低温对缺血性脑卒中神经保护的作用机制研究

栾 涛，王帅颖，高永军，王 振，李研寸心，徐 蔚，叶宝琴，张 曙

（1.昆明医科大学第二附属医院神经外科，云南 昆明 650000；2.武汉市新洲区人民医院康复科，湖北 武汉 431400）

脑卒中（cerebral stroke）是严重危害我国居民健康的疾病，具有高发病率、高致残率、高死亡率、高复发率、高经济负担5 大特点[1]。2018 年我国脑血管病的死亡率为149.49/10 万，造成了157 万人死亡，是我国成人致死、致残的首位病因[2]。据2016年全球疾病负担研究估计，我国是全球卒中终生风险最高的国家，从25 岁起，卒中的终生风险高达39.3%[1，3]。而缺血性脑卒中以80.63%的发病率，成为脑卒中主要的救治区域[4]。近年随着人们对缺血性脑卒中的深入研究发现，低温是极其具有研究价值的神经保护方法，可抑制组织因缺血再灌注损伤引起的细胞死亡与凋亡[5]，并且在缺血缺氧性脑病、创伤性颅脑损伤中都具有积极作用[6]。而且在急性大血管闭塞导致的缺血性脑卒中，可减少核心梗死体积与减轻脑水肿[7]。本文就低温对治疗缺血性脑卒中氨基酸、脑血量、新陈代谢、炎症凋亡与信号通路的关系进行综述，以期为缺血性脑卒中的治疗提供新思路。

1 低温与谷氨酸聚集

谷氨酸是神经系统内的兴奋性神经递质，由突触小泡释放与突触后膜受体结合会提高膜对Na+、K+、Cl－的通透性，降低膜电位，细胞膜去极化，产生突触后电位。而大脑出脑缺血严重时，会使能量依赖的摄取泵失效，无法将谷氨酸从突触移到胶质细胞中，胞内兴奋性突触与谷氨酸泛滥。此时高水平的谷氨酸使谷氨酸受体失活，使细胞无法正常能量代谢而受到损伤[8]。另一方面，谷氨酸突触增多导致大量Ca2+进入细胞，激活细胞促死亡信号通路。而低温可以改善离子稳态，阻断或减缓钙内流、谷氨酸积累、甘氨酸的释放这些兴奋过程。

轻度低温会改变神经递质释放[9]。局灶性脑缺血时，神经递质在缺血后10～20 min 增加，60 min 达到高峰，70～90 min 下降，然后恢复到基础水平[10]。在亚低温时，会使这一峰值减缓，推迟20 min 出现波峰[11]。而30 ℃～33 ℃的低温会完全抑制谷氨酸释放，减少谷氨酸增加，减少钙动员和ATP 消耗[12]。缺血后，破坏Ca2+稳态引发的级联反应持续数小时甚至数天。亚低温可抑制Ca2+/钙调蛋白依赖性激酶Ⅱ和蛋白激酶C-α、β、γ 亚型移位。低温会抑制缺血再灌注引起的Fodrin 蛋白分解，以及蛋白酶calain 的抑制[13]。尽管Ca2+能量反应在缺血数天仍在继续，但在这一时间窗中对Ca2+进行干扰却未收到疗效，表明低温的临时治疗窗口只有几个小时。因此，这些Ca2+触发的事件很可能是不可逆的过程，不再适用于治疗性低温。

但低温对氨基酸的作用尚不清晰：某研究发现在谷氨酸汇集时使用低温有效[14]；另一项研究观察到，尽管同样减少了兴奋性毒性神经递质的外流[15]，但30 ℃比33 ℃有更强的神经保护作用[16]。因此，低温对缺血神经递质释放的影响还处于一种模糊状态，需要今后继续探究。

2 低温对新陈代谢、脑血流及兴奋性的影响

低温对神经系统的保护表现在减少大脑血流量、降低组织代谢率[17]，温度每降低1 ℃，大脑耗氧量与葡萄糖代谢则下降5%。但低温可以保存组织高能磷酸化合物，如ATP，维持内环境pH 值。低温还可以防止组织乳酸产量增加、防止组织酸中毒，来保存大脑的新陈代谢储备。对正常的脑组织降温，其脑血流量会减少；但卒中时影响较为复杂。缺血时，由于血管闭塞，血流量明显减少；但血流量恢复时，血流会在充血后逐渐下降，并持续数小时。低温会使充血变得迟钝，延缓脑血流量减少[18]。

低温通过影响ATP 浓度来影响组织代谢。因为ATP 是维持离子梯度所必需的，当ATP 浓度梯度受到干扰时，比如在缺血的情况下，就会发生钙内流，导致细胞外谷氨酸水平升高。低温还可以通过限制α-氨基-3-羟基-5-甲基-异戊唑丙酸（AMPA）受体的钙内流来预防组织兴奋性毒性。AMPA 受体的谷氨酸受体单位——谷氨酸受体（glutamate receptors，GluR）可以限制钙内流，当受体受到抑制时会导致过量的钙内流。事实上，在全脑缺血模型，低温可以减轻缺血诱导的GluR2 下调。

然而，低温并不能完全解释对大脑的保护作用。氧气浓度变化、葡萄糖消耗、脑血流量改变不能解释低温对大脑的非线性保护作用。也就是说，神经保护的程度不是随温度的降低按照比例增加。此外，低温的保护作用不能简单用ATP 丢失或细胞外谷氨酸减少来解释，因为ATP 丢失和谷氨酸积累是发生在缺血的几分钟内，而这些反应发生很久后再降温，低温依然有效。此外，体温过低只会延迟许多急性损伤。关于低温究竟是提供永久性保护还是仅仅延缓了受伤过程，这一争论在今天仍在继续。此外，即使在缺血发作几小时后开始降温也是有保护作用的，这表明低温可能对卒中相关损害的亚急性甚至慢性期的损伤过程有重要影响。

3 低温、氧化应激与细胞凋亡

当缺血的脑组织受到再灌注时，损伤的线粒体会形成活性氧物种（reactive oxygen species，ROS），这是一种缓慢的缺血，尤其是缺血后的再灌注。再灌注还通过其他途径触发ROS 的产生，如神经元中谷氨酸激活黄嘌呤氧化酶途径和炎性细胞中的NADPH 氧化酶系统。研究表明[19]，低温可以通过减少自由基的形成，从而对大脑提供保护。ROS 会导致氧化应激，从而对缺血性脑组织造成多种破坏性后果。ROS 可导致脂质过氧化，直接损伤DNA，触发其他细胞死亡途径。体温过低已被证明可以抑制所有这些过程[20]。

缺血性脑卒中会发生大量细胞凋亡[21]。一般有两条主要的凋亡途径，基于线粒体介导的内源性途径，以及外源性途径或受体介导的途径。内源性途径是由线粒体释放细胞色素c，然后激活凋亡小体导致含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-9（cysteinyl aspartate specific，caspase-9）加工而触发的。激活的caspase-9 然后激活caspase-3，这是一种导致DNA核小体间切割的效应。线粒体细胞色素c 的释放可受凋亡蛋白家族（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）促凋亡或抗凋亡成员的调节。受体介导的途径首先在免疫细胞中被描述为一种限制炎症反应的手段。促凋亡配体与细胞表面受体结合导致caspase-8 的募集和激活，最终导致caspase-3 的激活。外源性凋亡途径包括Fas/FasL 和TNFR/TNF。

低温可抑制细胞凋亡的几个方面[22]，可以增加内源性抗凋亡蛋白Bcl-2[23]的产生，减少DNA 片段化，抑制细胞色素c 的释放和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶[24]的激活。关于受体介导的通路和细胞凋亡在缺血中的研究较少。然而，一些研究表明[25-28]，Fas 是检测神经细胞损害的敏感指标，可间接反映血脑屏障的功能，低温可以抑制Fas 和caspase-8 的激活，能减少重症颅脑损伤患者神经细胞坏死数量。

4 低温对炎症的影响

脑缺血相关的炎症反应会加剧组织损伤[29]。坏死组织和ROS 刺激免疫细胞，导致小胶质细胞活化，内皮细胞粘附分子上调，从而导致外周白细胞浸润。外周白细胞和激活的小胶质细胞可以分泌多种损伤因子，如一氧化氮、炎性细胞因子、趋化因子、超氧化物和其他蛋白酶，从而进一步加剧缺血性损伤。低温可通过降低组织中性粒细胞数量和抑制小胶质细胞激活而具有抗炎作用[30，31]。低温会阻止组织白细胞与血管内皮结合和下调内皮粘附分子、细胞间粘附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）来减少组织白细胞，从而阻止它们渗透到大脑。此外，亚低温还可通过抑制炎症转录因子——核因子（nuclear factor kappa B，NFκB）的激活而减少各种炎症介质[32]，如一氧化氮和细胞因子[33，34]。然而，由于炎症是由坏死组织的存在引发的，因此有另一种理论，低温可能是改变了坏死上游的因素，使炎症反应与组织损伤的程度成正比。但在没有细胞死亡的脑部炎症模型中也观察到了低温的这些抗炎作用，这表明低温对免疫反应有直接影响[35，36]。在人体，IL-6能穿透血脑屏障在下丘脑合成PEG2，从而改变身体的温度设定点，低温可以抑制脑损伤后细胞IL-6免疫因子的分泌[37，38]，降低组织损伤后免疫与炎症反应，以减轻受伤区域的组织损伤与感染。

5 低温与血脑屏障

人体中枢神经系统有一层血脑屏障（bloodbrain barrier，BBB），由内皮细胞、基底膜和血管周围星形胶质细胞组成，这层血脑屏障能够阻止血液中有害物质进入脑组织[39，40]。脑缺血再灌注会导致脑组织继发性损伤，包括水肿和出血，这是血脑屏障破坏的后果。脑卒中时血脑屏障破坏是由神经血管单位的结构和功能受损引起的，包括紧密连接蛋白、运输蛋白、基底膜、内皮细胞、星形胶质细胞、周细胞和神经元[41]。脑缺血、创伤和脑出血的模型表明，亚低温可以保护血脑屏障，防止水肿形成[42，43]。具体的是低温阻止了负责降解细胞外基质的蛋白酶的激活，如基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMPs）[44]。激活的MMPs 可以降解组成血脑屏障的几种紧密连接蛋白，导致水肿形成和脑出血。低温降低了基质金属蛋白酶的蛋白水解活性，进而降低了血管基膜蛋白[45]和细胞外基质蛋白聚集素和层粘连蛋白的降解。除了抑制基质金属蛋白酶，低温还会增加内源性基质金属蛋白酶抑制剂的表达，如金属蛋白酶抑制剂TIMP2[46]。

低温还能够通过维持大脑的水分平衡来减少水肿[47]。水通道蛋白是一个控制细胞膜上水流动的水通道蛋白家族。其4 号压型是中枢神经系统微血管系统的主要水通道蛋白类型，它在星形胶质细胞的足底膜中发现。在脑出血和心脏骤停模型中[48]，亚低温通过抑制水通道蛋白4 的表达来减少了脑水肿的形成，抑制破坏性蛋白酶的活化阻止水道的开放，以此防止脑水肿和脑出血。

通过保护血脑屏障的完整性，低温可以限制脑水肿并增加颅内压。然而，低温并不是总会保护血脑屏障。对蛋白酶诱导脑出血导致血脑屏障降解的模型表明，低温对功能结果的影响是不一致的。在脑缺血模型，几个实验室证明低温的神经保护作用。但在脑出血模型中，有的实验室发现低温可改善神经功能，而另一些实验室报告神经功能结果没有改善，甚至略有恶化[49]。需要注意的是，低温可以通过减少纤维蛋白原的生成和影响凝血酶的生成来抑制凝血。因此在这种情况下，低温反而会增加出血的机会[50]。因此，由于低温能导致出血扩大，使得在出血性脑卒中的疗效较差。

6 PI3K/Akt 信号通路

PI3K/Akt 信号通路在调节细胞周期、细胞凋亡、血管生成、葡萄糖代谢中起着至关重要的作用，是细胞增殖和凋亡中不可缺少的通路，在细胞的发生发展中起着重要作用[51]。PI3K/Akt 信号通路可调节神经和心血管系统细胞生长，是促进缺血再灌注损伤（ischemia reperfusion injury，I/R）中神经元存活的关键，被称为再灌注损伤补救激酶途径之一[52]。

PI3K/Akt 信号通路在调节细胞凋亡、存活、分化、增殖和代谢方面起着重要作用。除了调节神经系统和心血管系统的发育，PI3K/Akt 通路也是促进I/R损伤神经元存活的关键，是挽救缺血再灌注损伤的经典通路。研究表明[53]，PI3K/Akt 通路通过打开mitoKATP 通道而激活，从而减少I/R 损伤，辐射线粒体凋亡途径的关键效应分子，包括Bcl-2、Bax 和GSK-3β，最终减轻I/R 损伤。

6.1 缺血后PI3K/Akt 信号通路 缺血后神经元的是否存活由细胞存活信号通路之间的平衡决定。Akt激酶也称为蛋白激酶，B-PKB 信号通路的激活可提高细胞存活率。在Akt 激活过程中，膜结合受体酪氨酸激酶RTK 被磷酸化，并被生长因子激活，包括胰岛素样生长因子和脑源性生长因子。RTK 激活PI3K，由磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸PIP2 合成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸PIP3。Akt 被招募到膜上，并被Ser473 和Thr308 的磷酸化激活。Thr308 磷酸化需要磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1（PDK1）。PDK1 可能间接磷酸化Ser473 上的Akt。10 号染色体上缺失的磷酸酶和张力蛋白同源物（phosphatase and tensin homolog，PTEN）通过将PIP3 去磷酸化为PIP2来使Akt 失活，激活的Akt 通过磷酸化从而使其大部分底物失活来促进细胞存活，如叉头转录因子FKHR、Bcl-2 相关死亡蛋白Bad 和糖原合成酶3β（Glyco gen synthase kinase-3β，GSK3β）。BAD 和FKHR 是胞质的，通常被Akt 磷酸化。Bad 的去磷酸化导致其移位到线粒体，触发细胞色素释放。然后细胞色素c 激活caspase-3，导致细胞凋亡。去磷酸化的FKHR 转位到细胞核中，作为转录因子，促进Bcl-2 相互作用的细胞死亡介质（Bcl-2 interacting mediator of cell death，Bim）和Fas 配体的过度表达。BIM 导致细胞色素c 的释放，而Fas 配体激活caspase-8和caspase-3 的活性。Akt 也下调GSK3，通过在Ser9磷酸化它的活性，GSK3 去磷酸化导致其激活。

6.2 缺氧后PI3K/Akt 信号通路 缺氧诱导因子-1α hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是通过PI3K/Akt 途径调节的，该通路受血小板衍生生长因子、胰岛素样生长因子和表皮生长因子、转化生长因子、肿瘤坏死因子-α 和白细胞介素-1β 等生长因子的激活。通过RTK 激活PI3K/Akt 通路可增强HIF-1α 的表达，使缺氧诱导因子-1（hypoxia inducible factor-1，HIF-1）亚基中间的ODD532 赖氨酸乙酰化。由于缺氧条件下ARD1mRNA 和蛋白表达水平降低，HIF-1 乙酰化水平降低，导致HIF-1 表达增加。HIF-1α 作为一种磷酸蛋白，可以通过自身的磷酸化过程调节合成和降解。然而，缺氧诱导的HIF-1α 磷酸化增强HIF-1 的转录活性。

PI3K 被多种基因激活后，激活Akt 与细胞膜结合。苏氨酸和丝氨酸的磷酸化有助于Akt 从细胞质到细胞核的转位，并进一步介导酶的生物学效应，包括参与细胞增殖、细胞凋亡抑制、细胞迁移、囊泡运输和细胞癌变等生物学效应。HIF-1 作为PI3K/Akt信号通路的关键下游蛋白，与环境中的氧浓度密切相关。在常氧条件下，维持稳定的HIF-1 蛋白水平是至关重要的；然而，在低氧条件下，HIF-1 蛋白水平会迅速升高。HIF-1α 与促红细胞生成素相关的急性缺氧反应有关，而HIF-2α 与慢性缺氧反应有关。此外，PI3K/Akt 还可以减少糖原的合成，增加糖酵解。通过磷酸化糖原合成酶激酶的N 端丝氨酸来抑制其β 活性，增加细胞周期蛋白D1 的积聚，通过PI3K/Akt 信号通路促进细胞周期和促进细胞增殖。PI3K/Akt 信号通路与多种酶生物学效应和糖代谢密切相关。

PI3K/Akt 通路是细胞周期过程中重要的细胞内信号通路。它与细胞静止、增殖、癌症和长寿有关。PI3K 激活磷酸化并进一步激活Akt，Akt 定位于细胞膜。激活后的Akt 具有多种生物学功能，包括激活CAMP 反应元件结合蛋白、抑制p27、将叉头盒蛋白FOXO 定位于细胞质。PI3K/Akt 通路可被多种生物分子增强，包括表皮生长因子、胰岛素样生长因子、胰岛素和钙调蛋白。相反，这个途径被磷酸酶和紧张素同源物PTEN，糖原合成酶激酶3β 和转录因子HB9 拮抗。

7 总结

对于缺血性脑卒中，低温可能是目前最有效的治疗方法，但需要今后更多的随机对照试验，从内环境代谢、炎症、凋亡、信号通路等方面来探究低温的启动时机、目标温度、持续时间、复温速度与并发症的预防。自2015 年起，已有11 个临床中心开展低温对重型颅脑损伤的的前瞻性随机研究，希望在不久的将来，能够更清楚揭示低温对神经系统的保护作用。