褪黑素在帕金森病治疗中的研究进展

尹亚萍，王 宇，田雨阳，马 焜*，李百祥*

(哈尔滨医科大学公共卫生学院卫生毒理学教研室，黑龙江 哈尔滨 150081)

帕金森病(Parkinson's disease，PD)是全球第二常见的神经退行性疾病，我国65岁以上中老年人的患病率已高达2%，发病率仅次于阿尔兹海默症，且患病率随年龄的增加呈指数增长。PD的病理改变为黑质(substantia nigra，SN)致密部的多巴胺能神经元发生退行性病变，多巴胺(dopamine，DA)水平降低，同时伴随细胞内路易小体形成。PD以运动迟缓、静息性震颤、肌僵直和平衡障碍(姿势不稳)为典型临床表现，90%的患者还经历了抑郁、幻觉、睡眠障碍等非运动症状[1]。PD的病因尚未完全明确，年龄因素、遗传因素、环境污染和氧化应激等因素均可能参与多巴胺能神经元的变性死亡过程，增加PD的发病风险。褪黑素(melatonine，MT)是人体内重要的抗氧化物，被认为和PD的发生发展密切相关。Lin等[2]发现，随着年龄的增长，成年人血清MT无明显变化，但中老年人夜间的血清和脑脊液MT水平在60岁开始下降，直到70岁时下降到最低，推测MT的减少可能是PD发病的重要因素。近年来已有许多关于褪黑素在PD治疗和控制方面的临床研究[3]。

1 帕金森病的病理机制

1.1 环境及遗传因素

流行病学调查结果发现，90%的散发型PD是仅由环境因素或环境因素和遗传因素共同影响的。研究表明，多种环境因素与PD的发病相关，如1-甲基-4-苯基-1,2,3,6四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine，MPTP)、除 草 剂、杀虫剂、颅脑损伤、β受体阻滞剂等均可导致PD。PD病人中仅5%~10%有家族史，其家族中的PD发病具有明显的聚集倾向，病人的亲属或者后代PD的发病率较无PD家族史的人群发病率更高。在这些家族性PD患者体内共鉴定出2个常染色体显性遗传基因：α-突触蛋白(α-synuclein，α-syn)基因SNCA，富含亮氨酸的重复激酶2(leucine-rich repeat kinase 2，LRRK2)。3个常染色体隐性PD相关基因：parkin，PINK1和DJ-1。其中LRRK2突变是迟发性PD最常见的遗传病因，占所有PD患者的1%~2%，parkin是早发性PD(30岁以前)的主要病因，而当前重点研究的GBA和LRRK2两个基因，则与典型晚发PD有关[4]。

1.2 氧化应激反应

随着机体正常的老年化，多巴胺能神经元对氧化应激反应中的活性氧(reactive oxygen species，ROS)敏感性增加。PD患者脑黑质内谷胱甘肽(glutathione，GSH)和铁蛋白含量降低，抗氧化酶活性降低，自由基清除能力下降。目前认为PD患者脑内多巴胺、神经黑色素和铁的代谢异常、线粒体功能障碍等均可引起脑内自由基的过量蓄积。PD患者脑内多巴胺转运体和囊泡转运体存在异常，多巴胺蓄积在突触间隙，在单胺氧化酶的作用下生成过氧化氢，其中一部分被抗氧化系统清除，另一部分在神经黑素(抗坏血酸)的作用下和铁发生Fenton反应生成毒性更强的羟自由基(·OH)，进而将DA羟基化生成6-羟基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)等[5]。内源性和外源性因素又会造成线粒体复合物Ⅰ(又称为NADH-Q氧化还原酶)损伤，破坏线粒体呼吸链，使产生的ROS增加。氧化应激除引起线粒体功能障碍外，还能直接损伤细胞生物大分子如蛋白质、脂质和核酸，导致细胞内抗氧化物酶水平降低，同时生成大量的丙二醛(malondialdehyde，MDA)，破坏细胞膜，进而导致细胞凋亡的发生[6]。

1.3 线粒体功能障碍

线粒体是细胞能量来源的工厂。一项PD患者的解剖结果显示，其脑组织中线粒体复合物Ⅰ水平降低了35%[7]。当线粒体功能出现异常，如线粒体复合物活性降低、钙离子紊乱、跨膜电位崩溃等均可引起细胞能量代谢障碍，ATP合成数量明显下降，细胞膜内外离子因能量供应不足，引起线粒体膜电位降低，Ca2+急剧内流，激活磷脂酶分解膜磷脂，耗竭细胞内ATP并导致DNA断裂。同时Ca2+还能作为细胞凋亡第二信使激活线粒体细胞凋亡通路，调节钙蛋白酶、钙调神经磷酸酶对α-syn的作用。线粒体复合物活性降低还会产生更多的自由基，自由基可与生物膜上的脂肪酸(如心磷脂)发生氧化还原反应，过多的自由基聚集时可氧化线粒体通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)上的ADP/ATP载体，导致mPTP开放，诱导细胞色素C(cytochrome C，Cyt C)释放，使电子传递链在Cyt C氧化酶处受阻，形成电子漏，产生更多的ROS。mPTP开放还能引起线粒体膜通透性升高，跨膜电位崩溃，许多大分子物质如Cyt C、凋亡诱导因子(apoptosisinducing factor，AIF)等细胞凋亡因子伴随着Ca2+排到胞质。在胞质内ATP环境下，Cyt C与凋亡蛋白酶激活因子1、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶9结合形成凋亡小体，激活caspase-3等细胞凋亡下游通路，引起线粒体肿胀和细胞凋亡。此外，parkin、PINK1、DJ-1等基因异常也会导致线粒体自噬和再生障碍，诱发多巴胺能神经细胞凋亡[8]。

1.4 神经炎性反应

PD神经炎症的主要表现为小胶质细胞和星形胶质细胞被反复激活，通过旁分泌途径损伤神经元[9]。激活的小胶质细胞能释放多种炎症介质和趋化因子，如白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、IL-6、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、干扰素-β、NO、前列腺素E2等，诱导多巴胺能神经元出现神经炎症损伤[9]；此外，小胶质细胞还能通过调节NADPH氧化酶向胞外释放超氧化物，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、环氧化物合酶-2(cyclooxygenase-2，COX-2)等的合成，导致多巴胺能神经元变性坏死，其产生的炎症因子可以影响星形胶质细胞正常功能，抑制星形胶质细胞摄取突触间隙的谷氨酸等兴奋性神经递质，降低神经营养因子表达，促进兴奋性氨基酸的神经毒性，引起多巴胺系统的功能性损伤[10]。研究表明，PD患者神经炎症的发生可能与血脑屏障通透性的升高、外周淋巴细胞(CD4+、CD8+)的过度激活有关[11]。

1.5 毒性蛋白堆积

在PD患者体内，异常聚集的α-syn会促进多巴胺能神经元的变性坏死和纹状体路易小体的产生，并伴发α-syn的生理缺陷。研究表明，α-syn可通过调节蛋白磷酸酶2或与伴侣蛋白相互作用参与酪氨酸羟化酶(tyrosine hydroxylase，TH)脱磷酸化，病理情况下引起DA生成减少[12]。α-syn选择性的抑制磷脂酶D2，影响囊泡内多巴胺水平和突触小泡完整性，抑制纹状体囊泡和突触对多巴胺的合成、储存和重吸收。α-syn还能引起内质网、高尔基体应激，溶酶体、蛋白酶体活性受损，从而导致细胞新陈代谢紊乱。此外，α-syn表达升高还会增加氧化应激压力，破坏Ca2+稳态，诱导钙蛋白酶激活炎症反应。有报道指出，α-syn进入线粒体后，不仅可以与呼吸链中的Cyt C氧化酶结合影响线粒体呼吸过程，还可与线粒体膜结合抑制线粒体的融合导致线粒体断裂[13]。

Mazurskyy等[14]提出“双重打击”假设，PD开始于嗅觉黏膜或肠道直接接触毒素或病原体，嗅球或胃肠道内错误折叠的α-syn可能会形成具有“朊病毒样”传递性的包裹体，沿着迷走神经传入中脑神经系统，形成PD脑内神经系统的功能紊乱。

2 MT辅助治疗PD患者的临床研究进展

MT是一种主要在松果体细胞合成并释放的神经激素，是体内的强自由基清除剂和抗氧化剂，MT的自由基清除能力是GSH的4倍，甘露醇的14倍。MT被广泛应用于抗炎、抗氧化、镇静和昼夜节律的调节，近年来还被应用于癌症的治疗。MT及其产物均能直接或间接清除活性氧和活性氮，间接地激活抗氧化酶和抗氧化非酶分子。MT还能螯合某些过渡金属(如Fe2+和Mn2+)，减少具有致命毒性的羟基自由基的形成，从而降低氧化应激。研究表明，MT对6-OHDA、β-淀粉样蛋白、MPTP/MPP+等引起的毒性损伤均可发挥神经保护作用，并已被认为是一种良好的神经退行性疾病保护剂。

2.1 MT抗氧化作用

MT具有高亲脂性和部分亲水性，有高度弥散穿透能力，从而在细胞膜、细胞质和细胞核中均能发挥抗氧化作用。MT主要通过直接清除自由基和调节抗氧化酶活性发挥抗氧化作用，以保护细胞DNA、膜脂质、胞浆蛋白等生物大分子免受氧化损害。研究表明，在6-OHDA诱导的PD大鼠模型中，对大鼠单侧鼻内注射30 mg/kg MT，能有效保护SN多巴胺能神经元免受氧化应激损伤，且使ROS和MDA水平明显降低、过氧化氢酶、GSH及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)含量显著上升[15]。在另一项应用MPTP斑马鱼PD模型中，MT已被证实还可以通过降低GSSG/GSH比值和维持抗氧化酶的表达发挥抗氧化作用[16]。MT可直接与其特异性受体MT1和MT2受体结合，诱导一型血红素氧化酶、醌氧化还原酶和谷胱甘肽-S-转移酶、谷氨酸半胱氨酸连接酶及环氧化物水解酶(epoxide hydrolase，EH)等抗氧化应激蛋白的转录，提高细胞抗氧化应激能力，减少细胞内ROS的产生。同时，将MT与左旋多巴(levodopa，L-DOPA)联合应用，可以延长小鼠体内L-DOPA的有效期，并进一步增强了左旋多巴对运动的反应，并保护外源性多巴胺前体不受自身氧化，且副作用较小，无明显毒性[17]。

2.2 MT恢复线粒体功能

MT可在神经细胞线粒体内保持较高浓度，并作为线粒体内的专性抗氧化剂。早在1900年Shapira就发现，PD患者黑质细胞复合物I活性降低明显，而MT可以通过多种抗氧化途径清除氧化磷酸化过程产生的自由基，保护复合物I和IV，增加ATP的合成[18]。MT通过保护心磷脂(cardiolipin，CL)不被氧化，能同时抑制Ca2+/过氧化叔丁醇诱导的CL氧化和mPTP开放过程，维持线粒体跨膜电位，阻碍甲基苯丙胺(methamphetamine，METH)通过激活钙蛋白酶诱导人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞凋亡[19]。MT不仅可以恢复线粒体呼吸酶的活性，还可以调节线粒体融合和裂变过程。MT作用于线粒体特异性蛋白，并激活解耦连蛋白耗散质子跨越线粒体内膜的梯度以适度减少内膜潜力，可使膜间质子回到基质，降低线粒体膜电位，显著增加复合物Ⅰ和Ⅲ的活性，加速电子传递链中的电子传输，减少电子泄露和ROS的产生，这称为MT降低膜电位形成“自由基回避效应”。MT还能通过激活MAPK通路、抑制线粒体裂变蛋白1、动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1，Drp1)的活性，调控线粒体的吞噬和发生。在用鱼藤酮处理SH-SY5Y细胞诱导的PD模型中，Zhou等发现MT不仅调节了线粒体的跨膜电位，上调CytC蛋白水平，还调节了Drp1的表达，抑制Drp1诱导的线粒体碎片化[20]。Diaz-Casado等的研究表明，MT可以改善线粒体相关基因的表达，在斑马鱼胚胎PD模型中，恢复了因parkin/PINK1/DJ-1/MUL1网络异常造成的线粒体损伤[21]。

2.3 MT抗神经炎症

研究发现，MT在10和100 mol/L浓度处能抑制MPTP诱导大鼠星形细胞瘤细胞(C6)神经炎症过程中TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA表达[22]。MT的预处理可显著抑制MPTP诱导的iNOS mRNA的过表达，降低了星形胶质细胞中亚硝酸盐的释放和NO的神经毒性作用，减少多巴胺能神经元的凋亡，预防神经炎症的发生。最新的研究表明，MT还能拮抗METH诱导的血脑屏障的破坏，保护反应性神经胶质细胞。MT能降低MPTP小鼠COX-2表达，从而抑制前列腺素E2的合成，阻碍其介导的神经退行性病变，MT的这些保护作用同样也在MPTP诱导的C6细胞的体外实验中被发现[23]。MT还能减弱胶质纤维酸性蛋白的表达，抑制星形胶质细胞的增生。Niranjan和他的团队还验证了MT抑制MPTP引起的神经炎症的机制，MT通过抑制p38丝裂原活化蛋白激酶表达和核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号通路的激活，阻碍NF-κB转运到细胞核激活神经炎症反应[22]。

2.4 MT抑制α-syn的毒性作用

MT除了抗炎抗氧化外，还能通过影响α-syn的表达、聚集和直接结合抑制路易小体的形成，以改善多巴胺能神经元的生存环境。MT能显著降低甲基苯丙胺引起的脑内α-syn过表达，尤其是在小鼠脑内黑质部分，MT降低了77%的α-syn表达水平。有研究指出，钙蛋白酶通过切割α-syn的羧基末端片段降低其溶解性，促进α-syn的原纤维化和聚集，Schlachetzki还提出MPTP小鼠脑内α-syn的积累可能是通过增加钙蛋白酶活性实现的[24]。MT能螯合游离的钙蛋白酶，拮抗钙蛋白酶与α-syn结合的促聚集作用，降低α-syn的毒性，提示MT可以直接和α-syn结合抑制其毒性作用。Chang等发现MT能拮抗海人藻酸(kainic acid，KA)促进α-syn的聚集作用，而KA能在不改变αsyn单体水平的情况下，通过抑制泛素化加速α-syn聚集，提示MT可能通过促进α-syn泛素化抑制其聚集，发挥神经保护作用[25]。

2.5 MT抗细胞凋亡作用

MT能激活神经细胞的生存信号级联通路，抑制多巴胺能神经元的凋亡。MT通过MT1/MT2信号转导和钙调蛋白-LOX途径，将Bcl-2重新定位到线粒体中，螯合促凋亡蛋白Bax，抑制其激活线粒体凋亡通路。此外，MT还可以分别上调Bcl-2、下调Bax基因的表达，降低Bax/Bcl-2比值，预防Bax从胞质转运到线粒体，抑制mPTP开放和Cyt C、AIF等促凋亡物质释放引起的细胞凋亡[26]。

2.6 MT抗细胞自噬“双刃剑”作用

细胞自噬(autophagy)是细胞代谢过程中的衰老细胞器和异常蛋白质等成分降解的过程，一些损坏的蛋白或细胞器被自噬小泡包裹后，在溶酶体中进行降解和消除，诱导的自噬可以清除损伤的线粒体和ROS损伤的蛋白，减轻后续的级联反应，抑制凋亡，有利于维持细胞稳态。Nopparat等[27]在METH诱导的人神经母细胞瘤SK-N-SH细胞PD模型中，发现MT拮抗了METH诱导的c-Jun氨基末端激酶磷酸化激活，抑制Bcl-2/Beclin-1的解离，阻碍自噬相关蛋白Beclin-1相关的磷脂酰3-激酶活性，防止细胞因过度自噬造成的凋亡或坏死。这说明病理状态下，细胞自噬被激活或抑制，细胞内出现过低自噬、自噬不足和过度自噬均引起或加重组织损伤，线粒体损伤，细胞内蓄积ROS触发细胞凋亡。在相同的SK-N-SH细胞模型，Kongsuphol等[28]发现MT预处理能阻止METH灭活哺乳动物雷帕毒素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)和去磷酸化真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1，增强mTOR信号通路，抑制细胞自噬死亡。Su等[29]发现，MT还能通过抑制细胞周期素依赖蛋白激酶5信号级联，降低自噬标志物微管相关蛋白1轻链3B-II水平，逆转MPTP引起的细胞自噬。此外，MT还能通过降低细胞自噬通量和提高神经营养因子如脑源性神经营养因子和神经生长因子含量，间接调控多巴胺能神经元的凋亡。

2.7 MT改善睡眠障碍作用

目前研究表明，PD患者出现运动障碍时常伴随嗜睡、快速眼动睡眠行为障碍(rapid eye movement sleep behavior disorder，RBD)及失眠，这可能是由于中脑边缘环路中多巴胺能神经元及与睡眠相关神经元变性所致，是PD患者一种非运动症状，且在患者认知功能降低和抑郁状态的共同作用下，加速了PD患者丧失日常活动能力的进程。已有研究表明，RBD与PD的发生发展具有一定相关性，并可能成为PD的前驱症状，RBD主要特点是夜梦较多及骨骼肌张力增高，以α-突触核蛋白的组织病理学改变为特征，研究表明，约60%的帕金森病患者伴有RBD。已有临床证据表明，MT对帕金森的RBD有一定治疗效果，MT通过恢复快速眼动睡眠期骨骼肌失驰缓现象而改善快速眼动睡眠期间伴随的梦境及肢体活动情况，因此也被推荐为RBD的治疗药物。Kunz等[3]在临床研究中发现，在使用MT每天睡前30 min服用2 mg缓释剂后，患者DA转运体增加，快速眼动睡眠行为障碍消失。已有研究表明MT会改善帕金森患者的RBD症状[30]。但也有研究认为低剂量MT对PD患者的RBD症状无效[31]。MT不能使黑质纹状体通路中的多巴胺能神经元再生，但有希望延缓甚至终止PD的病理进展。外源性MT对于PD患者的夜间睡眠障碍、白日嗜睡、焦虑等均有较好的治疗效果，MT还可改善PD患者的抑郁、谵妄和部分运动症状。对于这些结论的差异，可能是由评估RBD严重程度的终点不同所造成的。在给予MT或安慰剂的临床随访中，由于患者或其床伴对RBD发作情况的记录具有很强的主观性，导致结果的准确性存在争议。

在大多数PD动物实验中，MT表现了良好的运动调节和神经保护作用。但在PD患者临床试验中，外源性MT对神经保护、认知和运动益处的效果往往令人失望，尽管PD患者的主观睡眠质量得到显著改善，但MT并未改善患者的运动功能障碍，亦无法改变疾病进程，这可能是由于目前实验研究样本量过小，或者与应用的MT剂量过低有关。人体内MT水平昼夜波动较大，且不同部位存在差异分布。因此，MT临床应用的剂量和应用的时机还需要更多的临床实验研究来验证。

3 小结

褪黑素是人体内天然存在的抗氧化活性物质，大量的体内、体外实验表明褪黑素对于帕金森病具有较好的预防和治疗作用。临床上褪黑素已被应用于治疗帕金森病的非运动症状。褪黑素补充剂对帕金森病的氧化应激、神经炎症以及细胞凋亡等方面均有较强的拮抗作用。这显示出褪黑素具有一定的神经保护作用，具有改善PD症状的潜能。虽然PD病因及发病机制十分复杂，MT在PD中的作用也尚未完全明确，但褪黑素在一定程度上有益于帕金森病受损的DA能神经元的恢复。这将对未来研究褪黑素临床治疗帕金森病具有重要的理论意义和实际意义，为防治帕金森病和研制拮抗神经损伤的药剂提供新的理论依据。