解有机磷细菌对滇重楼根茎、须根及根际土壤重金属元素的影响

李卓蔚，袁 林，叶明燕，兰国新，周 浓

重庆三峡学院 生物与食品工程学院，重庆 404120

滇重楼(Parispolyphyllavar.yunnanensis)为百合科重楼属多年生草本药用植物，根茎作为其主要药用部位，具有解毒止血、抗菌消炎、免疫调节、抗肿瘤等功效[1]。近些年来，为了缓解市场供应需求，滇重楼的人工种植面积被不断扩增，然而，由于种植技术的不成熟及化肥的大量施用，严重破坏了滇重楼的生长环境，导致种植的滇重楼品质不佳，产量也逐渐降低。因此，找到合理的施肥手段来增加滇重楼的可利用价值，是滇重楼规范种植体系的热点领域[2,3]。

近些年来，随着中药产业的迅速发展，因环境污染引发的中药材重金属含量超标等问题也获得了广泛的关注。重金属元素具有高隐蔽、难降解、易富集等特点，容易富集在人体内且不易排出体外，当人体内重金属含量达到一定量时，就会产生脏器功能性病变，从而诱发一系列疾病[4]。当体内汞元素含量超标时，会损伤脑组织，引起神经系统失常；过量镉元素和铬元素会诱发肾脏等器官致癌；过量铅元素会影响人的消化和记忆功能[5]；过量砷元素会对人体的肌肉、血液、免疫系统等多种组织器官产生不利影响[6]。解有机磷细菌作为一种新型的微生物肥料，能矿化有机磷化合物，使土壤中难溶性的有机磷化合物转化为能被植物直接吸收利用的磷元素[7]，增加土壤有效磷含量，从而缓解植物生长缺磷的现象。此外，有大量研究表明，解有机磷菌还能钝化铅、镉、铜等重金属，即将土壤有机磷中释放出的磷酸根与重金属结合形成磷酸盐沉淀，降低重金属在土壤环境中的移动性和生物可利用性，起到固定或钝化的作用，从而减轻重金属造成的危害[8]。解有机磷菌主要包含细菌、真菌和放线菌，其中细菌的种类和数量最多，研究发现芽孢杆菌属、假单胞菌杆属、节杆菌属中的一些菌株的溶磷能力较强[9,10]，在农业上常被作为磷素菌肥使用。据报道，解有机磷细菌对玉米[11]、花生[12]等经济作物的有效成分和生长发育影响具有确切效果并推广应用，不同种类或不同产地滇重楼药材及土壤重金属含量等方面的研究结论已十分成熟[4,13]，Yang等[2]也探究了丛枝菌根真菌对滇重楼根茎及土壤重金属元素的影响，但接种解有机磷细菌对滇重楼药材及土壤重金属含量的影响还未见报道。

因此本研究采取单因素室内盆栽的方式，将筛选出的3株解有机磷细菌优势种为菌种[14]，分别接种和组合接种于栽培基质中，以滇重楼根茎、须根和根际土壤为研究对象，采用电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass，ICP-MS)对汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr)、砷(As)5种重金属元素进行检测，探讨解有机磷细菌及其组合对滇重楼根茎、须根及根际土壤重金属元素含量的影响，以期为滇重楼人工规范化种植与发展提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试种苗为同一批长势良好，且无病虫害的四年生滇重楼实生苗，由云南省大理州永平县杉阳镇普棚村规范化种植基地(25° 39′13.56′′N，99° 33′58.38′′E)提供，将滇重楼实生苗根系附带土壤清理干净后，采用单株低温干燥保存，以保证种质资源的稳定性和均一性，并经保山中医药高等专科学校杨发建副教授鉴定；栽培基质为普通黄壤土、沙土和有机土按2∶1∶1的比例配制而成，过2 mm筛，采用高压蒸汽灭菌锅121 ℃高温灭菌30 min，取出冷却密封放置待用；供试菌株为课题组前期从滇重楼根际土壤中分离筛选出的3株溶磷效果最佳的解有机磷细菌，分别为运动芽孢杆菌(Bacillusmycoides)、维德曼芽孢杆菌(Bacilluswiedmannii)、蛋白水解芽孢杆菌(Bacillusproteolyticus)，活化后，用移液枪取少量菌液接种于装有牛肉膏蛋白胨液培养基的三角瓶中培养，培养菌悬液密度至1×106CFU/mL，每种解有机磷细菌菌悬液培养约4 L。

1.2 仪器和试剂

SPX-80型生化培养箱(上海跃进医疗器械有限公司);金牛4010型微波消解仪(南京瑞尼克科技开发有限公司);EXPEC 7000型电感耦合等离子体质谱仪(杭州聚光科技股份有限公司)。Hg(GSB04-1729-2004，1 000 μg/mL)、Cd(GSB04-1721-2004，1 000 μg/mL)、Pb(GSB04-1742-2004，1 000 μg/mL)、Cr(GSB04-1723-2004，1 000 μg/mL)、As(GSB04-1714-2004，1 000 μg/mL)，购自国家有色金属及电子材料分析测试中心。实验试剂为优级纯，水为纯净水。所有玻璃器皿采用15%硝酸浸泡24 h，蒸馏水冲洗干净后烘干备用。

1.3 试验设计

试验采用室内盆栽的方法，于2020年12月在贵州省安顺市安顺学院(26° 24′95.21′′N，105°90′75.95′′E)的试验种植基地进行种植。试验共分为8组，包括7个试验处理组(S1～S7)和1个对照组(CK)，实验对3株解有机磷细菌优势种采取单株接种、两两组合接种以及三种菌混合接种的方式分组培养，处理方式：处理组S1接种菌株B.mycoides、处理组S2接种菌株B.wiedmannii、处理组S3接种菌株B.proteolyticus、处理组S4接种菌株B.mycoides和B.wiedmannii、处理组S5接种菌株B.mycoides和B.proteolyticus、处理组S6接种菌株B.wiedmannii和B.proteolyticus、处理组S7接种菌株B.mycoides、B.wiedmannii和B.proteolyticus，CK组不接种处理。每组重复10次，每盆种植5株生长状况良好的滇重楼实生苗，菌悬液接种量为150 mL/盆，栽培期间按照滇重楼植株室内栽培标准进行管理。一年后采收滇重楼药材，将根茎和须根于45 ℃烘箱中烘干，粉碎后过80目筛，密封干燥保存；通过抖根法取其根际土壤，室温自然风干，密封干燥保存备用。

1.4 测定指标及方法

1.4.1 滇重楼根茎及须根消解

精密称取0.2 g滇重楼药材样品于消解罐中，平行3次，加入浓HNO38 mL密封，浸泡过夜，采用同法不加样品制备空白溶液。次日采用Li等[4]方法进行微波消解。

1.4.2 滇重楼根际土壤消解

精密称取0.2 g根际土壤样品于消解罐中，平行3次，加入浓HNO37 mL、HF 2 mL和HClO40.6 mL密封，浸泡过夜，采用同法不加样品制备空白溶液。次日采用Lan等[15]方法进行微波消解。

1.4.3 标准工作液的制备

精密称取适量混合对照品储备液，采用2%的稀硝酸逐级稀释，具体配置浓度参照Huang等[16]方法进行。

1.4.4 元素含量测定

参照Li等[4]方法进行。

1.4.5 药材重金属限量标准

药材限量标准参照《中国药典》(2020年版)[17]和《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB2762-2017)规定[18]：Hg≤0.2 mg/kg，Cd≤1.0 mg/kg，Pb≤5.0 mg/kg，Cr≤2.0 mg/kg，As≤2.0 mg/kg。

1.4.6 土壤污染现状评价方法

已测得CK、S4和S5组pH值大于7.5，S1～S3、S6、S7组pH值介于6.5～7.5之间。参考《土壤环境质量农用土壤污染风险管控标准》(GB15618-2018)[19]对5种重金属元素的限量：当6.57.5时，Hg≤3.4 mg/kg，Cd≤0.6 mg/kg，Pb≤170 mg/kg，Cr≤250 mg/kg，As≤25 mg/kg。参照《土壤环境检测技术规范》(HJ/T166-2004)，采用单项污染指数法和内梅罗污染指数评价标准对滇重楼根际土壤污染情况进行评价[20]，土壤内梅罗污染指数评价标准分级见表1。其中：

土壤单项污染指数(Pi)=

土壤污染物实测值(Ci)/土壤污染物质量标准(Si)

内梅罗污染指数(Pn)=

{[(Pi均2)+(Pi最大2)]/2}1/2

表1 土壤内梅罗污染指数评价标准Table 1 Evaluation standard of soil Nemero pollution index

1.5 数据处理

原始数据处理采用Excel 2003软件，方差分析及相关性分析采用SPSS 22.0软件，绘图采用Origian 9.0软件。

2 结果与分析

2.1 解有机磷细菌对滇重楼根茎和须根重金属元素含量的影响

不同解有机磷细菌接种处理后，滇重楼根茎5种重金属元素含量见图1。由图可知，7个处理组中Pb元素的含量均显著低于CK组(P<0.05)，表明接种解有机磷细菌能够降低滇重楼根茎对Pb元素的吸收能力，其中含量最低的为S5组，其含量为0.723 mg/kg，仅是CK组含量的12.86%。此外，S5组的Hg和Cd元素含量为最低值，显著低于CK组，表明S5组的接种处理能有效降低滇重楼根茎对Hg、Cd和Pb 3种重金属元素的吸收力。Cr和As元素含量最低均为S7组，且都显著低于CK组，表明3种菌混合处理能有效降低滇重楼根茎对重金属元素Cr和As的吸收能力。总体上来看，接种解有机磷细菌后对滇重楼根茎中Hg、Cd、Pb和Cr元素含量均有所改善，但对As元素含量的改善效果不明显，其中，接种效果较好为S5、S6和S7组。参考《中国药典》(2020年版)和《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB2762-2017)可知，在已获得的根茎重金属元素含量中，除CK和S2组的Pb、Cr元素含量以及S5组的Cr元素含量略有超标以外，其余组中的重金属元素含量均已达标。

滇重楼须根中5种重金属元素含量如图2所示。由图可知，接种处理后须根中Hg元素的含量较CK组均有所降低，表明接种解有机磷细菌能够降低滇重楼须根对Hg元素的吸收能力，其中含量最低的为S4组，为0.116 mg/kg，仅占CK组含量的12.86%。此外，Cd和Pb元素含量最低的为S4组，且均显著低于CK组，表明S4组的接种处理方式能有效降低滇重楼须根对Hg、Cd和Pb 3种重金属元素的吸收力。S7组的Cr和As元素含量均显著低于CK组，且达到最低，此结果与根茎中Cr和As元素含量所得相同，表明3种菌混合处理能有效降低滇重楼根茎和须根对Cr和As的吸收能力。总的来看，接种解有机磷细菌后对滇重楼须根中Hg、Pb、Cr和As元素含量均有较大改善，而对Cd元素含量的改善效果不明显，其中，S4和S7组的接种效果表现良好。由对药材重金属限量标准规定可知，除As元素外，其余元素都有一些组超，除S2组的Pb元素外，其余超标均不过2倍。

图1 接种解有机磷细菌对滇重楼根茎5种重金属含量的影响Fig.1 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in the rhizomes of Paris polyphylla var.yunnanensis注：图中不同小写字母代表不同处理组间的差异显著(P<0.05)，下同。Note:Different lowercase letters in the figure represent significant differences among different treatment groups (P<0.05),the same below.

2.2 解有机磷细菌对滇重楼根际土壤重金属元素含量的影响及重金属污染评价

滇重楼根际土壤5种重金属元素含量变化见图3，由图可知，与CK组相比，接种解有机磷细菌后，滇重楼根际土壤中的重金属含量变化不明显且无规律性，表明接种处理对滇重楼根际土壤中的重金属元素含量不会造成影响，而各组中重金属含量的微小变化可能是由混土不匀或者实验过程中的人为误差造成。由《土壤环境质量农用土壤污染风险管控标准》(GB15618-2018)对农田土壤重金属限量标准规定可知，所有处理组中的重金属含量均达标。单项污染指数和内梅罗污染指数的评价结果见表2。由表可知，所有重金属元素的单项污染指数均<1，除S1组的内梅罗污染指数介于0.7～1.0之间，土壤处于尚清洁水平，存在被污染的风险以外，其余处理组的内梅罗污染指数均<0.7，为清洁土壤水平。

2.3 滇重楼根茎和须根重金属元素富集系数

植物体中重金属元素的富集系数(BCF)(BCF =元素在植物中的含量/元素在其植物所生长土壤中的含量)能侧面反映植物对其根际土壤中重金属的富集能力[2]，BCF<0.1表示绝对贫化，0.13.0表示绝对富集[21]。滇重楼根茎和须根重金属元素的富集系数见表3。

图2 接种解有机磷细菌对滇重楼须根5种重金属含量的影响Fig.2 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in fibrous roots of Paris polyphylla var.yunnanensis

图3 接种解有机磷细菌对滇重楼根际土壤5种重金属含量的影响Fig.3 Effects of inoculation with organophosphate-degradation bacteria on the contents of five heavy metals in the rhizosphere soil of Paris polyphylla var.yunnanensis

表2 滇重楼根际土壤重金属污染评价Table 2 Evaluation of heavy metal pollution in the rhizosphere soil of Paris polyphylla var.yunnanensis

由表可知，在滇重楼根茎中，S5组的Hg、Cd和Pb元素BCF最低，S7组的Cr和As元素BCF最低，而CK组的Hg、Cd、Pb和Cr元素的BCF均为最高值，表明接种解有机磷细菌后，能一定程度上降低滇重楼根茎对重金属元素的吸附。其中，Cd元素的BCF相对较高，CK、S1、S3、S4和S6组的富集能力>0.5，表明滇重楼根茎对Cd元素的吸附能力较强。此外，除CK和S2组的Pb元素以及S1组的As元素的BCF大于0.5以外，其余根茎中的重金属元素富集能力均偏小，富集能力最小的为Cr元素，表明滇重楼根茎对重金属Cr的吸附能力较弱。在滇重楼须根BCF中，S4组的Hg、Cd和Pb元素BCF最低，S7组的Cr和As元素BCF最低，CK组的Hg和As元素的BCF最高，表明接种解有机磷细菌后，能缓解滇重楼须根对重金属元素的吸附能力。其中，在须根中Cd元素的BCF相对较高，S1组的富集能力大于3.0，S7组的富集能力大于1.5，表明滇重楼根茎对Cd元素的吸附能力较强。此外，除CK和S2组中的Pb元素以外，其余须根中的重金属元素BCF均小于0.5，其中Cr元素的BCF最小，均小于0.1，表明滇重楼须根对Cr的吸附能力较弱，此结果与根茎的富集系数结果相似。

表3 滇重楼根茎和须根富集系数Table 3 Enrichment coefficients of rhizomes and fibrous roots of Paris polyphylla var.yunnanensis

2.4 相关性分析

滇重楼根茎、须根及根际土壤中5种重金属元素相关性分析如表4所示。由表可知，根茎与须根中的Hg元素呈显著正相关(P<0.05)，相关系数为0.771；Pb元素中，须根与根茎呈显著正相关，与土壤呈显著负相关，相关系数分别为0.758和-0.750；根茎及须根中的Hg和Pb元素呈显著正相关，相关系数分别为0.761和0.811；根茎中的Hg和Cd元素之间呈显著正相关，相关系数为0.807；根茎中的Cr元素与须根中的As元素呈显著正相关，相关系数为0.822；根茎中的As元素与土壤中的Cd元素呈显著正相关，相关系数为0.747。

3 讨论与结论

解有机磷细菌可以通过矿化有机磷化合物，将土壤中难溶性的有机磷化合物转化为植物能直接吸收利用的有效磷，促进滇重楼的生长发育，进而获得高产优质的中药材[22,23]，同时解有机磷细菌还能固定和钝化土壤中重金属元素[8]，使其难以被药用植物直接吸收，从而减轻中药材中重金属元素残留。在本研究中，与不接种的CK组相比，接种解有机磷细菌后，总体上能降低滇重楼根茎和须根中的重金属含量，对Pb元素含量的降低程度最为显著，其原因是解有机磷细菌可以钝化土壤中的Pb元素，使重金属Pb由活性高的形态转化为活性低的形态，降低其生物有效性[24,25]，从而减少了滇重楼对Pb元素的吸收利用。对Hg和Cr元素含量也有较大改善，且混合接种处理优于单接种处理，S6和S7组的接种处理方式对滇重楼的影响效果最佳。参考《中国药典》(2020年版)和《食品安全国家标准食品中污染物限量》(GB2762-2017)作为滇重楼药材限量标准，根茎中仅一些处理组中的Pb和Cr略有超出标准，而须根中大部分重金属已超出限量标准，其原因可能是由于须根表面存在大量根毛，不仅能直接吸收土壤中的各种有害物质，还能有效增大与土壤的接触面积，从而增大对土壤元素的吸收能力[26]。在滇重楼根际土壤中，接种解有机磷细菌后，土壤中的重金属含量没有改变。以《土壤环境质量农用土壤污染风险管控标准》(GB15618-2018)为参考，所有处理组土壤均未超出国家限定标准；而以《土壤环境检测技术规范》(HJ/T166-2004)为评价标准，所有处理组中的单项污染指数均<1，除S1组的内梅罗指数大于0.7，土壤属于尚清洁水平，存在污染风险以外，其余处理组的土壤均达到清洁水平。表明本试验所用的栽培基质中的重金属含量完全符合种植标准，且接种解有机磷细菌后并没有对土壤造成较大的重金属污染风险，因此对滇重楼植株接种解有机磷细菌的试验安全有效。

表4 滇重楼根茎、须根及根际土壤中重金属含量相关性分析Table 4 Correlation analysis of heavy metal contents in rhizomes,fibrous roots and rhizosphere soils of Paris polyphylla var. yunnanensis

重金属富集系数是描述重金属在生物体内累积趋势的重要指标，侧面反映了植物对其根际土壤中重金属的富集能力。一般来说，作物对重金属的富集系数越小，则表明其吸收重金属的能力越差，对于土壤重金属的抗逆性则越强[27]。水稻对Cd的富集作用较强，在种植水稻过程中则需要注意土壤及环境中Cd的残留量，避免对Cd的过度富集导致大米中Cd含量超标，从而危害人类健康[28]。本研究中，接种不同解有机磷细菌，滇重楼根茎和须根对Hg、Cd、Pb、Cr、As 5种重金属元素的富集能力各不相同，其中，Cr元素的富集能力属于强烈贫化，而对Cd元素生物累积作用则较大，但均显著低于超富集植物临界含量标准(1 000 mg/kg)，须根的富集系数大于根茎，混合接种处理组的富集能力弱于单接种处理组。因此，不考虑将滇重楼须根作为药用部位，可考虑将效果最佳的两种接种处理方式作为生物菌肥的参考，应用于滇重楼人工种植过程中，从而降低滇重楼药材的重金属污染风险，而在今后对解有机磷细菌和滇重楼大田推广栽培实验中，应优先对Cd元素进行调控。

相关性分析表明，接种解有机磷细菌后，Hg和Pb元素之间的相关性较大，其他元素的相关程度则较小，表明接种解有机磷细菌后，滇重楼对根际土壤中Hg和Pb元素的吸收具有显著的协同作用；此外，根茎与须根的相关性强于根际土壤，表明根茎之间、须根之间以及根茎与须根之间的重金属元素含量相互影响能力较强。因此，在今后的大田栽培中，应同时考虑根茎与须根之间以及Hg和Pb元素之间的协同影响作用。

综上所述，接种不同解有机磷细菌或复合菌，能有效降低滇重楼根茎、须根中Hg、Pb和Cr元素含量，从而降低滇重楼药材重金属含量超标风险，还能有效控制滇重楼根际土壤重金属污染风险。同时，本研究结果也表明，3种菌混合接种以及混合接种菌株B.wiedmannii和B.proteolyticus这两种方式对滇重楼的影响效果最佳，因此，可将这两种解有机磷细菌的接种方式推广应用到滇重楼人工种植过程中，从而为滇重楼人工种植过程中重金属污染修复提供参考。