宋小仙,徐 进,罗明和,张 应,2△
(1.重庆市中药研究院,重庆 400065; 2.重庆市疾病预防控制中心,重庆 400042)
植物内生菌是与健康植物共生或仅一段时间寄生在植物体内的微生物,与植物共生或寄生,相互影响,与植物体一样能产生大量结构新颖的活性次生代谢产物。研究发现,植物含有或产生的活性产物极可能来自其内生菌。微生物资源可进行基因工程改造,并通过发酵工程等技术提高其产量,环境友好,可持续利用,是目前药用植物研究的重要方向。铁皮石斛味甘,性微寒,含有多种生物活性成分,其提取物具有抗肿瘤、抗凝血、调血脂、调血压、提高免疫力和抗衰老等药用价值和保健功效。前期研究发现,内生真菌Fusariumsp.TP-G1的次生代谢产物trichosetin,beauvericins,enniatins,fusaric acid 具有抗菌、抗肿瘤、降血压等活性,提示植物内生菌产生的次生代谢产物与药用植物的功效有一定关联性[1-6]。本研究中以药用植物铁皮石斛内生真菌Fusariumsp.TP-G1为研究对象,并对其大米发酵产物的次生代谢物进行初步研究。本研究中对Fusariumsp.TP-G1 的次生代谢产物进行分离纯化及结构鉴定,发现已知的6种化合物中化合物3至化合物6为新的氨基醇类天然产物。现报道如下。
仪器Agilent 600 MHz DD2 型核磁共振仪(600/150 MHz,四甲基硅烷为内标);Bruker amazon SL 型离子肼质谱仪;Agilent 1260型高效液相色谱仪(配有PDA检测器);YMC-pack ODS-A型色谱柱(250 mm×10 mm,5µm);HS-GF254硅胶薄层板(烟台江友硅胶开发有限公司)。
试剂:乙腈(色谱纯,安徽时联特种溶剂有限公司);其他试剂均为分析纯。
植物内生真菌Fusariumsp.TP-G1 是从药用植物铁皮石斛中分离而来,并已鉴定[1]。
马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)培养基:去皮马铃薯(200 g/L),切成小块,加水煮沸30 min,用纱布过滤,取滤液,加葡萄糖(20 g/ L)、海盐(30 g/ L)、2%琼脂粉,115 ℃灭菌30 min。
马铃薯葡萄糖水(PDB)培养基:PDA 培养基配方中不加2%琼脂粉,115 ℃灭菌30 min。
大米培养基:大米100 g,酵母粉0.2%,NaH2PO40.02%,KNO30.05%,NaCl 1%,121 ℃灭菌30 min。
吸取50 mL PDB 培养基,置250 mL 锥形瓶中,从PDA 平板上接入真菌Fusariumsp.TP - G1 的菌丝体,于28 ℃、200 r/ min 摇床上培养2 d,作为发酵种子液,分别转入含300 g 大米培养基的2 L 锥形瓶中,室温静置发酵30 d,共发酵2.5 kg。
将静置发酵产物用甲醇浸提,甲醇经蒸馏浓缩后得到总浸膏,粗浸膏伴样,过一正相柱,用氯仿- 甲醇体系(100∶0,99∶1,98∶2,96∶4,94∶6,92∶8,90∶10,85∶15,80∶20,5∶5,V/V)梯度洗脱,得Fr.A1~A10 共10 个馏分。Fr.A2 采用正相硅胶氯仿-甲醇体系和乙酸乙酯-石油醚体系反复纯化,分离获得化合物1(50 mg)、化合物2(30 mg)。Fr.A(3-5)合并后,采用中压反相液相色谱(MPLC)法(条件为5%~60%乙腈50 min,60%~100%乙腈40 min),分别得到Fr.B1~B5。Fr.B1~B3合并后,采用相同条件MPLC 法获得Fr.C1~C8。Fr.C2 和Fr.C7 分别采用高效液相色谱(HPLC)法制备获得化合物4(20 mg)、化合物3(18 mg)。Fr.C 4~6合并后,采用HPLC法制备获得化合物5(15 mg)、化合物6(16 mg)。
各化合物的化学结构见图1。
化合物1:1H NMR(CDCl3600 MHz)δH:5.54(1H,dd,J =5.4,2.4 Hz),5.36(1H,m),5.19(1H,dd,J =7.2,15.0 Hz),5.15(1H,d,J =7.8,15.6 Hz),3.61(1H,m),1.01(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-21),0.92(3H,s,CH3- 19),0.89(3H,d,J =7.2 Hz,CH3- 28),0.82(3H,d,J=6.6 Hz,CH3-26),0.80(3H,d,J=6.6 Hz,CH3- 27),0.61(3H,s,CH3- 18);13C NMR(CDCl3,150 MHz)δC:12.3(C - 18,CH3),16.5(C - 28,CH3),17.8(C-19,CH3),19.9(C-26,CH3),20.2(C-27,CH3),21.3(C-11,CH2),21.3(C-21,CH3),23.2(C-15,CH2),28.5(C-16,CH2),32.2(C-2,CH2),33.3(C-25,CH),37.3(C-1,CH2),38.6(C-10,C),39.3(C-12,CH2),40.6(C-20,CH),41.0(C-4,CH2),43.0(C-24,CH),43.1(C-13,C),46.5(C-9,CH),54.8(C-14,CH),56.0(C - 17,CH),70.7(C - 3,CH),116.5(C-7,CH),119.8(C - 6,CH),132.2(C - 23,CH),135.8(C-22,CH),140.0(C-5,C),141.6(C-8,C)。与文献[7]报道的麦角甾醇的核磁数据一致,故鉴定该化合物1为麦角甾醇。
化合物2:1H NMR(CDCl3600 MHz)δH:6.21(1H,d,J =8.4 Hz),6.47(1H,d,J =8.4 Hz),5.19(1H,d,J=7.8,15 Hz),5.11(1H,d,J=7.8,15 Hz),3.93(1H,m);13C NMR(CDCl3,150 MHz)δC:12.9(C - 18,CH3),17.5(C-28,CH3),18.1(C-19,CH3),19.6(C-21,CH3),20.0(C-26,CH3),20.6(C-11,CH2),20.9(C- 27,CH3),23.4(C-16,CH2),28.6(C-15,CH2),30.1(C-2,CH2),33.1(C-25,CH),34.7(C-4,CH2),37.0(C-10,C),37.1(C-1,CH2),39.4(C-12,CH2),39.7(C-20,CH),42.7(C-24,CH),44.6(C-13,C),51.1(C-18,CH3),51.7(C-14,CH),56.2(C-17,CH),66.5(C-3,CH),79.4(C - 5,C),82.1(C - 8,C),130.7(C - 6,CH),132.3(C - 22,CH),135.2(C - 23,CH),135.4(C-7,CH)。与文献[8]报道的(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol的核磁数据一致,故确定该化合物2为(22E,24R)-ergosta-6,22-dien-3β,5α,8α-triol。
化合物3:H谱低场区的5 个芳环H质子信号结合C谱低场区的C原子信号提示结构中可能含有1 个单取代苯环,而二维多键碳氢关系(HMBC)谱中7.20/130.5;7.25/127.3,130.5;7.29/129.4,140.1 的相关信号进一步验证单取代苯环片段。高场区通过异核单量子关系(HSQC),HMBC 谱中的相关信号可推测2 个脂肪链片段。上述3个片段通过二维HMBC谱中2.71,2.9/130.5,140.1;7.25/38.6;3.80/140.1,158.0连接成化合物3的结构。最后,根据高分辨获得的分子式C14H21NNaO3,鉴定化合物3 为tert - butyl(1 - hydroxy - 3 - phenylpropan-2-yl)carbamate。其核磁数据归属为,1H NMR(CD3OD 600 MHz)δH:1.40(9H,s),2.71(1H,dd,J=8.4,13.2 Hz,),2.90(1H,dd,J=6,13.8 Hz),3.52(2H,d,J=5.4 Hz),3.80(1H,m),7.20(1H,t,J=6.0 Hz),7.27(4H,m);13C NMR(CD3OD,150 MHz)δC:28.9,38.6,55.4,64.6,80.0,127.3,129.4,130.5,140.1,158.0;(+)-HR-ESI-MSm/z274.141 7([M+Na]+,计算得到C14H21NNaO3,274.141 4)。与文献[9]报道的tert-butyl(1-hydroxy-3-phenylpropan-2-yl)carbamate 的核磁数据基本一致,故鉴定化合物3 为tert -butyl(1 - hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl)carbamate。
化 合 物4:1H NMR(CD3OD 600 MHz)δH:2.79(1H,dd,J=6.6,13.2Hz),2.85(1H,dd,J=6.6,13.8Hz),4.09(2H,m),4.33(1H,m),7.21(2H,d,J= 7.8 Hz),7.23(1H,d,J= 7.8 Hz),7.30(2H,t,J= 7.8 Hz);13C NMR(CD3OD,150 MHz)δC:41.9,54.9,70.7,128.0,129.8,130.5,137.8,162.1。与文献[10]报道的化合物(1-hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl)carbamic acid 的核磁数据基本一致,故鉴定化合物4为该化合物。
化合物5:1H NMR(DMSO -d6600 MHz)δH:2.78(1H,dd,J=9.0,13.8 Hz),2.94(1H,dd,J=4.8,13.8 Hz),3.42(1H,m),3.49(1H,m),4.15(1H,m),4.84(1H,t,J= 6.6 Hz),7.13(1H,t,J= 6.6 Hz),7.24(4H,m),7.41(2H,t,J=7.8 Hz),7.47(1H,t,J=7.2 Hz),7.77(2H,d,J=7.8 Hz),8.15(1H,d,J=8.4 Hz);13C NMR(DMSO -d6,150 MHz)δC:36.9,53.7,63.3,126.3,127.6,128.5,128.6,129.5,131.4,135.2,139.9,166.4。与文献[11]报道的化合物N-(1-hydroxy-3-phenylpropan-2-yl)benzamide 的核磁数据一致,故鉴定该化合物为化合物5。
化合物6:H谱、C谱的低场区信号,结合二维HMBC谱可推测含有两个单取代苯环。而高场区的H 谱、C 谱信号及1 个肽键C 原子信号173.9,结合二维HSQC,HMBC谱中4.14/139.8,173.9,38.0,64.4;3.45/130.2,173.9,137.0,提示化合物6 中含有1 个连苯环并含有1 个肽键的脂肪链片段。二维HMBC 谱中信号2.70,2.92/ 130.5,139.8;7.17/ 38.0;3.45/ 130.2,137.0;7.14/ 44.1 显示含有1 个肽键的脂肪链片段通过2 个—CH2与两个单取代苯环分别连接成化合物6的结构。最后,根据高分辨获得的分子式C17H19NNaO2进一步确认,鉴定化合物6为N-(1-hydroxy-3-phenylpropan-2 - yl)- 2 - phenylacetamide。其核磁数据归属为,1H NMR(CD3OD 600 MHz)δH:2.70(1H,dd,J= 9.0,13.8 Hz),2.91(1H,dd,J= 6.0,13.8 Hz),3.42(1H,d,J=14.4 Hz),3.46(1H,d,J=14.4 Hz),3.53(2H,d,J=5.4 Hz),4.13(1H,m),7.13(2H,d,J=7.8 Hz),7.17(3H,m),7.22(5H,m);13C NMR(CD3OD,150 MHz)δC:38.0,44.1,54.3,64.4,127.4,127.9,129.5,129.6,130.2,130.5,137.0,139.8,173.9.(+)- HR - ESI -MSm/z292.131 1 ([M + Na]+,计 算 得 到C17H19NNaO2,292.130 8)。与文献[12]报道的化合物N-(1 - hydroxy - 3 - phenylpropan - 2 - yl)- 2 -phenylacetamide 的核磁数据一致,故鉴定化合物6 为该化合物。
本研究中铁皮石斛内生真菌Fusariumsp.TP - G1的大米发酵产物中分离获得化合物3 至化合物6 的氨基醇类天然产物,并对上述化合物进行结构鉴定,发现菌株的营养和生长条件对其次生代谢产物产生重大影响。氨基醇类化合物是一类用途广泛的有机化合物,在化学合成和药物化学中都有重要应用[11]。在化学合成中,氨基醇类化合物可用作手性助剂拆分不对称合成中的外消旋混合物;在药物化学中,氨基醇是某些重要药物的药效基团,如抗逆转录病毒蛋白酶抑制剂沙奎那韦、利托那韦、洛匹那韦、印地那韦、奈非那韦和安普列那韦,可特异性地使蛋白酶失活,阻止人类免疫缺陷病毒的复制。目前,主要通过化学合成获得氨基醇类化合物,但其化学反应条件剧烈,产量低,纯化困难[11]。前期研究发现,化合物3 至化合物6 仅可通过化学合成获得。本研究中从铁皮石斛内生真菌Fusariumsp.TP-G1的大米发酵产物中分离获得4 个新的天然氨基醇类次生代谢产物,表明微生物是氨基醇类化合物的新供体,后期可通过微生物的基因工程改造来获得更多的氨基醇类化合物,并对其生物合成机制进一步进行阐释。