结核分枝杆菌中。因此，ESAT-6是鉴别致病性结核分枝杆菌、非致病性结核分枝杆菌和卡介苗的最佳抗原之一。ESAT-6是一种重要的T细胞抗原，能在感染的早期识别有免疫活性的T淋巴细胞，诱导宿主特异性 CD4+T细胞、CD8+CTL增殖及γ干扰素的大量产生，具有免疫保护作用。ESAT-6与结核分枝杆菌的溶细胞活性相关，是抗结核分枝杆菌记忆免疫应答的主要配体，具有免疫记忆作用。ESAT-6亦具有B淋巴细胞的抗原决定簇，能刺激特异性免疫球蛋白的产生，但由于结核分枝杆菌细胞膜上没有ESAT-6信号肽序列，其分泌到胞外的机制暂不明确，结核病患者血清中ESAT-6含量较低。

目前临床上广泛应用的IGRA检测就是利用结核分枝杆菌表达的ESAT-6和CFP10可刺激结核患者外周血单核细胞(PBMC)大量分泌γ干扰素的特性，在采集血样后12～18h检测γ干扰素含量，相对于结核皮肤试验，IGRA具有较高的敏感性和特异性，且不受卡介苗接种和大多数非致病分支感觉的影响。朱雅娟等[20]观察结核性脑膜炎(TBM)患者脑脊液中ESAT-6的动态变化及其诊断意义，结果表明，不管是治疗前还是治疗1、2、4周后，TBM患者脑脊液中ESAT-6均高于非TBM患者，且脑脊液中ESAT-6水平随病情改善而逐渐下降，提示早期检测疑似TBM患者脑脊液中的ESAT-6具有一定的诊断意义，且动态检测TBM患者脑脊液中的ESAT-6可评估患者病情变化。孙立[21]通过检测肾结核患者肾组织中ESAT-6表达，探讨ESAT-6在肾结核早期诊断中的意义，结果发现肾结核患者肾组织中ESAT-6表达增强，ESAT-6免疫组化染色的敏感性和特异性分别为100%和83%，与Ag85相似但高于Ag85。Ag85为75%，提示抗ESAT-6抗体免疫组化可作为肾结核早期诊断的辅助试验，特异性高于抗Ag85抗体。

2.3 CFP10 CFP10由缺失卡介苗基因片段R1区的Rv3874基因编码[19]，是另一种从ST-CF中分离出来的早期分泌蛋白,仅存在于致病性结核分枝杆菌中，不存在于卡介菌等非致病性结核分枝杆菌。编码CFP10的基因位于编码ESAT-6的基因的上游，两个基因序列同源性为25%的，且两个基因是共同转录，有研究发现CFP10和ESAT-6形成1∶1的紧密复合物来发挥作用[22]。CFP10是重要的T淋巴细胞靶抗原，可诱导强烈的T淋巴细胞增殖活化，亦能刺激PBMC产生大量γ干扰素。同ESAT-6类似，CFP10具有免疫保护和免疫记忆功能。

有研究指出，CFP10还具有特异性的穿孔素，可作为一种基于细胞免疫的儿童结核病患者的新诊断标志，并有可能区分ATB和LTBI[23]。有研究发现，CFP10抗原单独检测结核患者血清中相应抗体的敏感性并不理想。以ESAT-6和CFP10融合抗原为特异性抗原的新型皮肤测试(EC)在1.0μg/0.1ml的剂量下具有较高的特异性和敏感性，与T-SPOT.TB相当，且EC皮肤测试不受卡介苗接种影响[24],其安全性能可，在测试观察过程中没有出现严重不良反应事件。以ESAT-6和CFP10融合作为特异性抗原对外周单克隆细胞具有良好的活化能力，不但能产生大量γ干扰素，其主要优势在于不受接种卡介苗的影响，避免假阳性。

综上所述，种类繁多的结核分枝杆菌分泌特异性抗原在结核诊断中的应用尚未确定，但可以肯定的是，结核分枝杆菌分泌特异性抗原可以作为检测和区分活动性结核和潜伏性感染的重要手段。目前以血液、肺泡灌洗液为标本关于结核分枝杆菌分泌特异性抗原检测的研究已较多，而以结核病灶组织为标本进行相对较少，且仅以单一抗原为检测对象，效果不够理想。因此，以结核病灶组织为标本，检测相关抗原蛋白的融合表达或多种抗原的联合应用是未来结核病诊断的发展方向。