Rh血型抗原检测卡行业标准的首次制定

胡泽斌，孙楠，孙晶，于婷，黄杰

中国食品药品检定研究院体外诊断试剂检定所，北京 100050

Rh系统在红细胞血型系统中序号为4，符号表示为RH，是除ABO系统外最重要的血型系统［1-2］。Rh系统共5种主要抗原RH001～RH005，即D、C、E、c、e，均具有较强的免疫原性［3-4］。在RhD抗原检测之外，进行患者和献血者Rh系统其他主要抗原常规检测，对Rh血型抗原准确分型，实现Rh系统的相容性输血，可避免临床实践中因Rh系统抗原不明引起的反复交叉配血不合造成的贻误输血时机，及时挽救患者生命［5-6］。随着输血事业的发展，国内临床输血对于红细胞血型抗原的检测也更为完善，某些医院将Rh系统的5种主要抗原列入常规检测项目［7］。

目前，Rh血型抗原检测试剂以凝胶填充柱或玻璃珠填充柱的柱凝集法检测卡为主，在临床中广泛使用。但该类产品无统一行业标准，使得Rh血型抗原检测的标准化和质量控制难以进行，不易把控临床使用上的风险。按照国家药品监督管理局2021年医疗器械行业标准制修订计划［8］，由中国食品药品检定研究院牵头，组织多家行业内的检测机构以及生产企业，首次起草制定了《Rh血型抗原检测卡（柱凝集法）》医药行业标准。本研究选取6个代表性的国内外生产企业的27批次Rh血型抗原检测卡，对拟定标准的技术指标和检验方法进行全面试验验证。

1 材料与方法

1.1 标准品 抗C（IgM）血型定型试剂效价测定用国家参考品（批号：360021-201801，0.8 mL／支，白色冻干品）由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 主要试剂及仪器Rh血型抗原分型检测卡（微柱凝胶法）、久保田离心机（型号：KA-2200）、卡式医用离心机（型号：ID-L Centrifuge）由伯乐生命医学产品（上海）有限公司（厂家1）提供；Rh血型定型检测卡（柱凝集法）、医用离心机（型号：LB-3000）、久保田离心机（型号：KA-2200）由江苏力博医药生物技术股份有限公司（厂家2）提供；Rh／K血型诊断试剂卡（柱凝集法）、血型及配血离心孵育工作组（型号：ORTHO workstation）、全自动血型分析仪（型号：ORTHO VISION）由奥森多医疗器械贸易（中国）有限公司（厂家3）提供；Rh血型抗原检测卡（单克隆抗体）、多管架离心机（型号：TDZ5-WS）、离心机（型号：TD-A）由长春博迅生物技术有限责任公司（厂家4）提供；人Rh系统分型检测卡（凝胶法）、低速离心机（型号：DT2-12，SC-3610）由天津德祥生物技术有限公司（厂家5）提供；Rh血型抗原检测卡（柱凝集法）、医用离心机（型号：Maccura T-24）由迈克生物股份有限公司（厂家6）提供；北利离心机（型号：DT5-3）、血型卡离心机（型号：TD2-24）、微量移液器（型号：Eppendorf 10-100µL，100-1 000µL）由中国食品药品检定研究院提供。

1.3 方法

对现有Rh血型抗原检测卡的性能指标进行调研评估，结合临床实际需求，参考国内外相关技术指标，制定《Rh血型抗原检测卡（柱凝集法）》行业标准，性能指标包含外观、特异性、灵敏度、重复性、批间重复性、稳定性，选择6个厂家Rh血型抗原检测卡对这些评价指标和检验方法进行全面验证。

1.3.1 外观 自然光下目视检查产品外观并结合离心进行判断，一般由厂家规定产品的外观要求，通常应有试剂各组分组成、性状，以及内外包装、标签清晰等要求。检测卡中抗C柱、抗E柱、抗c柱、抗e柱、质控柱应为无色、淡黄色或均匀乳白色；各柱均应无干裂，内填充物表面上应有液体层，各柱填充物及液体应均一无异物；离心后，不应有气泡，填充物表面不应有明显倾斜。

1.3.2 特异性及灵敏度 按照不同厂家Rh血型抗原检测卡说明书进行操作，分别使用2例RhC、c、E、e抗原阳性（包含纯合子和杂合子）和2例RhC、c、E、e抗原阴性红细胞进行Rh血型检测。抗C柱应与RhC阳性红细胞发生凝集反应，与RhC阴性红细胞呈阴性反应；抗c柱应与Rhc阳性红细胞发生凝集反应，与Rhc阴性红细胞呈阴性反应；抗E柱应与RhE阳性红细胞发生凝集反应，与RhE阴性红细胞呈阴性反应；抗e柱应与Rhe阳性红细胞发生凝集反应，与Rhe阴性红细胞呈阴性反应；凝集强度均应不低于厂家说明书定义的3+。

1.3.3 国家参考品效价比对试验 用0.8 mL去离子水将抗C（IgM）血型定型试剂效价测定用国家参考品复溶，配制成标准液后用生理盐水进行倍比稀释，用相同的RhC阳性红细胞（包括C抗原纯合子和杂合子各1份），对Rh血型检测卡内抗C抗体或该批次抗C抗体工作液、抗C（IgM）血型定型试剂效价测定用国家参考品，进行同步试管法效价测定，应不低于国家标准品对CC纯合红细胞和Cc杂合红细胞的最低效价要求。

1.3.4 批内重复性 用同批Rh检测卡对同一样本连续检测10次，结果均一致，且阳性结果凝集强度差异不超过1+，阴性结果不应有凝集、溶血现象。

1.3.5 批间重复性 用3个批次的Rh检测卡分别对同一样本连续检测10次，比较30次检测结果，阳性结果应一致且凝集强度差异不超过1+，阴性结果均不应有凝集、溶血现象。

1.3.6 效期稳定性 厂家应规定过效期后多长时间内进行效期稳定性检测，一般取到效期后1个月内的产品，检验其外观、特异性、灵敏度和批内重复性，结果均应符合上述要求。

1.3.7 热稳定性 厂家应规定热稳定性的放置条件是否与剩余效期有关，一般在37℃条件下加热检测卡7 d后，检验其外观、特异性、灵敏度和批内重复性，结果均应符合上述要求。

2 结 果

2.1 外观 采用6个厂家共27批次Rh血型抗原检测卡试剂盒，依据拟定标准的外观项目要求进行了验证，结果显示，所有试剂盒各组分齐全、完整，包装标签清晰，无磨损，试剂卡封口完好。检测卡中抗C柱、抗E柱、抗c柱、抗e柱、质控柱为无色或均匀乳白色；凝胶或玻璃柱形态完整无干裂无异物；各柱内填充物表面上有液体层；离心后，未见气泡，填充物表面未见倾斜。表明外观项目验证结果均符合行业标准规定。

2.2 特异性及灵敏度 采用6个厂家共27批次Rh血型抗原检测卡试剂盒，依据拟定标准的特异性及灵敏度项目要求进行了验证，结果显示，使用Rh C、c、E、e抗原阳性的纯合子和杂合子红细胞各2例进行Rh血型抗原检测，6个厂家Rh血型抗原检测卡抗C柱与RhC阳性红细胞均发生凝集反应，凝集强度为3+～4+，抗c柱与Rhc阳性红细胞发生凝集反应，凝集强度为3+～4+，抗E柱与RhE阳性红细胞发生凝集反应，凝集强度为3+～4+，抗e柱与Rhe阳性红细胞发生凝集反应，凝集强度为3+～4+；使用Rh C、c、E、e抗原阴性红细胞各2例进行检测，6个厂家Rh血型抗原检测卡抗C柱均与RhC阴性红细胞呈阴性反应，抗c柱均与Rhc阴性红细胞呈阴性反应，抗E柱均与RhE阴性红细胞呈阴性反应，抗e柱均与Rhe阴性红细胞呈阴性反应。表明特异性及灵敏度验证结果均符合行业标准规定。

2.3 效价比对6个厂家Rh血型抗原检测卡对RhC抗原纯合子的效价测定结果为1∶32～1∶256，对RhC抗原杂合子的效价测定结果为1∶32～1∶128，均高于相应国家参考品的同步效价检测结果。见表1。

表1 国家参考品的效价比对试验验证结果（1∶x）Tab.1 Validation results of titer comparison test of national standards（1∶x）

2.4 重复性 采用6个厂家Rh血型抗原检测卡各3批次，进行批内和批间重复性验证，结果显示，抗C柱、抗c柱、抗E柱、抗e柱分别与同一份RhC阳性、Rhc阳性、RhE阳性、Rhe阳性红细胞进行反应，30次检测均发生凝集反应，凝集强度均为3+～4+；抗C柱、抗c柱、抗E柱、抗e柱分别与同一份RhC阴性、Rhc阴性、RhE阴性、Rhe阴性红细胞进行反应，30次检测均呈阴性，均未发生凝集或溶血现象。表明批内和批间重复性验证结果均符合行业标准规定。

2.5 稳定性 热稳定性（采用厂家1、2、5的Rh血型抗原检测卡各1批次以及厂家3、6的各3批次）和效期稳定性验证（采用厂家2、3、4、6的过效期Rh血型抗原检测卡各1批次）中外观、特异性、灵敏度和批内重复性均符合拟定行业标准要求。

3 讨论

输血是临床治疗的一种重要手段，在临床急救及许多疾病的治疗中起着无法替代的作用［9-10］。如果受血者和供血者血型不合，则同种异体红细胞进入机体后会刺激机体产生免疫性抗体，引起同种免疫排斥，导致输血性反应。因此，输血治疗前必须对受血者和供血者进行血型检测，以避免同种免疫排斥的发生，保障临床输血的安全［11-12］。随着对红细胞血型研究的深入，国际输血协会已命名39个血型系统［13］，其中与临床输血密切相关的为ABO和Rh血型系统。而血型检测试剂的质量是安全输血的一个关键因素［14-16］。

Rh血型一般包含对D、C、c、E、e抗原的检测，国家药品监督管理局于2018年发布的YY／T 1592-2018《ABO正定型和RhD血型定型检测卡》中已对D抗原进行了规定［17］，为避免与其重复交叉，本研究制定的Rh血型抗原检测卡（柱凝集法）中不含对试剂D抗原的要求，仅对另4种临床使用密切相关的Rh血型C、c、E、e抗原进行规定。标准编写格式按照GB／T 1.1-2020《标准化工作导则》的格式要求进行。制定标准时遵循简化、统一、协调、优化的原则；既要考虑先进性，也要考虑实用性、可行性；既要符合国内外发展的需要，也要结合国内目前的实际状况。

本标准为首次制定，主要内容包括范围、规范性引用文件、术语和定义、要求、试验方法、标签和使用说明书、包装、运输、贮存、附录A（国家参考品）、附录B（检测所用红细胞）、参考文献。在相关技术指标的确定方面，参考了国内外相关技术文件以及目前市场上的产品说明书及性能评估资料［18-19］，并结合临床要求着重从保障临床安全输血精准配型角度出发，同时邀请众多业内专家对逐条性能指标进行了充分讨论。在产品特异性和灵敏度这2个关键性能指标中，不仅规定对RhC、c、E、e抗原纯合和杂合同时检测，还要求每个血型至少检测2例，提高了对Rh血型检测卡产品的质量要求。本研究选择了4家已获得医疗器械注册证的国产试剂盒以及2家已在国外上市的进口试剂盒，对标准中每一条性能指标和试验方法均进行了试验验证，关键指标效价评价还采用了相应的抗C（IgM）血型定型试剂效价测定用国家参考品进行考察［20］，验证结果全部符合标准规定的要求。综上所述，本研究制定的适用于柱凝集法的Rh血型抗原检测卡产品标准，所列技术指标合理，试验方法可靠、可行，能够规范此类试剂盒的技术要求和检验方法，有助于该类产品质量的提高，引领行业产业发展，并为相关部门的监管提供了科学依据。