外源性电刺激诱导干细胞心肌向分化的研究进展

戴越 周帆 穆军升

(1.首都医科大学附属北京安贞医院心脏外科 北京市心肺血管疾病研究所，北京 100029；2.解放军总医院第三医学中心超声科，北京 100039)

心血管疾病由于其高发病率而成为危害全世界人类健康的主要问题[1]。如果发生心肌梗死(myocardial infarction，MI)，存活的心肌细胞(cardiomyocytes，CM)数量会下降。随着MI后纤维瘢痕组织的形成和心室组织的重塑，这不仅不利于心脏泵血，反而会造成剩余的心肌肥厚，梗死区心肌变薄，心室扩张。最终，导致心力衰竭发作。目前，临床上没有一种治疗方式可逆转MI造成的心肌损伤，因此临床迫切需求新的治疗方式来提高CM活性以改善心脏功能。通过将干细胞来源CM移植到MI区来修复受损的心肌和恢复心脏功能，被认为是治疗MI最有前途的方式之一[2-3]。

然而，干细胞来源CM的特点是分化率低和不成熟状态，其被移植到受损心脏后存在心律失常的风险，无法执行正常CM的功能[4-5]。在心脏收缩过程中，起搏器细胞从窦房结发出节律性电信号，通过细胞缝隙连接传播至CM，再通过高导电性的浦肯野纤维传导至心脏其他区域，最终实现整个心脏的节律性收缩。在此过程中，电信号和缝隙连接对心脏的同步搏动至关重要[6]。近些年，电刺激(electrical stimulation，ES)因其为非药物治疗手段以及在疾病治疗方面的安全、方便、经济等特点而受到广泛关注。因此，外源性ES模仿心脏原始环境来诱导干细胞心肌向分化，成为了一种很有前途的方法[7-8]，这将进一步推动干细胞在MI治疗的临床应用进程。

1 外源性ES影响干细胞诱导分化的因素

CM之间通过闰盘结构形成缝隙连接，有利于细胞间的电兴奋传导并根据电信号在节律上同步收缩[9]。为了促进干细胞心肌向分化，在应用ES来模拟心脏电生理信号的过程中，优化所施加电场刺激的参数至关重要[10]。

1.1 脉冲方向

根据电流方向是否改变可分为单相脉冲和双相脉冲。虽然单相脉冲能有效地刺激CM产生动作电位，但也会产生活性氧等物质造成组织损伤。双相脉冲可有效防止组织损伤，但相应的其产生的中次级脉冲超极化可能会抑制动作电位的启动[11]。

Baumgartner等[12]对胎鼠CM连续6 d施加振幅1 V、脉宽5 ms和频率10 Hz的单相脉冲，ES促进了细胞形态伸长和平行排列以及缝隙连接蛋白(connexin，Cx)43的表达。Pietronave等[13]对人类祖细胞分别施加电场强度2.5 V/cm、频率1 Hz和脉宽1 ms的双相方波脉冲以及具有相同总幅度和持续时间的单相方波脉冲(5 V/cm、1 Hz和2 ms)。他们发现双相脉冲刺激组更早表达Cx43，早期心脏转录因子表达上调，如肌细胞增强因子2D、锌指转录因子蛋白4和Nk2型同源盒转录因子5，以及晚期心脏肌节蛋白表达增加，如心肌肌钙蛋白T、心脏α-肌动蛋白和肌浆内质网Ca2+ATP酶。说明双相脉冲更快、更有效地促进了人类祖细胞的心肌向分化。综上，单相脉冲刺激可更有效产生动作电位，引起更少的电极腐蚀，但会在长期刺激中增加组织损伤；而双相脉冲刺激可长期产生有效刺激并不会引起组织损伤，虽然与单相脉冲相比不易产生有效动作电位和更易产生电极腐蚀，但双向脉冲刺激可通过改变ES条件，如双向电荷平衡和双向电荷不平衡等来减少相应的副作用[11]。因此双相脉冲ES具有更优的选择性，可能对长期干细胞心肌向分化过程更有利。

1.2 电场强度与持续时间

对于相同的电场强度，当脉冲持续时间较长时，细胞凋亡率更高[14]。因此在体外对细胞施加ES时，协调其电场强度和持续时间十分重要。

为了探究ES持续时间对人心球源性细胞(human cardiosphere-derived cells，hCDCs)心肌向分化的影响，Nazari等[15]向hCDCs施加强度为150 mV、频率1 Hz和电流2 mA的电荷平衡双相脉冲，并分别持续1、3和5 d，每天ES 5和10 min。结果发现持续5 d，每天ES 10 min组的心肌肌钙蛋白T和锌指转录因子蛋白4表达最高，但α-肌球蛋白重链表达下降。Ma等[16]应用1 V/cm、5 Hz的参数对人诱导多能干细胞(human induced pluripotent stem cells，hiPSCs)施加持续30 d的ES后，发现心源性基因表达上调，并将诱导分化的心肌样细胞(hiPSC-derived CMs，hiPSC-CMs)注射到小鼠梗死心脏区后，发现心脏功能的改善和梗死面积的减少。

1.3 ES起始作用时间

ES的影响部分程度上取决于第一次ES时细胞的分化程度。如果施加时间太早，ES会抑制心肌蛋白的聚集并产生不良的收缩行为。如果施加时间太晚，ES不再有助于细胞的功能组装。

Radisic等[17]分别对1、3和5 d龄的新生大鼠心室肌细胞施加ES。1 d龄的心室肌细胞受到ES后，Cx43和α-肌球蛋白重链含量均下降，产生低度分化的单层CM，无法产生同步收缩。而5 d龄的心室肌细胞受到ES后只建立缝隙链接，无有效的收缩功能。最终发现3 d龄的新生大鼠心室肌细胞ES处理后具有更优的收缩能力和缝隙链接。Ronaldson-Bouchard等[18]对体外培养的hiPSC-CMs早期(第一次自发收缩后，第12天)和晚期(第28天)施加ES，结果发现早期hiPSC-CMs显示出明显的可塑性，说明hiPSCs对ES反应性随分化进程的进行而下降。Chen等[19]分别对4、7和12 d龄的拟胚体施加ES，这分别对应于干细胞分化的早期、中期和末期3个阶段，ES参数为电流强度10、30和60 μA、频率1 Hz、脉宽10 ms的双相ES培养4 d。低强度ES对早期分化阶段的干细胞作用不大，但在60 μA的ES下，其β-肌球蛋白重链水平显著增加。对于中期分化阶段的干细胞而言，β-肌球蛋白重链和肌钙蛋白T在30 μA刺激时表达增加，而在60 μA时表达降低。在末期分化阶段，肌钙蛋白T表达水平随ES幅度增加而增加。这说明不同分化阶段的胚胎干细胞对ES有不同程度的敏感性，因此根据ES起始作用时间来调整其参数是十分重要的。

1.4 频率

ES频率可影响CM的收缩和搏动行为。频率为1～2 Hz的ES可诱导细胞内Ca2+水平瞬时激增，同时促进肌节组装和成熟[7]。有证据[8]表明，自主搏动hiPSC-CMs的搏动频率随着ES频率变化而变化，即使在ES停止后，hiPSC-CMs获得的搏动频率也可保持在所施加的ES频率水平并持续传导到周围细胞中。因此，在分化或成熟过程中，由于hiPSC-CMs具有电生理可塑性，易导致生成具有与移植目标心肌区域不同搏动频率的心肌样细胞，这将有引起心律失常的风险，而搏动频率是由ES诱导决定的，因此应优化ES频率。

Tandon等[20]对新生大鼠CM的组织工程心脏构建体施加3 V/cm，脉宽2 ms，频率分别为1、3和5 Hz的单相方波脉冲。研究表明3 Hz组有最高浓度的心肌肌钙蛋白和Cx43以及最好的收缩行为。Zhang等[21]对预培养2 d后的hiPSC-CMs施加ES。首先以1 Hz的频率连续刺激5 d，然后每天以1 Hz的频率递增刺激，直到频率达到6 Hz并保持6 Hz频率2 d，最后再以1 Hz频率刺激14 d。观察到hiPSC-CMs的Cx43表达增高，形成了更成熟表型的功能性心脏组织。Hirt等[22]设计了两种ES方案：频率恒定0.5 Hz和第1周2 Hz随后1.5 Hz，电场强度2 V/cm，脉宽4 ms的双相脉冲，分别作用于hiPSC-CMs，第2种方案衍生的CM具有更强的自发搏动和更高的细胞质与细胞核比。Ronaldson-Bouchard等[18]也对hiPSCs施加了两种方案的ES，4.5 V、2 ms单相方波脉冲：(1)2 Hz刺激3周；(2)2周内频率从2 Hz到6 Hz(每天增加0.33 Hz)，然后2 Hz培养1周。结果是第2种方案刺激效果更好，进一步验证了增加诱导收缩的ES频率可促进被诱导分化细胞的超微结构形成和功能发育。Nunes等[23]对hiPSC-CMs施加7 d的ES，电场强度为5 V/cm，脉宽1 ms，频率从1 Hz开始逐步增加到3 Hz或6 Hz。他们发现与1～3 Hz的低频增加方式相比，1周内1～6 Hz的起搏频率可进一步增强工程心肌组织的结构和电生理功能。而Zhao等[24]对胚胎干细胞和诱导多能干细胞来源的CM组织施加两种ES方案，方案一是频率从2 Hz到6 Hz，每周增加1 Hz，方案二是频率从1 Hz到6 Hz，每天增加0.2 Hz，其余条件保持一致。结果发现两种方案都可促进心脏组织功能发育，并且心肌肌钙蛋白T和Cx43等心肌蛋白表达没有区别，但方案一具有更高的收缩间歇后力增强效应、最大捕获速率等结果，这说明方案一刺激下组织成熟度更高。因此合理的频率递增将更有助于干细胞心肌向分化并促进组织成熟度。

2 ES诱导干细胞心肌向分化的相关机制

虽然研究表明ES可在心脏发育成熟的过程中起到关键作用，但其中涉及的机制尚不完全清楚。

2.1 过去研究

伍长学等[25]发现随ES时间推进，肌细胞增强因子2C基因的表达上调，进而促进肌钙蛋白I的表达和CM的形成。Genovese等[26]发现ES后人骨髓间充质干细胞中卵泡抑素的表达上调，证明短期ES促进了人骨髓间充质干细胞的心肌向分化。近年来，卵泡抑素已被证明是肌肉发育、分化和再生的关键。它可通过参与中胚层和内胚层组织的修复来促进细胞增殖并限制纤维化[27]。

2.2 最新进展

He等[28]发现在ES的作用下，骨髓间充质干细胞发生心肌向分化原因之一是转化生长因子β1表达上调，促进了Cx43和肌动蛋白α2的表达，并且这一过程受转化生长因子β1抑制剂吡非尼酮的影响。

Nazari等[15]对hCDCs施加ES，发现hCDCs的分化高度依赖于电流的同步传输。这是通过由最佳排列和伸长的CM构成的名为“合胞体”的结构实现的。当施加恒定幅度的脉动电流，受到刺激hCDCs横向堆积，即与电流方向垂直。对齐的CM开始像电容器一样发挥作用，响应于施加的ES而充电和放电。CM的这种搏动特性促进了同步肌纤维收缩的形成。

Crestani等[29]发现暴露于ES的hiPSC-CMs中的闰盘蛋白伴肌动蛋白相关锚定蛋白和β-连环蛋白的表达增加。Wnt/β-连环蛋白信号传导通路已被证实在hiPSCs心肌向分化和缝隙连接形成中起着重要作用[30]。伴肌动蛋白相关锚定蛋白表达参与发育过程中的肌原纤维肌生成和成熟肌肉中的细胞-细胞连接[31]。表明ES可能通过激活Wnt/β-连环蛋白通路促进hiPSC-CMs成熟度的提高。

Ma等[16]发现ES促进hiPSCs心肌分化，可能机制为激活Ca2+/蛋白激酶C/细胞外信号调节激酶通路。蛋白质印迹表明，ES增强了Ca2+结合蛋白(钙调蛋白1和3)和蛋白激酶C表达以及细胞外信号调节激酶磷酸化，抑制了组蛋白去乙酰化酶1的表达，以上两种效果均可被钙信号抑制剂消除甚至逆转。钙信号抑制剂包括维拉帕米(钙通道阻滞剂)、W-7(钙调蛋白拮抗剂)和8-(N，N-二乙胺)-n-辛基-3，4，5-三甲氧基苯甲酸酯(细胞内钙离子拮抗剂)。有研究表明，当骨髓间充质干细胞中组蛋白去乙酰化酶1基因表达受到特异性抑制时，与心肌发育和结构相关的基因的mRNA表达水平升高[32]。因此，ES可能通过激活细胞内Ca2+信号和下游基因来增强hiPSCs的心脏基因表达。

Haneef等[33]发现将ES作用于3D胶原支架上的干细胞可促进其心脏标志物的表达，并发现3D胶原支架具有类似于天然的细胞外基质(extra cellular matrix，ECM)功能，如提供结构强度和抗变形能力。ECM主要由为左心室提供结构强度的胶原蛋白组成。最新研究[27]表明，这可能与糖胺聚糖(glycosaminoglycan，GAG)的导电性和胶原蛋白的压电性有关。GAG在ECM中广泛分布，富含可电离的羧基和硫酸根，具有电荷转移特性。在施加ES期间，GAG充当ECM到细胞的电导管。同时，ES会增加蛋白多糖的合成，每一种蛋白多糖都含有特定的GAG侧链，特定的GAG侧链对组织功能和发育具有重要意义。与此同时，胶原蛋白具有固有压电特性，当组织被压缩时会产生电荷，对嵌入其中的细胞产生调节作用。胶原组织是由高度排列的纤维状Ⅰ型和Ⅱ型胶原堆积和交联结构组成的，主要存在于骨、软骨组织[34]和心肌[35]。

3 ES作用于干细胞来治疗MI的问题与展望

不同条件下，不同的ES参数可能对应着不同干细胞的不同分化方向，如心房、心室、传导细胞等。Chan等[36]认为电场强度6.6 V/cm、脉宽2 ms和频率1 Hz的双相脉冲刺激是人胚胎干细胞源CM最佳ES参数。Hernández等[37]发现ES诱导干细胞心肌向分化受细胞系影响。Crestani等[29]发现当ES参数为10 V、4 ms、1 Hz和2 h/d时，人类多能干细胞向更成熟的心室传导样细胞分化，心室传导系统相关基因表达增高，Cx40表达增高，Cx43表达(由缝隙连接蛋白α1编码)下降。易洛魁族同源盒3基因在精确调节细胞间缝隙连接耦合和心脏脉冲传播中起到关键作用，可直接抑制Cx43转录并间接激活Cx40转录[38]。

未来工作的领域包括摸索出完善的ES条件对应不同干细胞的模型标准，为后续进一步完善ES诱导分化机制的研究，将组织工程与相关干细胞心肌向分化ES方案结合，这在MI治疗的临床应用研究方面具有广阔前景。

4 结论

综上所述，ES是解决干细胞来源CM分化率低和不成熟的有效方法之一。在临床实践中，应根据不同的干细胞量身定制ES方案，以产生最佳的促进效果。此外，如果在ES的同时施加其他相关刺激，可能会产生协同或拮抗作用，如机械刺激、基质等。