KU蛋白在泌尿系肿瘤中的作用研究进展

饶晓胜，黄锦坤

(广州医科大学附属第一医院泌尿外科，广东省泌尿外科重点实验室，广东广州 510120)

自1981年日本学者首次在结缔组织病中发现了KU蛋白后[1]，人们对KU蛋白进行了多方面及多领域的研究，发现KU蛋白可参与多种细胞功能调控，如DNA损伤修复[1]、DNA复制、基因转录[2]、端粒维持[3]、细胞凋亡[4]等。近年来人们对KU蛋白有了更深入、更广泛的认识，已证实KU蛋白的多种细胞功能活动与恶性肿瘤的发生、发展、治疗、预后等有着密切的联系[5]。其中不乏KU蛋白在泌尿系肿瘤的研究。

1 KU蛋白的表达与结构

KU蛋白是广泛存在的蛋白质，在人体多个器官的正常组织及肿瘤组织内被发现呈阳性表达[6],有研究发现其在非洲瓜蟾的卵巢和睾丸中也表达[7]。KU蛋白是一种核蛋白，主要存在于核仁[1]。此外，有研究发现其存在于细胞质中[8]。研究发现KU异源二聚体中的KU70是一种膜蛋白[9]，这有待进一步研究证实。在DNA受损时，KU蛋白能够从核仁转移到核质，参与DNA损伤修复[10]。KU蛋白是由KU70和KU80组成的异源二聚体[11]，是一种自身抗原。

KU70和KU80由N-末端α/β结构域、中央β-Barrel结构域和螺旋状的羧基C-末端结构域组成[12]，其中每个结构域都发挥着不同的细胞功能，N-末端α/β结构域是DNA结合的核心结构域，破坏酵母此结构域已被发现会损害DNA修复[13]，KU80该结构域已被证明与一种非同源末端连接(non-homologous end joining，NHEJ)DNA修复酶相互作用蛋白(aprataxin and pnk-like factor，APLF)相互作用，对招募其他修复因子至关重要[14]。β-Barrel结构域位于KU蛋白二聚体中间，把DNA双链包裹，以支架的形式与DNA结合[12]。螺旋状的羧基C-末端结构域含有SAP结构域[15]，然而SAP结构域可以和其他SAP结构域蛋白的DNA结合[16]，此外C-末端结构域还可以与DNA依赖性蛋白激酶催化亚单位(DNA-dependent protein kinase catalytic subunit，DNA-PKcs)结合，调节DNA-PKcs的功能，当DNA损伤时，KU异源二聚体与双链DNA结合[17]，促进DNA-PKcs在DNA断裂时的自动磷酸化，通过NHEJ修复途径促进DNA双链断裂(DNA double-strand break，DSB)的修复[17]，众所周知，KU对于在DSB中招募和激活DNA-PKcs很重要。另一项研究发现，断裂的DNA序列和末端结构也可能在DNA-PKcs组装中发挥作用，特别是影响DNA-PKcs与KU80 C-末端之间的相互作用[18]。这是KU蛋白参与DNA损伤修复的桥梁。国外学者在荧光显微镜下利用KU异源二聚体和DNA末端结合状态下Förster共振能量转移(FRET)的差异来测量DNA结合和释放动力学，发现复合物比KU70、KU80单独使用更稳定，其稳定性受DNA依赖性蛋白激酶(DNA-dependent protein kinase， DNA-PK)磷酸化状态的影响。KU70、KU80的C端SAP结构域是KU70、KU80与DNA末端稳定结合所必需的，但这种作用在DNA-PK全复合物中被取消[19]，其中的未知机制有待深入研究。

最近，研究者用低温电子显微镜(CryoEM)研究了DNA-PKcs的晶体结构，发现DNA-PKcs和KU蛋白分别识别和结合DNA，共同导致DNA双链30°扭曲的模型[20]。研究者研究出了3.5°分辨率的DNA-PKcs的冷冻EM结构，并揭示了由KU80 C-末端介导的二聚体形成是KU80保守的C-末端螺旋的结构域交换[21]。揭示了DNA-PKcs二聚体将断裂的DNA末端连接在一起的新机制，这些模型或许能为基于结构的药物靶向治疗提供新思路。随着研究的深入，或许能够更加了解KU蛋白的结构及与DNA-PKcs之间的作用机制，为相关的疾病提供新的治疗手段。

2 KU蛋白参与的DNA损伤修复反应

细胞时刻受到内外源性的因素影响，当DNA 损伤时，依据损伤程度，可大致分为碱基损伤和单链断裂、双链断裂等多种形式，以DNA双链断裂最为严重。目前对KU蛋白的研究多为KU蛋白在DNA发生DSB时参与DNA损伤修复机制中的作用。DNA发生DSB时，可以通过同源重组(homologous recombination，HR)和NHEJ途径修复损伤的DNA双链。

当DNA发生DSB时，细胞是如何在两者中抉择的机制尚不清楚。最近的研究发现，在非洲瓜蟾卵提取液研究RecQ4N端598个氨基酸区域，可能通过影响KU异源二聚体与DNA末端的结合来影响DSB修复途径的选择[7]。另一研究证明CDK Pho85磷酸化YKU80来调节NHEJ活性，这可能是细胞通过G1-CDK介导HR和NHEJ修复途径之间的选择[22]。有学者在小鼠模型研究中发现DNA-PKcs T2609磷酸化能够促进NHEJ修复途径的选择[23]。同年，研究发现KU80泛素化也可以影响损伤细胞对NHEJ及HR途径的选择[24]。细胞在发生DSB时，目前不清楚在怎样的细胞环境下做出最合适、最优的选择，有待研究者进一步深入地研究。

HR具有较高保真度，其需要多种修复蛋白的参与，如MRN复合体、CHK2激酶，PARP基因、Rad50蛋白、ATM等。DNA链的断裂形成以后，CHK2在感知DNA损伤和激活DDR中起关键作用[25]。最近的研究发现Mre11核酸酶与Rad50和NBS1一起形成一个称为MRN的复合体[26]，参与HR途径的全过程。ATM蛋白可以磷酸化Rad50-Mrell-Xrs2复合物中Rad50蛋白的酪氨酸残基，从而促进了同源重组修复复合物形成[26]，一个研究小组证明了KU是ATM依赖的ATR激活所必需的蛋白[27]。

相比较HR，对KU蛋白在DNA损伤修复中作用的研究更多在NHEJ。NHEJ 可分为c-NHEJ和a-NHEJ,而c-NHEJ是修复DSB的主要通路[28]。如同HR修复，NHEJ也需要众多修复蛋白质的参与，如KU蛋白、DNA-PKcs、RecQ4、XRCC4、XLF、DNA连接酶Ⅳ(LigⅣ)、CRISPR/Cas13、DNA聚合酶μ等。当DNA发生双链断裂损伤后，KU异二聚体首先识别并结合到DNA的断裂末端，启动NHEJ[29]，通过KU80的C-末端结构域招募到DNA-PKcs[30]，与之结合成DNA-PK全酶，研究表明DNA的拓扑结构调节了CTD KU80参与KU70/80-DNA-PKcs相互作用[18, 30]。然后发出信号进一步募集其他修复蛋白，如 XRCC4 和DNA连接酶Ⅳ、XLF等因子形成修复复合物，然后再募集DNA聚合酶μ、DNA聚合酶λ等因子对DNA 末端进行修饰，使得修复复合物有效连接断裂的DNA 两端，再进行一系列机制完成DSB修复。

研究发现LigⅣ、XRCC4和XLF形成了一个长距离突触复合体，然而KU和DNA-PKcs组成的两个DNA末端结合子通过DNA-PKcs亚基与LigⅣ、XRCC4、XLF复合体支架相互作用而连接。DNA-PKcs分子的相对取向提示了反式作用中的一种自磷酸化机制，该机制导致DNA-PKcs的解离和向短程突触复合体的过渡。KU结合的DNA末端被XLF锚定的支架排列起来进行加工和连接，LigⅣ的1个催化结构域稳定地与2个KU分子之间的缺口相连，提示DSB的2条链的连接涉及2个LigⅣ分子[31]。此外，CRISPR/Cas13系统能有效地下调HEK293T细胞中KU70和的LigⅣ的表达[32]，这也许提示了CRISPR/Cas13系统在各种修复蛋白质作用期间起调节平衡作用，其中的机制及意义有待进一步研究。最近研究发现POLθ的N端具有DNA依赖的ATP酶活性，参与一条新的DSB修复路线，称为“替代末端连接”(alternative end joining,ALTEJ)。ALTEJ不依赖于DNA结合的KU蛋白复合体[33]。研究发现泛素连接酶RNF8能够促进ALTEJ，但可能需要有限的末端切除[34]。

目前研究虽然认识到了KU蛋白与DNA-PKcs及其他修复蛋白的作用，但是对其之间相互作用的调节机制了解不多。最近研究发现，一些RNA参与其中，如LRIK，是一种新的长链非编码RNA(long non-coding RNA)，能够与KU异源二聚体相互作用，增强了KU异源二聚体检测DSB存在的可能，促进KU异源二聚体在DSB位点的结合，并促进有效感应和修复DSB所需的下游修复因子的组装，而且LRIK对于通过非同源末端连接途径有效修复DSB是必要的[35]。有研究发现另一种RNA,称为LINP1，通过RNA-RNA相互作用自组装成相分离的凝聚体，以其中的结构基序与KU结合，促进KU的多聚化和NHEJ初始突触事件的稳定[36]。此外，脱泛素酶OTUD5通过增加KU80的稳定性而发挥着NHEJ修复的重要调节作用，OTUD5的缺失损害NHEJ的修复，从而降低了DSB的整体修复[24]。

3 KU蛋白与泌尿系肿瘤

泌尿系肿瘤是人类比较常见的肿瘤。研究发现KU蛋白所参与的细胞功能与泌尿系肿瘤的发生、发展、诊治和预后均有关联[12]。

3.1 KU蛋白与前列腺癌对于局部转移的前列腺癌，放射治疗是目前治疗肿瘤的一种重要方法和手段。其主要作用机制是通过射线放射损伤使前列腺癌细胞DNA双链断裂，从而杀灭肿瘤细胞[37]。而且雄激素能够直接调控DNA修复基因的表达，能直接与KU70相结合，刺激KU70的表达，并保护前列腺癌细胞免受DNA损伤[38]，RNA聚合酶2延长因子相关因子-2(RNA polymerase Ⅱ elongation factor-associated factor-2，EAF2)在雄激素调节前列腺癌细胞DNA修复中具有潜在的作用，EAF2和RNA聚合酶1延长因子相关因子-1(RNA polymerase I elongation factor-associated factor-1，EAF1)对于KU70、KU80在DNA损伤位点的募集和保留是必需的，并发挥着在非同源末端连接DNA修复中的功能作用。EAF2不影响KU蛋白的表达水平，仅使KU蛋白在DNA损伤末端的募集和保留减少[38]。另一研究表明缺氧诱导因子-1a(hypoxia inducible factor-1a，HIF-1a)能够通过诱导β-联合蛋白核易位促使KU70及KU80表达增高，从而增加前列腺癌细胞损伤修复能力，对放射敏感性下降[39]；RNA聚合酶2延长因子(RNA polymerase Ⅱ elongation factor，ELL2)是前列腺癌的抑癌基因，通过阻止聚合酶转录时的暂停来增强转录效率，并且可以抑制特定启动子的转录过程启动。ELL2对前列腺癌细胞损伤具有修复作用，能与KU70、KU80结合，但与KU80结合程度较KU70高，KU蛋白作为NHEJ通路DSB的感应器，增强DNA双链断裂的NHEJ修复途径[40]。我国学者黄锦坤、谭卉妍等[41-42]研究发现，抑制前列腺癌细胞中 KU70、KU80蛋白表达水平，结合热休克治疗，可明显提高前列腺癌细胞对放射治疗的敏感性。用免疫组化SP法检测前列腺癌标本KU70均阳性表达,而且表达强度与Gleason 评分和血清前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA) 相关，随着前列腺癌Gleason评分和血清PSA值升高,KU80蛋白表达水平明显增高[43-44]。酪氨酸蛋白酶抑制剂协同AG1024(IGF-1R磷酸化抑制剂)能够抑制RAD51和KU70水平，从而抑制了HR和NHEJ途径，使得前列腺癌细胞对放疗敏感性增高[45]。另一研究表明，磷酸二酯酶5(phosphodiesterase 5，PDE5)抑制剂能够降低RAD51水平及KU80与DNA断端的结合，从而抑制前列腺癌细胞的HR和NHEJ，使得前列腺癌细胞对放疗增敏[46]。这些研究都表明，KU蛋白很可能是治疗前列腺癌的一个重要靶点。此外，研究表明，KU70表达水平是前列腺癌的一个重要的独立预后因素，而且Gleason评分结合KU70表达水平能够指导前列腺癌的放疗剂量[47]。综上所述，KU蛋白与前列腺癌的发生发展、疗效、预后有着紧密关系，这可能为解决目前前列腺癌放疗抵抗性、化疗耐药性及靶向治疗等难题提供新的思路，是提升前列腺癌综合治疗及个体化治疗的不错方向。

3.2 KU蛋白与膀胱癌膀胱癌是我国最常见的泌尿系肿瘤，KU蛋白的细胞功能很可能参与膀胱癌的发生、发展。研究发现，X射线修复交叉互补蛋白5(X-ray repair cross complementing 5， XRCC5)是参与DSB的基因，在膀胱癌患者中的XRCC5启动子中较少地串联重复序列，与XRCC5蛋白水平升高相关，而且没有携带2个串联重复等位基因者患膀胱癌的风险更高[48]。这不难推测XRCC5基因直接或间接与KU蛋白相互作用，参与膀胱癌的发生。另一学者研究KU异源二聚体在膀胱癌中的表达及DNA结合活性，发现膀胱癌组织中KU活性和表达均高于正常组织，而且对两组研究对象分别行1 Gy或2 Gy的X射线照射后，评估KU的DNA结合活性，发现X射线照射后，正常细胞胞浆内磷酸化KU减少，细胞核内磷酸化KU增加。表明了KU蛋白可能在调节膀胱肿瘤DSB修复的DNA-PKcs活性中发挥作用[49]。此外，一项临床研究表明,KU蛋白在膀胱癌组织及其癌旁组织中均有表达[50]。KU蛋白无论是在肌层浸润性膀胱癌还是非浸润性膀胱癌组织中的表达量均较癌旁组织明显增高，同时发现KU蛋白表达量在肌层浸润性膀胱癌比非肌层浸润性膀胱癌明显减少，提示KU蛋白对膀胱癌的发生、发展及其侵袭性存在一定的关系。研究表明，E2F1(细胞周期相关转录因子-1)可直接反式激活KU70、KU80，影响膀胱癌细胞的侵袭性[51]。在治疗方面，最近的研究发现，伊马替尼对KU80敲除的膀胱癌细胞的放射增敏[52]。总的来说，如今对KU蛋白在膀胱癌的发生发展机制认识不多，需要更多学者进一步研究。

3.3 KU蛋白与肾细胞癌肾细胞癌，是泌尿系统三大肿瘤之一，严重威胁人类的身体健康。然而研究者对KU蛋白与肾细胞癌的发生发展机制研究不及前列腺癌。有临床研究KU70基因多态C-1310G和肾细胞癌预后的关系，发现KU70基因启动子区的C-1310G能够显著降低KU70基因的转录活性[53]，这也许说明KU蛋白参与了肾细胞癌的发生过程，其中更深入的机制有待研究。QI等[54]研究KU70表达水平对肾癌细胞放射敏感性的影响，发现上调786-O细胞的KU70表达水平，能够降低肾癌细胞对辐射的敏感性，下调则可显著增强肾癌细胞对辐射的敏感性，这提示了KU蛋白可能与肾细胞癌对放疗不敏感有着紧密联系。除了放疗治疗，有学者研究发现热疗也许是一种不错的抗癌方法。探讨热疗对肾癌786-O细胞的影响及机制，发现高温可诱导肾癌786-O细胞凋亡，而且能够显著抑制KU80的表达[55]，高温是否可抑制KU80 的表达从而诱导了肾癌细胞的凋亡，有待研究。在肾癌病因方面，研究表明KU70A-31G多态性与肾细胞癌的发生及遗传性有关[56]。

3.4 KU蛋白与睾丸肿瘤及阴茎癌目前国内外有待对KU蛋白在睾丸肿瘤及阴茎癌中的更多研究。

4 总结与展望

KU蛋白自发现以来，受到学者广泛关注及研究，从而对KU蛋白的认识更加深入及广泛，现已明确其主要与一些免疫性疾病、恶性肿瘤的发生发展有着密切联系。同时KU蛋白在前列腺癌发生、发展、治疗、预后方面也得到许多研究。相对而言，在肾细胞癌及膀胱癌的研究稍欠缺。本文对KU蛋白主要参与的DNA损伤修复功能在泌尿系肿瘤的研究进展做了综述，较全面地总结了其中的机制。在未来，随着对KU蛋白的研究更加深入，也许能够更好地开发靶向KU蛋白在泌尿系统肿瘤中的治疗策略。