反刍动物叶酸营养研究进展

■刘 强

（山西农业大学动物科学学院，山西太谷 030801）

叶酸（folic acid，FA）是瘤胃微生物和反刍动物的 必需营养因子，作为一碳单位的载体，参与嘌呤、嘧啶的合成和蛋氨酸的再生，对DNA 的甲基化、细胞分裂、蛋白质和脂质等代谢具有重要调控作用[1]。反刍动物瘤胃微生物能合成叶酸，合成量随日粮精料比例的提高而增加[2]。饲料中的叶酸主要为多聚谷氨酸，在肠道内被γ-谷氨酰羧肽酶水解成谷氨酸单体或二谷氨酸后，主要在小肠近端被主动吸收[3]。叶酸也能通过扩散作用被动吸收，因此，瘤胃壁也能吸收少量的叶酸[3]。在消化道壁和肝脏中，叶酸在二氢叶酸还原酶连续还原作用下转化为二氢叶酸和四氢叶酸，四氢叶酸是叶酸的辅酶形式，称为辅酶F（CoF），主要存在于肝肠门脉循环，经胆汁排泄[3]。血液中的叶酸主要以5-甲基四氢叶酸的形式存在。肝脏是叶酸代谢的主要器官，吸收后的叶酸，约50%以多聚谷氨酸的形式贮存在肝脏中[2-3]。反刍动物外源甲基供应不足，对叶酸的需求量较高[2]。最近的研究发现，日粮中含有的和瘤胃微生物合成的叶酸不能满足反刍动物和瘤胃微生物的需求[2]，因此，反刍动物叶酸营养的研究和叶酸在生产中的应用成为热点。

1 叶酸在牛生产中的应用

补充叶酸能提高反刍动物生长性能。日粮中的叶酸约97%在瘤胃中被微生物降解或破坏，到达小肠被吸收的量不到3%[2]，因此，生产中成年反刍动物应使用包被叶酸添加剂。试验证明，采用pH 敏感材料作为壁材制作的包被叶酸添加剂，能降低叶酸在瘤胃中的释放率，使添加的叶酸既能满足瘤胃微生物的需求，又能最大限度达到小肠[4-6]。研究发现，10日龄犊牛每周肌肉注射叶酸40 mg，断奶后日增重、血液叶酸和血红蛋白浓度、肝脏组织RNA/DNA增加[7]；犊牛或生长牛日粮中补充叶酸，日增重和饲料利用率提高[6，8]。

补充叶酸有助于改善泌乳牛产奶性能。叶酸影响蛋氨酸、DNA和RNA的合成，参与奶牛繁殖和乳蛋白合成代谢的调控[1-2]。依据NRC（2001），体重650 kg、日产乳脂矫正奶35 kg 的泌乳奶牛，叶酸需要量为35 mg/d，但是，瘤胃叶酸合成量只有4 mg/d[2]，需要外源补充才能满足需求。试验发现，围产期奶牛日粮中添加包被叶酸，乳和乳蛋白产量提高，能量平衡改善[4-5]；泌乳后期奶牛每周肌肉注射叶酸160 mg，产奶量提高了14%[9]；经产泌乳牛日粮中添加叶酸，奶中粗蛋白和酪蛋白的含量增加，且增加的幅度随着泌乳期的延长而提高[10]。

叶酸的添加效果与奶牛的泌乳阶段、胎次、日粮中维生素B12及甲基供体（蛋氨酸或甜菜碱）的含量有关。试验发现，日粮中添加包括叶酸的瘤胃保护B族维生素混合物，泌乳早期奶牛乳、乳脂肪和乳蛋白产量均提高，泌乳中期奶牛乳和乳脂肪产量不变，乳蛋白产量提高[11]。试验结果产生的原因，可能与不同阶段泌乳牛干物质采食量和对叶酸的需要量不同有关。相对于产奶量而言，泌乳早期奶牛的干物质采食量较低[11]，而且，因为胎盘胎儿复合体对叶酸的需求，产前2 周，奶牛血液叶酸水平下降40%，分娩后血液叶酸浓度提高，肝脏中叶酸的浓度在产后2周开始升高，8周达到最高[2,12]。初产牛血液叶酸浓度低于经产牛[13-14]，试验发现，日粮中添加叶酸，初产奶牛产奶量无显著变化，经产奶牛产奶量显著提高[15]。但是，日粮中维生素B12供应不足时，添加叶酸对经产牛305 d产奶量和乳成分产量无显著影响[10]；叶酸和维生素B12共同添加，经产泌乳牛泌乳早期，产奶量和乳成分产量有提高的趋势；单独补充叶酸，产奶量和乳成分产量无显著变化[16]。另有试验发现，叶酸和蛋氨酸共同添加，与二者单独添加相比，奶牛乳糖含量降低[10]。有研究发现，对奶牛产奶性能而言，叶酸和甜菜碱之间互作效应不显著；但是，单独添加甜菜碱，血液中叶酸浓度降低；与单独添加包被叶酸相比，叶酸和甜菜碱共同添加，奶牛血液叶酸浓度提高的幅度更大，试验结果表明，添加甜菜碱可能提高了日粮中叶酸的利用率[17]。目前，不同生理阶段奶牛叶酸的代谢特点和需要量，日粮中维生素B12、蛋氨酸和甜菜碱等含量对叶酸代谢影响的研究还未见报道。

现有的研究表明，补充叶酸后，牛生产性能提高，与叶酸对养分利用效率、蛋白质合成和脂质代谢的调控有关[11，17]。

2 叶酸对养分利用效率的调控

补充叶酸能提高日粮养分利用率，与叶酸对牛瘤胃发酵和养分消化率的促进有关。叶酸是反刍动物瘤胃微生物的必需营养因子，日粮中的叶酸被还原成二氢叶酸和四氢叶酸，四氢叶酸接受一碳基团，以5,10-亚甲基四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的形式参与一碳单位代谢，对微生物DNA 合成和细胞增殖起重要作用[1]。早期体外试验发现，黄色瘤胃球菌的生长需要二氢叶酸、四氢叶酸或5-甲基四氢叶酸，而且这些物质不能被叶酸替代[18]。近期研究发现，60日龄断奶犊牛日粮中添加叶酸，瘤胃总挥发性脂肪酸浓度、纤维类分解酶的活性以及白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌的数量增加[8]。奶牛或公牛日粮中添加在瘤胃中释放率为23%的包被叶酸添加剂，瘤胃总挥发性脂肪酸浓度、乙酸/丙酸、纤维类分解酶的活性以及总细菌、真菌、原虫和主要纤维分解菌的数量增加[6，17，19]；干物质、中性洗涤纤维和蛋白质瘤胃降解率提高[19]。白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌和溶纤维丁酸弧菌是反刍动物瘤胃中主要的纤维降解菌[2-3]。瘤胃原虫、真菌和纤维降解菌分泌纤维类分解酶，将饲料纤维物质降解为乙酸[2-3]。试验结果表明，瘤胃微生物合成的叶酸不能满足自身的需求，需要通过日粮补充；外源补充叶酸能刺激瘤胃纤维类降解菌的生长，进而促进饲料养分在瘤胃的降解。但是，关于瘤胃微生物叶酸营养代谢特点的研究还未见报道。

奶牛或公牛日粮中添加包被叶酸的试验发现，养分全消化道表观消化率提高[6，17，19]，与养分瘤胃降解率提高的试验结果一致[19]。基于试验用的包被叶酸添加剂中约67%的叶酸能到达小肠被吸收，因此，养分在肠道的消化可能因叶酸的添加而提高。叶酸参与DNA的生物合成，对细胞的生长和增殖起重要作用[1]。早期的研究发现，叶酸是维持小肠黏膜结构和功能完整、胰腺细胞生长和胰液分泌的必需营养因子[20-21]；日粮叶酸缺乏，鼠胰腺淀粉酶的分泌减少[22]。体外试验发现，添加叶酸，瘤胃和瘤胃后消化道干物质的消化率提高[23]。但是，要明确叶酸对反刍动物肠道发育、胰腺功能、消化酶活性及养分消化率的影响，还需要进一步研究。

3 叶酸对牛蛋白质合成代谢的调控

叶酸参与DNA、RNA 和蛋氨酸合成的营养生理功能[1]，以及日粮中添加叶酸后，生长牛日增重[6，8]、泌乳牛乳和乳蛋白产量提高[4-5]的试验结果表明，叶酸参与蛋白质合成代谢的调控。现有的研究结果表明，通过影响生长轴激素的分泌、蛋氨酸循环或作为营养因子，叶酸实现对蛋白质合成代谢的调控，促进细胞与组织蛋白质合成，改善动物生产性能。

叶酸通过胰岛素样生长因子-1（IGF-1）/磷脂酰肌醇激酶（PI3K）/雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路实现对蛋白质合成代谢的调控。细胞培养研究报道，补充叶酸，促进了C1C12 细胞的分化，提高了蛋白激酶B1（Akt1）、mTOR 和核糖体S6 激酶（P70S6K）磷酸化水平[24]。犊牛或公牛日粮中补充叶酸，犊牛或公牛血液中叶酸、生长激素、胰岛素和IGF-1浓度增加，肝脏组织IGF-1、胰岛素样生长因子-1受体（IGF-1R）、PI3K、Akt1、mTOR和P70S6K mRNA的表达量增加[25-27]。IGF-1/PI3K/Akt1/mTOR 是调控细胞生长和蛋白质合成代谢的关键信号通路，IGF-1和IGF-1R结合，刺激PI3K、Akt1、mTOR 和P70S6K mRNA 的表达和磷酸化，促进细胞蛋白质合成和动物生长[28]。试验结果产生的原因，可能与补充叶酸改善了牛瘤胃发酵和养分利用率有关。瘤胃总挥发性脂肪酸浓度和日粮养分利用率提高可促进IGF-1分泌[29-30]。

补充叶酸，一碳单位转移效率可能提高，使更多的蛋氨酸用于蛋白质合成[10]。在一碳单位代谢中，亚甲基四氢叶酸还原酶将5,10-亚甲基四氢叶酸还原为5-甲基四氢叶酸，蛋氨酸合成酶催化同型半胱氨酸接受5-甲基四氢叶酸的甲基重新转化为蛋氨酸，蛋氨酸合成酶还原酶是蛋氨酸合成酶维持活性所必需的辅助因子[1]。研究发现，犊牛日粮中添加叶酸，肝脏5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶、蛋氨酸合成酶还原酶和蛋氨酸合成酶mRNA 的表达量上调[25]。其他研究发现，奶牛产犊前3周补充叶酸，泌乳早期产奶量、乳蛋白产量和血液中丙氨酸、苏氨酸、甘氨酸、丝氨酸和总含硫氨基酸的浓度显著提高[14]；肝脏组织中5,10-亚甲基四氢叶酸还原酶mRNA 的表达量和磷脂酰胆碱/磷脂酰乙醇胺提高[12]。围产期奶牛补充叶酸、维生素B12和包被蛋氨酸的3因子试验发现，叶酸和维生素B12共同补充，促进了蛋白质周转，减少了蛋氨酸氧化，进而提高了日粮蛋氨酸用于合成蛋白质的效率[16]。另有报道，单独添加包被叶酸或甜菜碱与包被叶酸和甜菜碱共同添加相比，公牛日增重的提高的幅度无显著差异[31]。肝脏组织中磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的比例可作为衡量甲基转移效率的指标；甜菜碱又称为三甲基甘氨酸，是一碳单位代谢中重要的甲基供体[1，12]。上述试验结果表明，补充叶酸促进牛蛋白质合成，可能与甲基利用效率或一碳单位循环效率的提高有关。

另外，比较功能基因组研究发现，叶酸受体α调控牛乳蛋白的合成[32]。但是，现有的研究结果还不能明确叶酸对牛一碳单位代谢和蛋白质合成代谢的具体调控方式与机制。

4 叶酸对脂质代谢调控的研究

叶酸通过肝脏激酶B1（LKB1）/腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）/过氧化物酶体增殖物激活受体α（PPARα）/固醇调节元件结合蛋白1（SREBP1）信号通路实现对脂质代谢的调控。研究发现，犊牛日粮中添加叶酸，肝脏组织LKB1和AMPK mRNA 表达上调[25]；公牛日粮中添加包被叶酸，肝脏总脂肪和三酰甘油含量降低，PPARα和肉毒碱棕榈酰转移酶-1（CPT1）mRNA表达上调，SREBP1、脂肪酸合成酶（FAS）和乙酰辅酶A羧化酶α（ACACA）mRNA表达下调，且能有效缓解日粮添加棕榈脂肪粉引起的肝脏脂肪积累[33]。对模型动物鼠的研究发现，补充叶酸，饲喂高脂日粮鼠的肝脏或HepG2 细胞腺苷酸（AMP）含量、LKB1 和AMPK磷酸化水平提高，3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶活性和胆固醇水平降低[34]；母代日粮中添加叶酸，采食高脂日粮子代肝脏中PPARα的表达、腹部脂肪的积累、血液胆固醇和三酰甘油含量降低[35]。AMPK 参与碳水化合物、蛋白质和脂质代谢的调控，可被AMP 和上游基因LKB1激活，促进脂肪酸的氧化和能量释放[34]。AMPK通过激活其下游基因PPARα和SREBP1的转录调控脂肪酸代谢，PPARα负责上调参与脂肪酸氧化的酶CPT1的转录与活性，SREBP1通过控制脂肪生成酶FAS和ACACA的转录而调节脂肪酸的合成[34-35]。3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A 还原酶是负责催化肝脏中胆固醇合成的关键酶[34]。现有的研究表明，通过LKB1/AMPK/PPARα/SREBP1 信号通路，叶酸能抑制肝脏脂肪酸的合成，促进脂肪酸的β-氧化。

5 叶酸与其他养分间互作效应的研究

叶酸参与对蛋白质和脂质代谢的调控，与其他B族维生素和微量元素之间存在互作效应。维生素B12是蛋氨酸合成酶的组分，5-甲基四氢叶酸在蛋氨酸合成酶的催化下，将甲基传递给同型半胱氨酸才能转化为四氢叶酸，接受一碳基团，参与一碳单位代谢过程，维生素B12不足能引起叶酸缺乏，导致5-甲基四氢叶酸积累[1]。反刍动物瘤胃微生物能利用日粮中的钴合成维生素B12[2]。但是，钴和叶酸共同添加，犊牛日增重提高的幅度显著低于二者单独添加[36]。阐明试验结果产生的原因，还需要探究维生素B12、叶酸及二者共同添加对一碳单位代谢的影响及机制。另外，泛酸以辅酶A 和酰基载体蛋白的形式参与mRNA 的合成与碳水化合物、氨基酸和脂肪酸代谢[1]。叶酸以5,10-亚甲基四氢叶酸、10-甲酰基四氢叶酸和5-甲基四氢叶酸的形式参与DNA、RNA 和蛋白质的合成，其中，10-甲酰基四氢叶酸合成嘌呤的过程需要泛酸化修饰才能被激活[37]。研究发现，公牛血液总蛋白浓度，叶酸和泛酸互作效应显著，即血液总蛋白浓度提高的幅度，叶酸和泛酸共同添加显著高于二者单独添加[38]。

叶酸与硒、铜和锌之间存在互作效应，共同参与DNA甲基化和一碳单位代谢的调控。鼠试验发现，硒缺乏时，同型半胱氨酸转化为谷胱甘肽，减轻了叶酸缺乏导致的同型半胱氨酸积累，补充硒，肝脏DNA甲基化水平提高[39]；硒和叶酸共同添加，肝脏中谷胱甘肽还原酶活性降低，蛋白质的过氧化减少[40]。牛试验发现，硒和包被叶酸共同添加，奶牛瘤胃α-淀粉酶活性、总细菌和白色瘤胃球菌数量提高的幅度显著高于二者单独添加[41]；但是，公牛全消化道ADF消化率、瘤胃微生物蛋白质合成量、真菌和主要纤维分解菌数量的提高幅度显著低于二者单独添加[42]。叶酸与铜之间存在互作效应。蛋氨酸合成酶为铜依赖酶，铜参与叶酸和同型半胱氨酸代谢的调控[43]，而且，S-腺苷同型半胱氨酸水解酶为铜结合蛋白，催化S-腺苷同型半胱氨酸产生同型半胱氨酸和腺苷酸[44]。试验发现，包被叶酸和包被铜共同添加，公牛瘤胃微生物蛋白质合成量的提高幅度显著低于二者单独添加[45]。另有报道，叶酸及其衍生物能与Zn、Fe 和Cu 等结合形成不能被吸收的稳定螯合物，补充叶酸，人血液Zn 浓度降低[46]。叶酸与各种微量养分之间互作效应的研究有助于丰富动物营养理论，需进一步探究。

6 小结

综上，日粮中补充叶酸能促进瘤胃纤维类降解菌生长，改善动物生产性能。叶酸对一碳单位循环、蛋白质与脂质等代谢具有重要的调控作用。目前，对于反刍动物叶酸营养调控的研究还存在欠缺，今后可以考虑充分利用活体组织采样和体外细胞培养技术，通过酶联免疫技术、qPCR 和Western Blot 等方法，解析叶酸对反刍动物一碳单位、蛋白质和脂质代谢的影响及调控机制，同时开展叶酸与其他微量养分之间互作效应的研究。