以表型组为重心的垂体瘤多组学研究

郑培贤 李 娜，2 詹显全，2

1.山东第一医科大学医学科技创新中心，山东济南 250117；2.山东第一医科大学附属肿瘤医院放疗科，山东济南 250117

1 前 言

1.1 垂体瘤多组学的病理生理基础

垂体瘤是一种常见的颅内肿瘤（占10% ～25%），发生于蝶鞍下侧垂体窝内的腺垂体上，在人群中患病率约为17%［1］。最近，世界卫生组织（World Heath Organization，WHO）已经修正了垂体瘤的分类方法。最新的指南不再使用“产生激素的垂体腺瘤”这一概念，而采用腺垂体细胞系起源的垂体瘤命名方式，并根据激素含量和特定的组织学和免疫组化特征，对组织学变异型进行后续的分类。据此，垂体瘤现分为7大类：促生长激素细胞腺瘤、泌乳素细胞腺瘤、促甲状腺激素细胞腺瘤、促肾上腺皮质激素细胞腺瘤、促性腺激素细胞腺瘤、裸细胞腺瘤（null cell adenoma，NCA）和多种激素细胞腺瘤［2］。根据垂体瘤组织中垂体激素的免疫组化检测结果，可以将2017 年WHO 分型与传统分型进行关联。例如，根据免疫组化检测到的垂体激素［3］［生长激素（growth hormone，GH），泌乳素（prolactin，PRL），促甲状腺激素（thyroid-stimulating hormone，TSH），促肾上腺皮质激素（adrenocorticotropic hormone，ACTH）［4］，卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH），黄体生成素（luteinizing hormone，LH）］，将垂体瘤分为不同的形态学变异型。早期的垂体瘤研究大多数仍采用传统的垂体瘤分类方法。本综述中包含的大量基于传统分类方式的研究，已经与2017年WHO的新分类方式关联。采用传统分类的相关研究虽不能完全对应2017年WHO的新分类标准，但其取得的重要成果依然需要重视。需要注意的是，2017年对垂体瘤的新分类和传统的分类既有重叠也有不同，例如：GH沉默的非功能性垂体瘤（non-functional pituitary adenomas，NFPAs）属于促生长激素细胞腺瘤，ACTH 沉默的NFPAs 属于促肾上腺皮质激素细胞腺瘤，分泌GH 的功能性垂体瘤（functional pituitary adenomas，FPAs）不能区分促生长激素细胞腺瘤的亚型，分泌PRL的FPAs不能区分出泌乳素细胞腺瘤的亚型，分泌ACTH的FPAs不能区分出促肾上腺皮质激素细胞腺瘤的亚型。

根据垂体瘤的生物学行为，垂体瘤可以分为3类：良性腺瘤（约65%）、侵袭性腺瘤（约35%）和癌（0.1% ～0.2%）［5］。按血清激素的水平，垂体瘤分为NFPAs 和FPAs（NFPAs：约70%；FPAs：约30%）［6］。NFPAs 患者无明显的症状或异常表现，通常很难早期诊断。FPAs患者能分泌大量激素入血，相对易于早期诊断［7］。5%～10%的NFPAs 具有快速增长、侵袭和早期复发的特征［8］。FPAs释放过量活性激素进入血液，导致人体逐渐出现激素相关症状，并根据分泌激素的不同表现出多种形式的垂体功能亢进［9-11］。例如：（1）泌乳素瘤分泌PRL，引起乳漏、不孕、闭经、性腺功能减退、阳痿；（2）促生长激素腺瘤分泌GH，导致儿童巨人症和成人肢端肥大症［12］；（3）促肾上腺皮质腺瘤分泌ACTH，引起库欣病，导致疲劳、体质量增加、高血压、躯干肥胖和“满月脸”、葡萄糖耐受不良、皮肤拉伸纹和各种感染［13］；（4）促甲状腺腺瘤分泌TSH，引起甲状腺功能亢进；（5）促性腺腺瘤分泌LH 和FSH，偶尔引起性腺功能亢进［14］。有些垂体瘤可分泌多种激素，例如，GH和PRL通常联合分泌，导致骨骼的异常生长和乳汁分泌［15］。

任何类型的垂体瘤，尤其是大腺瘤或侵袭性腺瘤，易压迫垂体邻近的重要结构（神经和血管），如下丘脑、视交叉（上）、颈内动脉、上颌神经、眼神经、动眼神经、蜗神经、外展肌（外侧）、蝶鞍和蝶窦（下）等，造成相应的压迫症状［16］。如垂体瘤向外增生扩大压迫展神经，导致外直肌麻痹［17］；垂体瘤向上扩大压在视交叉上时可能会导致视野缺损（双颞侧偏盲，包括双颞侧下象限盲和双颞侧上象限盲）［18］；垂体瘤向前扩大压迫到视神经时可能会影响视力（视力下降）［19］。

1.2 以蛋白质组学为重心的多组学研究在垂体瘤PPPM实践中的重要性

患者的生存时间和生活质量因个体而异，并与多方面的临床特征显著相关［11］，如年龄、性别、病理分期、临床用药、辅助治疗、遗传背景、生活方式和文化［20］。随着医疗模式从反应性向精准医疗模式转变，预测、预防和个体化医疗（predictive，preventive and personalized medicine，PPPM）这一革命性系统应运而生［10］。多组学，作为一种整合生物组学方法，涉及生命研究的多种组学，包括基因组学、转录组学、多肽组学、蛋白质组学、表观基因组学、代谢组学、影像组学、微生物组学和单细胞多组学［21-26］，以及在PPPM中提出的以表型组学为重心的多组学［27］。目前已有多种用于生物医学数据检索分析的多组学分析软件，包括Omicade4、IMAS、bioCancer、 mixOmics、 MultiDataSet、 OmicTools、PaintOmics、SIGMA、iOmicsPASS、Grimon 和Omics Pipe［28］。

研究垂体瘤这种复杂的肿瘤时，必须将其放在多参数系统模型的框架内，该模型包含了DNA、RNA、蛋白质、多肽、代谢产物和成像特征等多个水平上的分子改变，所有这些改变都需放在一个可变的网络系统内［29-30］。

从垂体瘤的多个“组学”中获得的复杂生物学数据，可提供系统信息和分子网络信息，准确确定垂体瘤相关的新生物标志物、潜在的分子机制和可靠的治疗靶点［30］。结合这些基于组学的生物标志物，可发现垂体瘤的结构、生理和病理之间的密切关系［21］。不同水平上的组学数据中的分子相互调控，形成动态关联系统，为阐明垂体瘤的分子机制和病理过程提供了一种重要的科学研究方法［31］。运用基于多组学的多参数系统策略研究人类垂体瘤，可能产生一种协调一致的“基因型-表型-环境型”的关联，有助于用PPPM思维有效治疗患者。

蛋白质是生命的基本组成成分和生命活动的主要执行者。器官功能的任何改变通常都伴随着蛋白质丰度、修饰、结构、异位表达或稳定性的改变［32］。现代蛋白质组学方法积累了大量的有关垂体瘤的蛋白质组学数据，是人类垂体瘤多组学研究的重要组成部分。以PPPM 为背景，本研究简要阐述了不同分子水平上垂体瘤的特征，阐明以蛋白质组学为重心的多组学和分子网络在人类垂体瘤研究中的现状。这些数据为实现从反应性医疗向前瞻性PPPM的转变提供了有效的依据。

2 垂体瘤多组学研究现状

应用多种新颖、高通量、高特异性和高灵敏度的方法进行分子水平的疾病研究，使治疗方法更加有效、准确、个性化和标准化。例如可以通过第二代和第三代测序技术（HelicosBioSciences，Roche/454，Life/APG，Illumina/Solixa，PacBio RS 和Oxford Nanoporesequencing），基于杂化或基于序列的微阵列、转录组测序、单向凝胶电泳（one-dimensional gel electrophoresis，1DGE）、双向凝胶电 泳（twodimensional gel electrophoresis，2DGE）、双向差异凝胶电泳（two-dimensional difference in-gel electrophoresis，2D-DIGE）、液相色谱串联质谱（liquid chromatographytandem mass spectrometry，LC-MS/MS）、核磁共 振（nuclear magnetic resonance，NMR）谱、色谱耦合质谱 、激光捕获显微切割（laser capture microdissection，LCM）、单细胞序列、CT、PET/CT 和MRI 获得多组学数据［33］。多样化的结构信息阵列和组学数据的整合，显著提高了人们对垂体瘤分子机制的理解，推动了用PPPM治疗垂体瘤的发展［30］。

本研究将从基因组学、转录组学、蛋白质组学、多肽组学、代谢组学和影像组学等方面讨论多组学在垂体瘤中的研究现状。

2.1 基因组学

基因组序列的改变可能引发恶性肿瘤，促进肿瘤的进展和转移。对垂体瘤发病机制和行为表现进行基因组学和分子生物学研究，引发了对如何实现将基础科学发现转化为临床效益的讨论［34］。垂体瘤发生过程中多个细胞过程受到影响，包括表观遗传基因控制异常、细胞周期失调、生长信号失衡等［34］。这些细胞过程涉及各种垂体瘤的遗传和表观遗传谱。例如GADD45γ（一种参与细胞DNA 损伤反应和细胞生长负调控的蛋白）在大多数人类垂体瘤中下调［35］。近80%的垂体瘤中存在Rb/p16/cyclin D1/CDK4 通路的失调，其中p16 几乎总是通过发生甲基化的表观遗传沉默而失活，很少通过突变而失活［36］。垂体瘤的新易感基因存在于不同的特征改变中，这些特征改变包括体细胞突变、染色体改变、线粒体DNA突变、单核苷酸多态性（SNPs）、基因拷贝数、微卫星不稳定性、组蛋白修饰以及DNA甲基化状态［37］。

在体细胞突变方面，GH 分泌型垂体瘤有很大比例的患者存在GNAS基因活化的体细胞突变［38-40］。GNAS基因是转导通路中的关键分子之一，该信号通路连接活化的腺苷酸环化酶与受体-配体相互作用，并参与多种细胞反应。GNAS突变可导致多种疾病，如假性甲状旁腺功能减退、进行性骨发育异常、Albright 遗传性骨营养不良、多骨性纤维性结构不良、McCune-Albright 综合征和垂体瘤［41］。垂体瘤中最常见的GNAS突变形式，是密码子201或227改变的体细胞杂合子功能获得性突变（高达40%），也称为gsp突变。GNAS突变破坏GTP酶活性，导致腺苷酸环化酶持续激活，诱导cAMP合成增加，进而引起垂体瘤细胞的增殖和GH分泌的增加［42］。垂体瘤中存在多个关键的致癌基因，例如，gsp在高达40%的激素活性垂体瘤中表达［43］。垂体瘤发生的过程可能会涉及一些其他致癌基因，如cyclin E、cyclin D1和垂体瘤转化基因（PTTG）［43］。一部分ACTH 分泌型垂体瘤患者USP8基因存在体细胞突变［42］。USP8基因是编码泛素特异性加工蛋白酶家族中的一个成员。在USP8中，EGFR 信号通路的激活，依赖去泛素化的增加，并通过功能获得性突变而减少降解。ACTH 分泌型垂体瘤患者的USP8突变在较小的垂体瘤以及女性患者中更常见，且ACTH 产生越多，预后越好［44］。而巨人症患者经常出现AIP或GPR101突变［45］。

在染色体改变方面，部分泌乳素瘤显示出11号染色体的丢失。PRL 分泌型垂体瘤出现的染色体变化与其侵袭性和恶性表型密切相关。PRL 分泌型垂体瘤的侵袭性和恶性表型的触发可能与11 号染色体短臂内的5 个失调基因（CD44、GTF2H1、DGKZ、HTATIP2和TSG101）的缺失有关［46］。在泌乳素瘤和NFPAs 细胞样本中观察到单独的5 号、8 号和12 号染色体的三体型，在ACTH 分泌型和GH 分泌型垂体瘤中发现了合并缺失的5 号和8 号染色体。这些结果表明，不同的垂体瘤亚型可能会产生不同的肿瘤特异性染色体改变，并产生不同的遗传病变［47］。这些数据表明，垂体瘤的发生原因可能是大规模基因组的破坏［48］。

在线粒体DNA突变方面，嗜酸性细胞垂体瘤通常存在线粒体DNA 突变（高达60%），如MTND2、MTND4、MTND5、MTTM、MTRNR2、MTCYB和MTTL2。这些突变在代谢损伤中起关键作用，通常诱导三羧酸循环代谢产物（α-酮戊二酸和琥珀酸）的失衡，并缺乏HIF-1α稳定性［49］。

在SNP 改变方面，1 型多发性内分泌腺瘤患者内含子3 中存在的SNP（IVS3+18C ＞T）可能诱发垂体瘤的发展［50］。运 用MassARRAY 方法，在对IGFBP3 基因分型的肢端肥大症患者（n=102）和正常对照组（n=143）人群的组织和血清样本进行的差异检测研究中发现，C等位基因rs2854744与垂体大腺瘤有关（比值比=0.557，95%置信区间：0.347～0.893）［51］。Kim等［52］对148名NFPA患者和375名正常对照者进行PHLDB1外显子SNPs基因分型，逻辑回归分析发现PHLDB1SNPs（内含子2 中的Rs67307131）与NFPA 发生风险之间存在显著相关性。据预测，SNP基因分型与垂体瘤易感性相关［52］。对143 例垂体瘤病例和354 例对照的研究，调查了与垂体瘤的发生、表型和临床症状相关的7 个基因（SSTR2、SSTR5、DRD2、MEN1、AIP、GNAS和PRKAR1A）中SNPs的作用［53］，结果表明，MEN1中的rs2959656 与临床活动性垂体瘤的发展有关，而DRD2中的rs7131056有助于垂体瘤更快地生长［53］。

在拷贝数变异（copy number variant，CNV）方面，一部分NFPAs 没有特定的体细胞突变，但有CNV。例如，磷酸肌醇3-激酶（PI3K）催化亚基的拷贝数增加出现在各种类型的垂体瘤中（高达20%～40%），一般认为，CNV 是垂体瘤基因扩增的许可条件［54］。

垂体瘤的表观遗传调控引人关注，垂体瘤中组蛋白修饰和DNA甲基化会导致死亡相关蛋白激酶、致癌基因（PTTG和MAGEA3）、表观基因组修饰基因（DNMT3b）、DNA损伤诱导蛋白（GADD45g）、印迹基因（GNAS、MEG3、NNAT）和肿瘤抑制基因（p16、p21、p27、p14）的表达改变［55］。RIZ1 表现出强烈的肿瘤抑制活性，具有潜在的组蛋白甲基转移酶活性［56］。在对垂体瘤中RIZ1 的水平和甲基化状态的评估中发现，RIZ1 启动子区甲基化在RIZ1 表达的表观遗传沉默中发挥了重要作用，可能对垂体瘤有重要的诊断和治疗价值［56］。侵袭性垂体瘤和垂体癌的MGMT 启动子高甲基化及低蛋白表达与替莫唑胺（TMZ）治疗反应的改善有关［57］。垂体瘤的不同组织样本中，MGMT 甲基化状态存在差异，一部分垂体瘤可能对TMZ 治疗有反应［57］。34 个NFPAs 和正常垂体样本的DNA甲基化分析也显示，在扩大后的NFPAs 组中，启动子高甲基化和SFN、STAT5A、DUSP1、PTPRE 和FGFR2 的表达水平下降［58］有关。此外，与侵袭性相关的特定基因存在异常表观遗传失调，包括侵袭性肿瘤中ITPKB 的上调和CNKSR1的下调［58］。

高通量检测和筛选技术的巨大进步显著优化了垂体瘤的分类系统。此外，对基因组变化与相应的影像特征、病理诊断和临床特征之间极强相关性的识别，可显著改善垂体瘤治疗的临床决策。

2.2 转录组学

使用RNA 测序技术对组织和体液中分离纯化的总RNA 进行全局分析，可以很容易地获得RNA谱［59-60］。大量信使RNA（mRNAs）和非编码RNA（ncRNAs）是调节癌症信号通路的关键成分［61］。转录的分子过程是非常复杂且多层次的，可以影响RNA 的剪接、修饰、在细胞质中的分布、降解和mRNA 转录的稳定性［62］，所有这些变化都与肿瘤发生、发展，细胞分化、增殖、死亡和能量代谢有关［63］。2017年WHO颁布的垂体瘤指南增加了对垂体转录因子和预后组织学因子的评估。这些因子包括能产生表达GH、PRL 和TSH 细胞的Pit1，能产生表达ACTH 细胞的Tpit，能产生表达促性腺激素细胞的SF1，由表达促性腺激素和促甲状腺激素的细胞表达出的GATA2，以及由表达PRL和促性腺激素的细胞表达出的ERα［64］。

在mRNA 方面，基于GEO（Gene Expression Omnibus）数据库，对NFPAs和对照组织的基因表达谱进行分析，发现了3 598 个差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。这些DEGs在多种通路中显著富集［65］。由于NFPAs 没有特定的激素分泌过多的临床症状，对其早期诊断很困难。有效的生物标志物的确定，对深入了解NFPA分子机制，探索有效的诊断和治疗策略极为重要［21］。此外，通过对所有NFPAs 亚型之间的DEGs谱图的研究，可以确定每个亚型中特异性改变的特殊基因［6］。在FSH+NFPAs 亚型中，CXCL13表达上调。在LH+NFPAs 亚型中，MLP、TMPRSS6、GUCY1A3和BASP1特异性上调。在GH、ACTH、FSH、LH、TSH和PRL免疫组化阴性的NFPAs中，14个基因（C7、PDLIM1、HIST1H2AC、GPR49、SYT1、ALS2CR3、HIST1H2BL、HIST2H2AA、HIST1H2BN、PTPN3、GC、HIST1H2BM、HIST1H2BK和AGPAT1）特异性上调［6］。NFPAs不同亚型的分子分类有助于个体化临床实践。FSH 阳性表达型是NFPAs 不同激素表达亚型中的重要亚型，Wang等［66］研究发现FSH受体的表达率与垂体瘤的侵袭能力显著相关。该研究还基于GEO 数据库，在侵袭性NFPAs 和对照组中鉴定出2 751 个DEGs，包括1 274 个上调DEGs和1 477 个下调DEGs，这些DEGs 在各种通路中显著富集。对23 个微阵列库的结果进行研究总结（NFPAs：n=13；对照组织：n=9），发现NFPAs中差异表达的钙代谢和免疫相关基因在作为分子标志物和潜在的治疗靶点方面具有很大前景［31］。

值得注意的是，肿瘤免疫微环境与临床结果和免疫治疗反应性具有相关性。对259 例垂体瘤和20例正常垂体的转录组数据的研究，分析了垂体瘤的瘤内免疫图谱及其与ImmuCellAI 算法的临床相关性，该方法有助于评估24种肿瘤浸润免疫细胞的丰度和免疫检查点分子的表达，并探索出一种用于预测免疫治疗反应的新的免疫分类方式［66］。这些研究清楚地表明，垂体瘤中mRNA相关情况的广泛研究，可以有效地对患者进行分层治疗，同时又促进垂体瘤的PPPM的发展。

大量ncRNA 在各种癌组织中均表现出异常的表达模式。例如，miRNA 和lncRNA 参与了蛋白编码基因和癌症相关通路中关键分子的大规模调控［67］。与靶基因相关的miRNAs功能障碍和重要的生物学过程发生在不同类型的垂体瘤中。研究发现，GH 分泌型垂体瘤和正常垂体间存在52 个差异表达的miRNAs，包括23 个上调的miRNAs 和29 个下调的miRNAs［68］。GH 分泌型垂体瘤中部分差异表达的miRNAs参与了在生物过程中发挥靶向作用的下游基因的过程。例如：miR-126 通过靶向PTTG1 参与肿瘤生长［69］；MiR-26b 直接调控PTEN/AKT信号通路，影响垂体肿瘤的发生和侵袭［70］。有时，多个miRNAs 调控同一靶基因的表达并相互作用，形成共同靶向网络。与正常垂体相比，在ACTH分泌型垂体瘤中部分miRNAs 下调，如miR-145、miR-21、miR-141、let-7a、miR-150、miR-15a、miR-16和miR-143［71］。MiR-15a、miR-16 和miR-132 可以通过直接靶向Sox5抑制垂体肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移［72］。与正常垂体相比，ACTH 分泌型垂体瘤中有47个miRNAs上调，其中miR-26a上调最为显著，并参与靶向PRKCD、cyclin E和cyclin A，抑制ACTH分泌型垂体瘤细胞的增殖［73］。开发miR-26a作为一种新的靶向治疗库欣病的方法，应用前景广阔［74］。PRL 分泌型垂体瘤中，与正常垂体相比，miR-320、miR-603、miR-34b、miR-548c-3p、miR-326、miR-570、miR-432、miR-633、miR-374b、miR-15、miR-26a、miR-196a2、miR-16、Let-7a、miR-410、miR-183、miR-200b、miR-199b-3p 和 miR-125b 等 miRNAs 下调［75-76］。在PRL分泌型垂体瘤和正常垂体之间也发现了上调的miRNAs，包括miR-432、miR-342-3p、miR-23b、miR-493 和miR-664［77］。PRL 分泌型垂体瘤中miRNAs 的功能障碍也会影响其生物学特性。例如，miR-183通过抑制p53-p21介导的细胞周期阻滞直接靶向KIAA0101，从而降低PRL分泌型垂体瘤的侵袭能力和肿瘤细胞的增殖能力［78］。对侵袭性垂体瘤和非侵袭性垂体瘤的全基因组microRNA 转录组分析，鉴定出31个上调的miRNAs和24个下调的miRNAs。这表明miRNA-mRNA网络可能是诊断和治疗垂体瘤的一个很有前景的靶点［79］。此外，Xing 等［80］对lncRNAs 在NFPAs 中的参与也进行了系统的评估，共鉴定出113个差异丰度lncRNAs，并发现下游mRNAs在各种生物过程中显著富集，如呼吸电子传递链、细胞色素C氧化酶活性、多肽激素加工、细胞代谢过程、血小板脱颗粒、胞质分裂调控、环核苷酸磷酸二酯酶活性的正向调控［80］。在NFPAs 中发现的新型差异表达lncRNA 为NFPAs 在病理生理学中的具体功能和机制的研究提供了潜在线索。大量lncRNAs 也在其他研究中得到验证。例如，lncRNA浆细胞瘤变异易位1通过激活c-Myc、cyclin D1和β-Catenin的表达，增强垂体瘤细胞上皮间质转化、增殖和迁移［79］。LncRNA AFAP1-AS1 将细胞周期阻滞在G/S期，抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，抑制PI3K/AKT 信号通路，并通过结合rno-miR-103a-3p 降低垂体瘤细胞GH 和PLR 的分 泌［81］。AFAP1-AS1 和rno-miR-103a-3p 过表达所产生的作用可以通过抑制剂来调节［81］。

为研究骨侵袭性垂体瘤（bone invasive pituitary adenomas，BIPAs）的分子机制和预后，Zhu 等［82］用转录组微阵列芯片分析了5 个BIPAs 和5 个非BIPAs。炎症和免疫因子通过肿瘤坏死因子α（tumor necrosis factorα，TNF-α）在BIPAs 中发挥重要作用。TNF-α 及其相关的lncRNAs（NR_033258和lncRNA SNHG24）和miRNAs（miR-181c-5p 和miR-454-3p）是BIPAs 潜在的治疗靶点［82］。对66 例NFPA 患者的蛋白编码基因和lncRNAs 的表达进行研究分析发现，PCG（CHST12）、lncRNAs（COA6-AS1 和RP11-23N2.4）与肿瘤再生显著相关［83］。该研究表明，联合多转录组标记可能有助于NFPA 患者预后的预测。

2.3 蛋白质组学

蛋白质作为生物系统中遗传物质的最终执行者，其异常会产生与各种疾病最为相关的表型特征［84］。例如，蛋白质丰度差异、翻译后修饰（posttranslational modification，PTM）、特定蛋白质活性的功能障碍、蛋白质间相互作用和蛋白质错误定位可能对癌变过程中细胞的结构特性、关键通路、关键蛋白复合物和代谢产生重要影响［85］。蛋白质组学是对全部蛋白质以及相应的蛋白质通路和网络进行的大规模实验分析。蛋白质组比其他组更复杂，并具有许多独特的特征。基于“单基因-多蛋白质存在形式”模型的概念，人类蛋白质存在形式（蛋白质种类）的数量估计在数十亿［86-87］。蛋白质组学研究的有效性有赖于分离鉴定技术的发展和完善。蛋白质分离方法包括基于凝胶的方法［如one

dimensional gel electrophoresis （1DGE） ，twodimensional gel electrophoresis （2DGE）和 twodimensional difference in-gel electrophoresis （2DDIGE）］以及基于液相色谱（liquid chromatography，LC）的方法［88］。在结合凝胶法鉴定PTMs或蛋白质变体之前需要有抗体和富集策略［89］。蛋白质鉴定需要明确的氨基酸序列数据，MS 和MS/MS 成为了蛋白质鉴定的重要技术，包括“自上而下”和“自下而上”的方法［90］。“自上而下”蛋白质组学用于识别和量化用电喷雾电离（electrospray ionization，ESI）或基质辅助激光解吸/电离（matrix-assisted laser desorption/ionization，MALDI）质谱来识别和定量事先纯化的完整蛋白质。“自上而下”策略可以提供独特的蛋白质存在形式的明确特征——蛋白质氨基酸序列、PTM和修饰位点以及相应的定量信息。“自上而下”的蛋白质组学仍然存在一些局限，包括每次试验只能低通量单蛋白分析，相对较低的信噪比（signal to noise，S/N），以及非常有限的构象信息，无法获得更丰富的生物信息［91］。“自下而上”蛋白质组学是将蛋白质用胰酶或其他蛋白水解酶切成肽段，然后用质谱进行识别和定量，最后还原为蛋白质的序列。这种“自下而上”的策略也可以用于分析蛋白质上PTMs 的分布和位置［92］。最近，“自中而下”的方法是先将蛋白质分离开，然后将蛋白质酶解成肽段，进行质谱分析，这整合了“自上而下”和“自下而上”两种策略的优势，受到了极大的关注［93］。

2010年，Zhan等［10］提出垂体瘤是一种全身性疾病并建立了一个全面完整的模型，利用垂体组织和体液中的蛋白质组变异对NFPAs 进行PPPM 治疗。目前，蛋白质组学在垂体瘤中的研究包括垂体和垂体瘤的蛋白质表达谱、比较蛋白质组学、硝基化蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、泛素化蛋白质组学、定量蛋白质组学（侵袭性和非侵袭性垂体瘤）、GH蛋白质存在形式和PRL蛋白质存在形式的研究。

2.3.1 垂体瘤的蛋白质表达谱

2.3.1.1 垂体对照蛋白质表达谱 以往研究提供了垂体对照表达谱的基础数据。2002 年，用2DGE结 合 MALDI-TOF （time-of-flight） -MS （mass spectrometry）对正常（对照）人类垂体（n=1）的蛋白质组进行分析结果发现了62个显著的蛋白质点，对应38 种不同的蛋白质。这些蛋白质分为垂体结构蛋白、激素、酶和其他蛋白质［94］。2003 年，在1 000个从正常（对照）人类垂体（n=8）中获得的蛋白质点内，鉴定出51个反映人类垂体蛋白质组异质性的差异点（不同性别间有7个，不同年龄间有17个，不同种族间有15 个，年龄和种族均不同有12 个）［11］。2004年，液相色谱结合MALDI-TOF-MS用于分离和鉴定人类垂体匀浆（n=1）中的蛋白质，共鉴定出包括垂体特异性激素在内的15 种蛋白质。垂体特异性激素的每个亚基均被糖基化［95］。2005年，应用基于多种凝胶检测技术的综合方法特异性鉴别人类垂体组织（n=1）中的1 449 种蛋白质，这些蛋白来自不同的功能类别，如36种神经内分泌蛋白、55种蛋白激酶（1种TKL激酶、4种酪氨酸激酶、3种非典型激酶、1种CAMK激酶、6种STE激酶和2种CMGC激酶）、216 种预测脂质修饰的膜蛋白［96］。2011 年，使用数据非依赖无标签LC-MS/MS分析人类垂体蛋白质组（n=15），鉴定出1 007 种独特的蛋白质，主要是细胞结构蛋白、酶、转录因子、转运蛋白、翻译因子和分泌蛋白［97］。2012 年，使用2D-HPLC 结合LTQ-Orbitrap MS 在垂体微腺瘤（n=6）中鉴定出406种蛋白质，其中表达程度最高的10种蛋白质分别是膜联蛋白Ⅴ、GH、ɑ3Ⅵ型胶原异构体5前体、波形蛋白、角蛋白Ⅰ、PRL、ATP合酶、纤维蛋白原β链前原蛋白、碳酸酐酶Ⅰ、热休克蛋白90 kDaⅠ以及H+转运和线粒体F1复合体β亚基前体［98］。2017年，在垂体（n=10）中共鉴定出高可信度的蛋白7 596种，其中有定量和定性信息的蛋白6 623种［99］。这项研究是迄今为止对垂体蛋白质组最大的高可信度综合分析，提供了有功能评注的生物标志物和潜在的分子 机 制。2018 年，借 助LC-MS/MS（tandem mass spectrometry）在类脑垂体中鉴定出25 种主要蛋白质，包括分泌型垂体激素、蛋白原转化酶和其他蛋白原［100］。2020 年，使用LC-MS/MS 分析了与年龄相关疾病有关的人类垂体组织的蛋白质组谱，鉴定出与衰老有关的蛋白质主要为组蛋白、激素、氧化还原酶、激素加工酶和其他蛋白质［101］。

垂体前叶作为内分泌系统的重要组成部分，通过合成和分泌激素，如GH、ACTH、PRL、TSH、LH和FSH［102］，调节生长、应激、泌乳和生殖等一系列生理过程［102］。垂体前叶的临床意义主要与垂体功能亢进引起的激素分泌增加（肢端肥大症、泌乳素瘤、库欣病）和垂体功能减退引起的激素分泌减少（侏儒症、继发性肾上腺功能不全）有关［103］。人类垂体前叶的区域特异性数据可以更准确地阐明任何一种分泌蛋白的改变，有助于对其生理作用的研究。Yelamanchi 等［104］运用高分辨率傅里叶回旋质谱系统地研究人类垂体前叶蛋白质表达谱，鉴定出480种具有分泌潜能的蛋白质和187 种N 端乙酰化蛋白。准确阐明人类垂体前叶的作用，有助于加快精准医学和生物医学研究的发展。

2.3.1.2 垂体瘤蛋白质表达谱 2DGE 技术可以根据蛋白质的等电点（isoelectric point，PI）和相对分子质量（relative mass，Mr）对蛋白质进行“自上而下”的详细的蛋白质组学分析。银染或考马斯亮蓝用于单个2DGE 点上蛋白质的染色，以形成二维蛋白谱［105］。2000 年，采用2DGE 分离垂体蛋白，并用MALDI-TOF-MS 鉴定蛋白，发现了9 种重要的激素和酶，如生长激素4、PRL、血红蛋白β链、血红蛋白α链、泛素硫酯酶L1、谷胱甘肽S-转移酶P、多肽NPP、甘油醛3-磷酸脱氢酶（肝脏）、黄体生成素β 链［106］。2003 年，用2DGE 分离垂体蛋白，并用MALDI-TOFMS 和LC-ESI-Q-IT（quadrupole-ion trap）鉴定蛋白，在135个蛋白质点中，共鉴定出111种蛋白，包括垂体细胞结构蛋白、细胞信号蛋白、运输蛋白、酶、细胞防御蛋白和激素［107］。2015 年，在人类FSH 阳性NFPA 组织中，用2DGE 和MALDI-TOF PMF（peptide mass fingerprint）在141个蛋白点中共鉴定出107个非冗余蛋白。这些鉴定的蛋白丰富了几个重要的通路，包括细胞周期改变、糖异生和糖酵解、MAPK信号系统、氧化应激、免疫应答、线粒体功能障碍、炎症信号通路、TP53 信号通路和VEGF 信号通路［108］。2018年，2DGE-MALDI MS PMF、2DGE-MALDI MS/MS 和2DGE-LC-MS/MS在分析人类NFPA蛋白质组中的运用，为其他人类组织蛋白质组的研究提供了有效的范例［105］。将经2DGE鉴定的垂体蛋白添加到参考数据库中，可以为垂体肿瘤的进一步研究提供更多信息。此外，2DLC-MS/MS显著提高了多肽蛋白鉴定的通量［109］。第一相用LC分离蛋白质组样本的胰酶肽（tryptic peptide）混合物来简化胰酶肽混合物并形成多个馏分，对每个馏分再采用LC 分离并在线进入质谱仪进行MS/MS分析，最后用MS/MS数据鉴定每个蛋白质。这样，使用2DLC-MS/MS 在NFPA 组织中共鉴定出6 076种蛋白质[65]。

2.3.1.3 单细胞和亚细胞区室垂体细胞蛋白表达谱 垂体瘤起源于单克隆细胞簇，可以从任何一种垂体细胞类型增殖而来，包括促生长激素细胞、促性腺激素细胞、泌乳素细胞、促肾上腺皮质激素细胞和促甲状腺激素细胞。甚至混合型垂体瘤（不同激素共同分泌）也可能来自单细胞［10］。单细胞捕获方法可以解决垂体瘤和对照组织的高度异质性问题。LCM 使用激光对组织的微观区域进行显微切割，分离出特定的细胞［110］。LCM不会改变或破坏样品的化学性质或形态，并已经用于从非细胞结构（淀粉样斑块）中选择和分离细胞，进行DNA、RNA和/或蛋白质分析［111］。2009年，Liu等［112］使用联合免疫组化的优化LCM（immuno-LCM）技术，从正常人类垂体（n= 6）和泌乳素瘤（n= 11）中提取样本发现，0.2%Triton X-100 预处理4 min 的immuno-LCM切片的效果比更长时间预处理或更高浓度Triton X-100预处理效果更好。常规方法会导致细胞形态和标记强度受损，而优化后的方法会产生更强烈、更特异的染色效果。运用优化后的immuno-LCM技术获得纯化的PRL细胞或不同的垂体瘤靶细胞，用于进一步的蛋白质组学分析。2010 年，使用immuno-LCM 结合在线2D-nanoLC/MS 对泌乳素瘤细胞进行蛋白质组学分析，鉴定出了2 243种蛋白质，形成了最大的泌乳素瘤蛋白质组［113］，这些蛋白质涉及多种功能特征。蛋白质组学分析可以探讨参与垂体瘤发生和细胞信号转导的PRL细胞特异性分子事件。单细胞组群也可以通过免疫荧光标记，用流式细胞术来评估特殊的蛋白标志物［114］。

为了阐明侵袭性NFPAs 在骨质破坏中的作用机制，从骨质破坏型NFPAs（n=28）和非骨质破坏型NFPAs（n=10）中分离出成纤维细胞［115］，蛋白质组学分析鉴定了骨质破坏型和非骨质破坏型NFPAs 成纤维细胞中的差异细胞骨架组织蛋白，其中骨质破坏型NFPAs 组共获得747 种蛋白，非骨质破坏型NFPAs 组获得895 种蛋白。基于TMT 的定量蛋白质组学的显著差异表明，NFPAs 周围成纤维细胞分泌骨桥蛋白可能会导致NFPAs 患者的骨质破坏［115］。随着基于密度梯度和/或免疫亲和纯化步骤的细胞器蛋白质组学的发展，出现了一种单一的亚细胞区室蛋白质组学方法，用于研究肿瘤细胞的微小结构［116］。最近，一种荧光辅助细胞分选的替代方法用于分离含有荧光报告分子的亚细胞组分，其结果有助于鉴定小分子量蛋白的重要颗粒功能，包括磷脂酰乙醇胺结合蛋白、复合物2 和巨噬细胞迁移抑制因子［117］。

2.3.2 垂体瘤的比较蛋白质组学

比较蛋白质组学结合了不同的蛋白质组分离技术，如2DGE 和多维液相色谱（multipledimensional liquid chromatography，MDLC）［118］。分离出来的蛋白质通过不同的染色试剂可以形成带有2DGE“斑点”的2D 蛋白谱。利用不同种类蛋白质的丰度可以确定腺瘤组与正常组之间的匹配点。切离点内的蛋白质用胰蛋白酶（或其他蛋白酶）消化，并用PMF或MS/MS分析［107］。早在2003年，水平MultiphorⅡ系统和垂直Dodeca 系统在空间和定量重复性方面的差异已经表明，垂直Dodeca凝胶系统更好［88］。此外，另一项对MultiphorⅡ系统和Dodeca 2D 系统的蛋白质装载量与点体积关系的研究也表明，Dodeca系统可以提供一个更完善的测定蛋白质丰度的线性动态范围［119］。

MDLC结合MS/MS最大限度地扩大了蛋白质组的覆盖范围。基于MDLC-MS/MS 的蛋白质组学技术包括稳定同位素标记的MDLC-MS/MS，如相对和绝对定量同位素标记（isobaric tags for relative and absolute quantification，iTRAQ）、细胞培养中氨基酸稳定同位素标记（stable isotope labeling of amino acids in cell culture，SILAC）、18O、同位素编码亲和标记（isotope-coded affinity tags，ICAT）、肽串联质量标记（tandem mass tags，TMT）和同位素肽末端标记（isobaric peptide termini labeling，IPTL），以及非标记MDLC-MS/MS，如所有理论谱的序列窗口获取（sequential window acquisition of all theoretical spectra，

SWATH）、无标记、绝对定量（absolute quantification，AQUA）和选择性或多反应监测（selected reaction monitoring/multiple reaction monitoring， SRM/MRM）［118］。

2.3.2.1 基于2DGE的比较蛋白质组学 2003年，为了探索促分泌素在人类垂体瘤中的潜在作用，Zhan 等［7］采用比较蛋白质组学方法，结合MALDITOF PMF 和LC-ESI-Q-IT MS/MS 方 法，检 测 人 类NFPAs 中的促分泌素，结果发现，促分泌素在NFPAs中下调了2.2 ～6.9倍，且表达水平表现出不同程度的差异。此外，根据转录组学分析，mRNA水平也呈现类似的趋势［7］。

2005 年，Moreno 等［6］采用微阵列分析发现，人类NFPAs 中有115 个上调基因和169 个下调基因，蛋白质组分析发现21 个上调蛋白和29 个下调蛋白。Wnt 和Notch 通路的显著富集揭示了NFPAs 的发病机制。2008 年，Evans 等［120］对人类泌乳素瘤和对照垂体进行了高分辨率和高重复性的蛋白质组分析。切离差异匹配点，用MS测定其中的蛋白质，在泌乳素瘤（n=12）和对照垂体（n=30）中鉴定蛋白质，共发现了41 个点，包含23 种差异蛋白，其中下调蛋白19个，上调蛋白4个。这些差异表达蛋白（differentially expressed proteins，DEPs）主要聚集在不同的组中，包括生长激素异构体、细胞防御和应激抵抗蛋白、神经内分泌相关蛋白、细胞增殖和分化相关蛋白、凋亡相关蛋白和代谢酶相关蛋白。这些比较蛋白质组学数据揭示了垂体瘤的差异蛋白质表达谱和独特的分子特征，有助于其发病机制的研究。

2.3.2.2 基于2DLC 的比较蛋白质组学 基于2DLC 的比较蛋白质组学，即2DLC-定量蛋白质组学，通常包括同位素标记2DLC-MS/MS 和无标记2DLC-MS/MS，可以定量不同条件下的蛋白质丰度，例如癌症与对照组，疾病的不同阶段，以及不同生理条件下的比较。TMT是一种同位素质量标记，它提供了一种基于凝胶或抗体定量的蛋白质鉴定方法［121］。TMT与上述方法相结合，可以更有效地挖掘蛋白质组成分。基于TMT 的2DLC-MS/MS 可以显著提高基于肽的蛋白质鉴定的通量［109］。一个TMT包含4 个区域：可切割连接区、质量报告区、蛋白反应组区和质量标准化区。TMT 试剂可以分析多种类型的样本，如组织、细胞或生物液体，也可以同时分析多种多肽样品（多达16种）。TMT试剂有6种，可以引发不同的化学反应，包括TMTzero、TMTduplex、TMTsixplex、TMT10plex+TMT11-131C、iodoTMT 和aminoxyTMT［122］。2019 年，Wang 等［123］采用基于TMT 的2DLC-MS/MS 分析FSH 阳性NFPAs（n=4）和FSH 阴性NFPAs（n=4）之间的DEPs，共定量了4 666 个蛋白质，并在FSH 阳性和FSH 阴性的NFPAs中鉴定出594个DEPs。

2.3.3 垂体瘤的硝基化蛋白质组学

在各种癌症涉及到的多个生物过程中，氧化应激起着关键作用。目标蛋白中被硝化的酪氨酸和色氨酸残基是潜在的硝化损伤标志物［124-125］。基于MS的蛋白质组学虽可以检测和识别内源性硝基化蛋白和硝基酪氨酸位点，但硝基化蛋白质组学所鉴定的内源性硝基酪氨酸位点丰度极低［以百万分之一（ppm）为单位］。因此，需要对硝基化蛋白进行优先富集，优化具体的获得MS 数据的仪器参数［126］。当前的硝基化蛋白质组学研究常应用分离富集技术［127］。例如，基于1DGE/2DGE 的蛋白质免疫印迹分析、硝基酪氨酸亲和柱（nitrotyrosine affinity column，NTAC）、基于抗体的酶联免疫吸附试验、免疫沉淀、氨基酪氨酸生物素化转化硝基酪氨酸残基、硫丙基琼脂糖珠富集、硝基化位点丹磺酰氯标记和（3R，4S）-1-［4-（氨基甲基）苯基磺酰基）］吡咯烷-3，4-二醇试剂［128］。利用MALDI-MS 和MS/MS 对含有硝基酪氨酸肽段的断裂模式进行研究，可以提供解释内源硝基化蛋白谱的可靠参数［125］。酪氨酸的硝基化可以改变蛋白质的活性，在下丘脑-垂体-靶器官轴系统的生理和病理过程中发挥重要的分子作用。内源性含硝基酪氨酸的蛋白质和硝基酪氨酸位点是垂体瘤中氧化损伤的标志［129］。大多数硝基酪氨酸位点位于蛋白质的特定结构域或基序内［130］。

2004 年，Zhan 等［129］借助2D 和LC-MS 技术，采用抗硝基酪氨酸抗体用于检测正常（对照）人垂体中含硝基酪氨酸的蛋白。在5 个免疫反应阳性的2D 凝胶点中鉴定出4 个硝基酪氨酸蛋白，包括cGMP 依赖的蛋白激酶2、肌动蛋白、突触体相关蛋白和免疫球蛋白Fc段受体，这些硝基酪氨酸蛋白参与细胞结构、神经传递、细胞迁移和细胞免疫过程。2006 年，Zhan 等［130］采用NTAC 检测NFPAs 中经MS/MS分析鉴定的内源性硝基化蛋白和硝基化蛋白-蛋白复合物，共鉴定出9种硝基化蛋白，包括蛋白酶体α 亚基2 型、白细胞免疫球蛋白样受体A 亚家族成员4 前体、cAMP 依赖的蛋白激酶Ⅰ型β 调节亚基、Rho-GTP 酶结合蛋白2、Rho-GTP 酶激活蛋白5、矢车菊苷蛋白β1、鞘氨醇1 磷酸裂解酶1、锌指蛋白432、白介素1家庭成员6；同时确定了3个完整的硝基化蛋白-蛋白复合物，包括硝化的IL1-F6-IL1-RIRAK-2 复合物、硝化的cAMP 依赖的PKA 复合物β亚基和硝化的蛋白酶体-泛素复合物。这些硝基化位点都位于功能域上，有报道称相对应的硝基化蛋白与重要的功能系统密切相关。2007 年，Zhan等［131］结合2004 年及以前的研究，在16 个新的硝基酪氨酸免疫反应阳性点中发现了4个新的硝基化蛋白质，包括斯钙素1前体、线粒体伴侣蛋白HscB、孕酮和脂联素受体家族成员Ⅲ、蛋白酶体α亚基2型。这些新发现的硝基化蛋白分别参与钙磷代谢、铁硫簇组装中的伴侣蛋白、跨膜受体和非溶酶体蛋白水解途径。

2.3.4 垂体瘤的磷酸化蛋白质组学

磷酸化是指在氨基酸残基上增加一个磷酸基团（-PO3）。丝氨酸（Ser，S）磷酸化的概率为90%，苏氨酸（Thr，T）为10%，酪氨酸（Tyr，Y）为0.05%［132］。磷酸化的发生大约在每千分之一（ppt）水平，而硝化的发生在ppm 水平。通过靶向关键的细胞信号通路，动态磷酸化和去磷酸化过程广泛调控多种细胞过程［133］。尽管磷酸化发生的丰度很低，但特定的酪氨酸激酶抑制剂在临床上已用于各种癌症的药物治疗［134］。磷酸化调节蛋白质的多种关键功能，如蛋白质与DNA相互作用、蛋白质与RNA相互作用、蛋白质与蛋白质相互作用、蛋白质胞内定位、酶活性、蛋白质降解和蛋白质运输［135］。对垂体瘤进行的聚焦于蛋白质磷酸化变异的磷酸化蛋白质组学研究取得丰硕成果［136-137］。MS/MS 分析可以确定磷酸肽氨基酸序列和磷酸化位点。

2004 年，Giorgianni 等［138］采用固定金属离子亲和层析柱（immobilized metal-affinity column，IMAC）结合LC-ESI-QIT MS的非凝胶磷酸化蛋白质组学方法对人类垂体中的磷酸化蛋白和磷酸化位点进行检测，鉴定出了新的磷酸化多肽和磷酸化位点，其中磷酸化位点有6 个，包括人类GH（Ser132，Ser 176）、嗜铬粒蛋白A（Ser 322）、分泌粒蛋白Ⅰ（Ser 149，Ser 405）、60S 核糖体蛋白P1（Ser101）和/或P2（Ser102）、DnaJ 同系物C 亚族成员5（Ser10）和甘丙肽（Ser117）。2006 年，Beranova-Giorgianni 等［139］结合IMAC 和isoelectric focusing（IEF）-LC-MS/MS 凝胶磷酸化蛋白质组学方法用于检测人类垂体瘤中的磷酸肽，在50个磷酸化位点中共获得26个蛋白，包括分泌粒蛋白Ⅰ、生长激素、分泌粒蛋白Ⅱ、嗜铬粒蛋白A、甘丙肽P22466、60S 酸性核糖体蛋白P1/P2、端粒酶结合蛋白p23、促肾上腺皮质激素-促脂素、α-1 连环蛋白、cAMP 依赖蛋白激酶Ⅱ型α 调节链、延伸因子1-δ、肝癌源性生长因子、磷酸丙糖异构酶、3-磷酸肌醇依赖蛋白激酶1、60S 酸性核糖体蛋白P0、纤维蛋白原α 链、骨桥蛋白、40S 核糖体蛋白S3、组蛋白H4、hsc70相互作用蛋白、异质性核糖核蛋白C1/C2、隔膜蛋白2、RNA结合蛋白Raly、玻璃体结合蛋白、热休克蛋白90-α、腺苷酸环化酶相关蛋白1［139］。

2009 年，Long 等［136］对9 组NFPA 组学数据进行系统分析，包括定量转录组学、定量蛋白质组学、硝基化和磷酸化数据［136］。该研究使用PTMscan 检测了409个蛋白中的1 006个独特的磷酸化位点，验证了NFPAs中4个重要分子网络和高频中心分子中的磷酸化蛋白。PTMScan 技术将含PTM 多肽的抗体富集与LC-MS/MS相结合，以确定新的蛋白位点（磷酸化、甲基化、泛素化、酰基化或蛋白酶切位点）［140］。2020年，Liu等［137］采用TMT标记的TiO2富集LC-MS/MS方法对人类NFPAs 组织进行大规模磷酸化位点分析。在1 035个磷酸化蛋白中，共鉴定出2 982个磷酸化位点。该研究通过综合分析GEO 数据库中的磷酸化蛋白数据和DEG数据，重点探讨了侵袭性NFPA一个亚组中的磷酸化蛋白。因此，130个重叠分子（磷酸化蛋白；侵袭性DEGs）富集为6个显著的功能类别。垂体瘤中的这些磷酸化蛋白以及磷酸化位点阐明了垂体瘤的分子机制，为进一步的生物学研究、发现有效的治疗靶点、开发有效的与磷酸化相关的生物标志物以准确地对垂体瘤患者进行分层治疗提供了全面的、大规模的数据集。

2.3.5 垂体瘤的泛素化蛋白质组学

泛素化是一种酶促的PTM，泛素化蛋白（Gly 76）的羧基（COO-）与底物蛋白（Lys 残基）的ε-氨基结合。胰蛋白酶裂解后的双甘氨酸“残基”可用于识别泛素偶联位点［141］。泛素化过程涉及3类酶：泛素激活酶（E1s）、泛素结合酶（E2s）和泛素连接酶（E3s）。第一步是由E1 泛素激活酶在ATP 的帮助下激活泛素；第二步是结合泛素，由E2泛素结合酶将其从E1转移到E2；第三步是连接，泛素C末端Gly与靶蛋白之间的E3泛素连接酶生成异肽键［142］。泛素化在多个细胞过程中发挥作用，包括细胞周期和分裂、抗原加工、凋亡、分化和发育、细胞器的生物发生、细胞表面受体的调节、DNA转录和修复、免疫应答和炎症、核糖体的生物发生、神经肌肉退行性变、离子通道和分泌途径、多能性的维持、神经网络的形态发生、应激和细胞外调节剂反应以及病毒感染［143-145］。泛素化系统缺陷或改变与人类各种疾病相关［146］。

Qian 等［147］利用基于抗泛素抗体的无标签定量蛋白质组学方法，获得了第1 个垂体瘤和对照组织之间的泛素化蛋白质组谱，即泛素化蛋白质组，共鉴定了108个蛋白（158个泛素化位点和142个泛素化肽）；利用LC-MS/MS方法确定了氨基酸序列和泛素化位点。这些泛素化蛋白显著富集于核糖体、PI3K-AKT 信号通路、核苷酸切除修复和hippo 信号通路中。随机选取泛素化的14-3-3 ζ/δ 蛋白进行蛋白质免疫印迹验证，结果表明，在NFPAs中，上调的14-3-3ζ/δ 蛋白可能受到泛素化水平降低的调控。在这些泛素化位点中预测得到的泛素化基序包括D-X（4）-K*、K*-X（2）-E、K*A、K-X（3）-K*和K-X（4）-K*。泛素化蛋白质组学在揭示垂体瘤的分子机制、生物标志物和治疗靶点方面具有重要意义。

2.3.6 垂体瘤的糖基化蛋白质组学

糖基化是碳水化合物（即糖基供体，通常是激活的核苷酸糖）通过细胞质和细胞核中的酶促或非酶促过程与有机分子（即糖基受体）连接的反应［148］。糖基化可以产生5 类糖，包括N 连接糖、O 连接糖、磷酸化糖、C连接糖和糖基磷脂酰肌醇化糖［149］。糖基化修饰参与机体多种功能活动，如蛋白质折叠、蛋白质稳定性、细胞间粘附、抗体特异性、蛋白质组多样性和免疫识别［150-151］。糖基化过程涉及大量酶促反应步骤，是最复杂的PTM［152］。糖基化紊乱可以诱发多种疾病，如神经系统改变、传染病、自身免疫疾病、癌症、阿尔茨海默病和糖尿病［153］。所有这些糖基化相关疾病都会以不同的方式影响多个器官，诊断和治疗均有很大难度［154］，目前在样品分离和鉴定方面已经取得许多进展，例如，利用MALDI-MS分析碳水化合物和糖缀合物，包括寡糖、多糖、糖脂、糖蛋白、生物制药和糖苷，有助于发现新的糖基化紊乱［155］。传统MS结合离子淌度可以从分离的片段离子中提取出清晰的聚糖谱，获得分离异构体的更多信息。MS 与多种色谱方法相结合优势显著，可以提供结构鉴定信息，特别是含有酸性基团（磷酸、唾液酸和硫酸）的聚糖的信息［156］。

人类FSH具有两种主要的糖型，包括四糖基化FSH（由α亚基和β亚基组成）和二糖基化FSH（由α亚基组成）。在体外，垂体FSH 特异性二糖基化FSH 的亚型比二糖基化和四糖基化FSH 的亚型更活跃［157］。FSH 糖基化会导致功能上的两个重要改变，包括寡糖结构变化引起的微异质性，以及FSHβ亚基部分糖基化引起的微异质性。FSH 糖基化可降低受体与配体之间的相互作用，阻碍细胞信号转导。MS 具有高分辨率和高灵敏度的特点，可以准确界定FSH的微异质性，识别更多附着在FSH制剂上的聚糖［158］。例如，Bousfield等［159］使用定量负离子模式纳米电喷雾质谱，在垂体组织和尿液中，对多肽N 端聚糖酶释放的寡糖进行了FSH 的糖基化微异质性比较。目前，对垂体瘤糖生物学/糖基化蛋白质组学的研究还很局限。由于糖基化紊乱广泛存在，并在多种生物过程中发挥作用，因此，糖基化研究应当引起重视。

2.3.7 侵袭性与非侵袭性垂体瘤的定量蛋白质组学

病理检查显示，临床上垂体瘤多为良性，但手术病例中也会有部分垂体瘤侵犯周围局部解剖结构，包括骨、颈内动脉、鼻腔、海绵窦、硬脑膜、鼻咽和颅缝［160］。根据Hardy 改良的放射解剖学分类标准，Ⅲ级（大腺瘤扩大并侵犯基底或蝶鞍上部）和Ⅳ级（蝶鞍破坏）属于侵袭性垂体瘤［161］。在实际临床中，很难完全切除具有广泛侵袭性的原发病灶。因此，侵袭性垂体瘤患者术后复发风险高、预后差［162］。目前，磁共振（magnetic resonance，MR）和术后病理报告是诊断侵袭性垂体瘤的依据，但仅依靠图像和形态学变化尚不足以确定垂体瘤有无侵袭性［163］。分子模式变化研究的快速发展，对于侵袭性和非侵袭性垂体瘤患者的分层、预后评估和靶向治疗均具有重要意义。2009 年，Liu 等［164］基于MALDI-TOFMS，利用高分辨率和可重复性的2DGE 和PMF，建立了侵袭性和非侵袭性垂体瘤的差异蛋白谱，在侵袭性和非侵袭性垂体瘤间的99 个匹配差异点中鉴定出30 个DEPs，这些蛋白参与关键的信号转导和细胞周期调控过程。2014年，在侵袭性（n=4）和非侵袭性（n=4）垂体瘤的103个2DGE和PMF鉴别点中 鉴 定 出57 个DEPs［165］。这 些DEPs 富 集 于 与NFPAs 侵袭性密切相关的重要通路和网络中，包括丝裂原活化的蛋白激酶信号异常、线粒体功能障碍、周期蛋白依赖的激酶C信号异常、氧化应激、TR/RXR 激活、酮的生成和分解、蛋白质水解异常和淀粉样蛋白加工［165］。2016 年，Yu 等［166］采用LC-MS/MS在侵袭性（n=5）和非侵袭性（n=4）NFPAs 中共鉴定出433个DEPs，结合侵袭性（n=3）和非侵袭性（n= 4）NFPAs 的DEGs 转录组学数据，在mRNA 和蛋白水平上，发现29 个差异表达分子参与细胞代谢、蛋白质合成和降解、DNA损伤和修复、细胞信号转导、细胞生长和增殖、能量生产、细胞死亡和存活以及细胞形态；此外，利用qRT-PCR 和蛋白质免疫印迹技术，验证了CHGA和CLU在侵袭性和非侵袭性NFPAs 中的mRNA 和蛋白表达［166］。2016 年，整合蛋白质组学和转录组学，Feng 等［167］利用iTRAQ和LC-MS/MS研究了垂体瘤侵袭过程中的差异分子表达模式，在侵袭性和非侵袭性垂体瘤之间共发现了283个DEPs。值得注意的是，该研究验证了侵袭性垂体瘤中的上调蛋白，包括STAT3、p-STAT3、IL-6R、JAK2 和MMP9。2019 年，Wang 等［123］整合蛋白质组学和转录组学，对FSH阳性表达的NFPAs与侵袭性分子特征之间的联系进行探究，得到了侵袭性相关的NFPAs DEG数据［123］。

2.3.8 生长激素和泌乳激素的蛋白质存在形式

传统观念认为，一个二维凝胶点只含有一个或两个蛋白。2DGE结合MS是一项劳动密集型技术，对获得极碱性或极酸性蛋白、低丰度蛋白、极低或极高质量蛋白以及疏水蛋白而言是一个巨大的挑战。随着蛋白质分离技术、高灵敏度MS 方法（2DGE-MS PMF 和2DGE-MS/MS）和稳定同位素标记（iTRAQ、SILAC 和TMT）的迅速发展，基于2DGE的蛋白质组学发生了革命性变化，为复杂的人体组织蛋白质组分析带来了新的思路［27］。2DGE结合这些MS和同位素标记方法可以对蛋白质组中的蛋白质存在形式和极低丰度蛋白进行大规模定量，检测、鉴定和定量出至少50万个蛋白质存在形式。此外，基于2DGE的新概念，可以估算出人类蛋白质组的大小，其蛋白质存在形式的值大约从100 万到10 亿不等［168］。这有助于理解为什么每个凝胶点都含有许多pI 和Mr相似的蛋白质存在形式。每个检测点可以同时代表同一基因或不同基因的产物，由同一基因产生的蛋白质存在形式也可以出现在不同的2DGE 点上［168］。蛋白质存在形式是蛋白质组的基本单位，它使研究人员充分认识到，具有更细微模式的蛋白质异构体或变体会导致不同的病理生理状态。2DGE-LC-MS/MS结合“自上而下”和“自下而上”的分析方法，揭示了关键的蛋白质存在形式在蛋白质组分析中的重要作用。2DGE结合抗体法可以检测垂体瘤中GH 蛋白质存在形式［87，169］和PRL蛋白质存在形式［147］。

2005 年，Zhan 等［87］利用2DGE、IMAC 层析、MS等方法，在人类垂体中共发现24个GH 蛋白质存在形式，并发现不同的PTMs、可变剪接、蛋白酶解加工等过程产生GH 的异质性。24个GH 蛋白质存在形式在4 个GH 剪接异构体中的分布比例显著不同：异构体1（87.5%）、异构体2（8.1%）、异构体3（3.3%）、异构体4（1.1%）。这项研究表明，GH 在人类垂体中具有广泛的异质性，显著丰富了关于该特定蛋白质系统的蛋白质组学数据库。研究表明，循环的非22-kDa GH变体的比例不同可能导致其对青春期前儿童异常生长的影响的不同［170］。因此，根据临床资料对不同GH蛋白质存在形式进行精确的分子分型，可以更准确地阐明GH 相关疾病的发病机制。2009年，Kohler等［171］利用2DGE、“自下而上”测序和LC-MS/MS 鉴定了9、12、20 和22 kDa 的GH亚型片段，此外，还鉴定出一种23 kDa的糖基化GH变体，阐明了人类内源性GH异质性的潜在机制；该团队进一步研究发现，9 和12 kDa GH 片段的特殊功能可能在正常的代谢活动中发挥重要作用。2021 年，研究人员利用磷酸化蛋白质组学、泛素化蛋白质组学、乙酰化蛋白质组学和生物信息学分析了GH 分泌型垂体瘤组织和对照垂体组织中GH 蛋白质存在形式的PTMs［169］。在GH 分泌型垂体瘤中共鉴定出46个点（46个GH蛋白质存在形式），在对照垂体中鉴定出35 个点（35 个GH 蛋白质存在形式）。这些数据表明，11种GH蛋白质存在形式仅存在于GH 分泌型垂体瘤组织中，而不存在于对照组垂体组织中。这些发现首次阐释了GH分泌型垂体瘤组织中人类GH 蛋白质存在形式的改变，以及部分PTMs在GH蛋白质存在形式中的地位［169］。

2018 年，Qian 等［147］利用2DGE 和MS 在人类垂体和垂体瘤中共鉴定出6种人类PRL蛋白质存在形式。在5 个垂体瘤亚型中，包括NF-腺瘤（n= 3），LH+腺瘤（n= 3），FSH+腺瘤（n= 3），PRL+腺瘤（n=3）和FSH+/LH+腺瘤（n= 3）PRL 蛋白质存在形式均有显著差异。这种模式的改变有助于揭示不同类型PRL 受体信号通路中的PRL 机制［147］。PRL 分泌后转运到各种靶组织，激活下游通路，如Ras-Raf-MAPK通路、JaK2激活调节通路和PI3K通路。在这一过程中，PRL 可能通过不同的PRL 蛋白质存在形式与PRL短受体或长受体结合［172］。

GH和PRL蛋白质存在形式研究有助于人类垂体和下丘脑-垂体-靶器官轴相关疾病中精确机制和新出现的生物标志物的研究。这些鉴定的激素蛋白质存在形式涉及不同的生物学功能和信号通路。它们在垂体瘤治疗中具有潜在的临床意义和价值，并有助于靶向不同激素蛋白质存在形式的药物开发以治疗不同症状。

2.4 多肽组学和体液蛋白质组学

多肽组学有助于人体体液、细胞和组织中完整的多肽组谱和PTMs的确定［173-174］。多肽组学的研究有赖于分离鉴定技术。含有盐、碳水化合物、蛋白质和脂类的复杂生物样品会降低多肽的电离效率。由于在多个特性上存在不同，如大小、疏水性、电荷和PTMs（焦谷氨酸形成、氧化、糖基化、C 端酰胺化和乙酰化），多态性高的肽必须优先富集［175］。最常见的肽分离程序包括：（1）用以分子量作为临界值的膜超滤；（2）有机溶剂选择性沉淀；（3）固相萃取柱；（4）磁珠；（5）基于凝胶的分离方法［176］。多肽组学研究中较为成功的识别方法包括LC、ESI、MALDI、表面增强激光解吸/电离、碰撞诱导解离（collision-induced dissociation，CID）、电子转移诱导解离（electron transfer-induced dissociation，ETD）和毛细管电泳（capillary electrophoresis，CE）［177］。人体体液、细胞和组织中的多肽和生物活性多肽在多种生理功能中均发挥重要作用，如激素信使、抗菌介质、免疫性能、细胞因子、信号转导、抗病毒介质、细胞间通讯和蛋白酶抑制剂［178］。多肽组学在选取生物活性肽、疾病生物标志物、神经肽组学和膳食蛋白消化谱等方面均有重要应用［179］。

2009年，Altelaar等［180］采用两种提取方法（尿素提取法，乙酸萃取）和高分辨率纳米LC-MS/MS 技术，从大鼠垂体组织中共鉴定出142 个内源性神经肽。多种多肽提取程序和多种MS 分析（LC-ETD MS/MS和LC-CID MS/MS）结合提高了鉴定出的内源性多肽的数量。血清和脑脊液均可用于研究垂体瘤，其中包含垂体瘤病理发展过程中的生物多肽和蛋白质［181］。2011年，Cruz-Topete等［182］利用2DGE和MS/MS 对肢端肥大症患者血清蛋白质组改变进行研究，获得了一些新的疾病活动性生物标志物。该研究共发现7 种差异表达蛋白，作为评估肢端肥大症患者手术治疗后疾病活动性的潜在新生物标志物，包括β-血红蛋白、甲状腺素运载蛋白（两种亚型）、触珠蛋白α2、补体C4B前体和载脂蛋白A-1（两种亚型）。2012 年，Zhou 等［183］使用PMF、磁珠和MALDI-TOF-MS，发现垂体瘤患者（n=65）和正常对照组（n=90）血清中共计42m/z值具有显著差异。

2.5 代谢组学

代谢组学研究涉及细胞、组织或生物体代谢的小分子底物、化学产物和中间体［184-185］。代谢组组成的改变意味着基因组、转录组或蛋白质组的动态扰动。代谢组是基因型和表型之间的联系点，是特定条件下分子表型和不同病理生理过程的直接化学反映［186］。随着灵敏分析技术的快速发展，代谢组学已广泛应用于毒理学、生物医学和药学研究，以确定和识别复杂生物样品中的成分［187］。MR 和MS 结合多种分离技术是代谢组学研究中应用的主要方法［188］。MR 是代谢组学领域的先驱平台，可以成功检测所有含有氢原子的化合物，但其敏感性不如MS。代谢组学分析中使用的方法还包括LC-MS、CE-MS 和GC（gas chromatography）-MS［189］。为了提高色谱分辨率，代谢组学研究也应用其他连通性技术，包括超高效液相色谱、LC-NMR-MS、MS 输注（direct inject-MS，DI-MS）、高灵敏度和分辨率纳米LC-MS、高分辨率毛细管柱和傅里叶回旋红外光谱［190］。代谢组可以反映特定病理生理过程的当前表型，并可作为疾病进展，特别是无症状疾病的诊断或预后的生物标志物［191］。一般而言，代谢组学包括靶向代谢组学（特定代谢产物）和非靶向代谢组学（所有代谢产物）。非靶向代谢组学获得的结果必须在多个研究机构的大规模人群队列中用靶向和定量代谢分析方法进行验证［192］。将来，代谢组学应用将结合多中心临床试验和各种生物材料，如血液、尿液、呼出的气体、痰液、脑脊液、汗液和唾液等。

2018 年，Feng 等［193］利用GC-MS 和纳米LC-MS/MS 对ACTH-PAs（n=6）和正常垂体（n=7）代谢产物和蛋白表达水平的差异进行分析。结果发现，在192 个代谢产物中，ACTH-PAs 共有37 个差异表达的代谢产物，包括17 个上调代谢产物和20 个下调代谢产物。这37种差异表达的代谢产物包括己酸、蔗糖、D-果糖、腺苷酸、D-肌醇4-M、肌醇、尿酸、丙酮酸、瓜氨酸、D-γ-生育酚、苯甲酸、1，3-丙二醇、己醇、癸酸、卟啉、2-羧基吡咯、壬酸、庚酸、辛酸、L-苏氨酸、羟基乙酸、草酸、焦谷氨酸、尿嘧啶、异亮氨酸、亮氨酸、核糖、1，3-二羟基丙酮、半胱氨酸、蛋氨酸、D-葡萄糖、葡萄糖、甘露糖、D-果糖-6-磷酸、D-葡萄糖-6-磷酸、D-甘露醇、柠檬酸、异柠檬酸、2-氨基己二酸、甘油、内赤藓醇、棉籽糖、4-羟基丁酸和核糖醇。2018 年，Pînzariu 等［194］对代谢组学在垂体瘤研究中的贡献进行总结，发现N-乙酰天冬氨酸、肌酸和胆碱化合物在垂体瘤和健康组织中不同，去氧胆酸、短链脂肪酸、4-吡哆酸、3-甲基乙二酸和葡萄糖-6-磷酸是库欣病潜在的代谢产物型生物标志物。磷酸乙醇胺、肌醇、谷氨酸、N-乙酰天冬氨酸、天冬氨酸和谷氨酰胺在泌乳素瘤和正常对照组之间存在显著差异［194］。2019 年，代谢谱揭示了不同类型垂体瘤［促肾上腺皮质激素细胞腺瘤、促性腺激素细胞腺瘤、促生长激素细胞腺瘤、促乳房生长细胞腺瘤、泌乳素细胞腺瘤、嗜酸粒细胞瘤（oncocytoma，OCMs）、NCAs］和正常垂体之间的代谢改变。基于代谢变化的聚类热图显示，GH-PA、PRL-PA 和GHPRL-PA 属于同一亚类，GT-PA、OCM 和NC-PA 关系密切。相对于正常垂体组织，垂体瘤中三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA）通量、必需氨基酸和糖酵解水平均下调，而短链脂肪酸和核苷酸代谢水平上调。所有8种垂体瘤亚型中葡萄糖、果糖-6-磷酸和葡萄糖-6-磷酸水平均下调，表明垂体瘤中葡萄糖摄取异常。所有垂体瘤亚型的必需氨基酸代谢（尤其是亮氨酸、缬氨酸和蛋氨酸）下调，表明其合成代谢受到抑制［195］。2020年，Hu等［196］使用超高性能LC-Orbitrap Q-Exactive HF MS 在NFPAs 患者（包括8 个NCAs 和8 个OCMs）和正常对照垂体（n=5）中发现了特定的脂质异常。在OCMs和对照组之间共有181 种脂质存在显著性差异，其中110 种脂质上调，71种脂质下调；95种脂质在NCAs和对照组之间有显著差异，其中22种脂质上调，73种脂质下调。OCMs与对照组之间、NCAs与对照组之间有53种差异脂质重叠。此外，这项研究采用了一个可以获得可靠的脂质生物标志物的外部验证集。在实验集和验证集中共有17个脂质亚类显示相同的趋势，包括神经酰胺、心磷脂、磷脂酰甘油、甘油二酯、游离脂肪酸、饱和脂肪酸、烷基取代基（TG-O）、单不饱和脂肪酸、磷脂酰丝氨酸、多不饱和脂肪酸、磷脂酰肌醇、溶血磷脂酰胆碱、磷脂酰胆碱（PC）、PC-e、PC-p、PC-e+PC-p、磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamines，PE）、PE-e和鞘磷脂。

高效代谢组学是一种有效的临床工具，通过识别特异性高、灵敏度高的疾病生物标志物和新的分子致病机制，可以改善垂体瘤研究中的PPPM。因此，代谢组学是垂体瘤患者临床治疗中具有广阔应用前景的新领域。

2.6 影像组学

影像组学依赖于对定量和复杂图像特征（如形状、强度、小波和纹理）的高通量挖掘，其在临床应用中愈趋重要。基于图像的特征和模型均来源于标准医学成像，可以转换为可挖掘的维度数据，以提供用于改善临床决策，准确诊断、预后、预测和治疗的现代医学工具［197-198］。影像组学特征可以反映疾病表型、病理生理学特征和肿瘤微环境，并可用于同相关患者数据（如临床特征、治疗相关过程或基因组信息）结合的模型的建立［199］。影像组学分析包括以下必要步骤：数据选择、医学成像、特征提取、探索性分析模型的开发/验证和实施、临床实用性评估，通过不断重复最终细化［200］。影像组学中，研究人员主要通过控制以下项目来提高临床应用价值：图像方案质量、多重分割、模型研究、多个时间点成像、特征减少或调整的多重测试、多变量分析、生物相关性、临界值分析、鉴别统计、校准统计、前瞻性研究、验证比较“金标准”、成本-效果分析、潜在临床应用、开放科学和数据［201］。影像组学在基于数据科学和机器学习的现代医学成像中发挥着强大作用。基于影像组学的决策支持系统特别注意标准化数据收集和模型验证，进而形成临床应用的标准。

2018 年，Zhang 等［202］应用影像组学的回顾性研究显示，相比于CE-T1加权MRI，T1加权MRI在检测来自其他亚型NFPAs的NCAs时具有更高的特异性和敏感性。这项研究将112 例NFPA 患者按2∶1 的比例分为实验集（n=75）和测试集（n=37），收集T1加权MRI和CE-T1加权MRI的历史数据。利用受试者工作特征（receiver operating characteristics，ROC）分析和T1加权MRI图像特征进行验证，发现实验集曲线下面积（area under the curve，AUC）与测试集一致（0.8314vs. 0.8042）。此外，T1 影像组学特征列线图也得到了同样的结果：实验集的一致性指数（CI）为0.854，与测试集（CI=0.857）一致。利用影像组学建立的MRI信息模型是临床上NFPA亚型术前诊断的强有力的工具［202］。2019年，一种基于MRI影像学特征的方法建立，用于预测侵袭性FPAs（invasive functional pituitary adenomas，IFPAs）的 治 疗 反应［203］。该研究将113例IFPAs患者分为实验组（n=108）和测试组（n=55），从T1 加权MRI 中收集7 个特征，建立具有最佳区分度的术前影像学预测模型，图像特征通过ROC分析进行验证，结果显示实验集的AUC值为0.834，与测试集（AUC=0.808）一致；此外，构建的T1影像组学特征列线图在实验集和测试集中均具有良好的校正和识别能力。基于T1 影像组学特征的影像组学模型对IFPA 患者的预测效果优于用以确定个体治疗策略的临床特征模型。Ugga等［204］研究发现，Ki-67 标记指数与垂体瘤的侵袭性显著相关，T2加权MRI特征中相关性最高的纹理衍生参数可以预测ki-67 在垂体大腺瘤的增殖指数等级，其测试组的总体准确率为91.67%，表明影像组学特征的机器学习分析更加注重成本效益和安全，有助于医疗保健的改善；对基于CE-T1 和T2 加权MRI 特征的垂体瘤侵犯海绵窦图像的实验集（n=97）和测试集（n=97）进行术前预测，T1-T2加权MRI图像特征得到的结果是：实验集的AUC值为0.852，与测试集（AUC=0.826）一致。Niu等［205］构建的T1-T2 加权MRI 影像组学特征的列线图在实验集（AUC=0.899）和测试集（AUC=0.871）中均显示出良好的校准和识别能力。研究发现，影像组学模型也可用于预测患者的治疗反应。借助肢端肥大症患者的多参数MRI特征开发了一种无创预测放疗反应的影像组学模型。影像组学模型结合了其他常见的临床特征，获得了良好的结果，其AUC值高达0.86，优于任何单一的临床特征。影像组学模型的应用有助于患者治疗反应的个体化无创预测［206］。垂体瘤、颅咽管瘤、脑膜瘤和拉克氏囊肿均是位于前颅底的常见病变，这些颅底病灶的术前鉴别有助于基于影像学特征的机器学习模型手术的合理规划。不同组别，包括垂体瘤与颅咽管瘤、垂体瘤与拉克氏囊肿、脑膜瘤与颅咽管瘤，均具有临床应用的潜能（AUC ＞0.80）［207］。具有影像学特征的机器学习模型也可用于基于T2加权MRI的垂体瘤手术一致性预测［208］，基于CE-T1 加权MRI 的NFPA 大腺瘤患者的复发预测［209］，基于T2加权MRI的GH-PAs患者的肉芽形态预测［210］，以及基于T2加权MRI的不同垂体瘤亚型的免疫组化分类［211］。

随着计算机处理能力、学习算法和大数据处理能力的发展，部分影像组学模型的优势超越了临床金标准预测工具，可用于改善患者的护理和治疗效果。患者不仅可以从无创性诊断过程中受益，还可以明确肿瘤特征，如复发和缓解、治疗效果、肿瘤侵袭性、药物不良反应和全切除。然而，必须要注意标准的统计方法和规范的数据挖掘过程［212］。

3 垂体瘤中基于多组学的分子通路

生物学通路和分子网络由生物体内各种分子（如DNA、RNA、蛋白质和代谢产物）之间的一系列相互作用组成［213］，不仅可以触发共同的生物学过程［214］，细胞特性也会相应发生显著变化，例如微管细胞骨架组织、细胞器组织的调节，细胞迁移、细胞形态发生，细胞运动、增殖和凋亡［215］。经通路分析发现，从任何疾病的组学数据集中获得的分子差异表达都极有可能反映出潜在的发病机制以及关键的生物标志物［216］。根据此通路图的先验知识，进一步发现上下游调控因子、小分子活性物质、蛋白质和药物，均有助于疾病的监测，提供早期诊断，以及新药的开发［217］。对“警报分子—特定途径—不同的细胞过程—疾病的相应临床特征”模式的探索，有助于在复杂的病理过程中发现潜在的因果关系。最近，基于以蛋白质组为中心的多组学，垂体瘤分子通路研究更加注重蛋白质组学和转录组学的结合［136］、蛋白质组学和PTMs的结合［136-137］、蛋白质组学和代谢组学的结合［193］以及蛋白质组学、转录组学和代谢组学的结合［195］。

2010 年，Zhan 等［218］根据垂体瘤的比较蛋白质组学数据，确定出9个具有统计学意义的通路，包括ERK/MAPK 信号通路、NRF2介导的氧化应激反应、线粒体功能障碍、丙酮酸代谢、谷胱甘肽代谢、TR/RXR激活、芳基烃类受体信号通路、IGF-1信号通路和氧化磷酸化通路。2016 年，Feng 等［167］通过整合转录组和蛋白质组学数据，发现8个与垂体NCAs侵袭显著相关的典型通路，包括急性期反应信号通路、LXR/RXR激活、整合素信号通路、巨噬细胞和单核细胞Fcγ 受体介导的吞噬作用、PPARα/RXRα 激活、肌动蛋白细胞骨架信号通路、白细胞外渗信号通路、巨噬细胞活性氧和一氧化氮的产生。2018年，Feng 等［193］结合蛋白质组学和代谢组学，鉴定出ACTH-PAs 中富集于多个通路的蛋白质和代谢产物，包括半乳糖代谢、柠檬酸循环、脂肪酸生物合成、戊糖代谢、脂肪酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、丙酸代谢、β-丙氨酸代谢、丙酮酸代谢、磷酸盐通路、糖酵解/糖异生和萜类主链生物合成。2019年，Feng等［195］通过整合蛋白质组学、转录组学和代谢组学，鉴定出不同垂体瘤亚型中涉及的8个生物过程中具有显著性差异的分子，这些过程包括氨酰-tRNA 生物合成、丙酸代谢、磷酸戊糖途径、糖酵解/糖异生，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成，β-丙氨酸代谢，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的降解以及柠檬酸循环（TCA循环）；与其他垂体瘤亚型相比，ACTHPAs 中短链脂肪酸和核苷酸合成代谢途径增加，GH-PAs中葡萄糖代谢和精氨酸/脯氨酸代谢途径增加。2019 年，Long 等［136］在9 套NFPA 组学数据（包括蛋白质组学、转录组学、蛋白质硝基化数据和磷酸化数据）中，结合IPA 通路网络程序进行Meta 分析，确定了62 个分子网络和54 条癌症相关的典型通路。这54 条癌症相关的典型通路汇聚在9 个典型组合通路上，包括：（1）细胞骨架通路、细胞粘附通路和细胞移动通路；（2）线粒体功能障碍通路和能量代谢通路；（3）转移和侵袭通路、血管生成通路；（4）毒素代谢通路和氧化应激通路；（5）蛋白质合成降解通路和氨基酸代谢通路；（6）细胞周期、增殖和凋亡通路；（7）免疫相关通路；（8）内质网应激通路；（9）其他（上皮细胞醛固酮信号、二十二碳六烯酸信号、子宫内膜癌信号、GH 信号、遗传性乳腺癌信号、PPARα/RXRα 激活、PXR/RXR 激活和TR/RXR 激活）通路。2020 年，Liu 等［137］通过整合蛋白质组学、转录组学和磷酸化蛋白质组学与PTMscan，在侵袭性NFPAs中鉴定出相对于对照组的130个重叠分子（磷酸化蛋白；侵袭性DEGs）。这130个重叠分子显著富集于14 条侵袭性NFPAs 相关的信号通路中，包括血小板激活、血管平滑肌收缩、雌激素信号通路、FcγR 介导的吞噬作用、胰高血糖素信号通路、长期抑制通路、癌症中蛋白多糖、胰岛素信号通路、唾液分泌、缝隙连接、cGMP-PKG 信号通路、GnRH 信号通路、炎症介质调节TRP 通道和钙信号通路。这些通路数据有助于人类垂体瘤发病机理的分子机制和生物标志物的深入研究。

4 垂体瘤中基于分子网络的潜在模式生物标志物

分子相互作用网络包含分子间的物理相互作用和基因间的间接遗传相互作用，这些相互作用可能发生在不同家族的生化分子之间（糖、蛋白质、脂类、核酸等）［219-220］。网络特征包含3 个方面：程度分布（连接数）、枢纽（高度连接点）和模块（相同生化过程中的节点）［221］。目前，愈加复杂的分子网络已投入到临床应用中，例如，反映生物过程的功能地图开发，相互作用的结果，预测未知分子的功能，理解生物系统的行为和药物靶标识别［222］。分子网络具有动态的相互作用，且因样本类型、发育阶段、微环境和生理状态等因素而异。从发展的角度来看，分子网络分析具有很大的应用空间［223］。人类疾病的发展涉及多个复杂的生物学过程，临床实践不能继续仅关注诊断和治疗过程中的单一因素或单一分子事件［86］。基于多组学的整合生物标志物模式的提出，把生物标志物定义为主要的两类［21］：第一类生物标志物通常位于信号通路的关键位置或分子网络的枢纽；由于疾病可能发生一定的变化，“修改为”，这类标志物可用来解决疾病的机制和治疗靶点问题［21］。依据基于分子网络的潜在模式生物标志物，多组学数据的应用有助于各种高灵敏度和高特异性模型的鉴定［224］。

2010 年，Zhan 等［218］基于垂体瘤比较蛋白质组学数据确定出3个分子网络，包括：（1）癌症、器官形态、内分泌系统发育；（2）脂质代谢、小分子生物化学过程、分子转运；（3）血液系统发育、血液疾病、组织形态。此外，确定了作为关键节点的部分DEPs，包 括GH1、TGFB1、ERK、Ras、IFNG、P38 MAPK、PRL、胰 岛 素、MYOD1、NFkB、Akt、Jnk、TNF、PPARG、MAPK 和EPO。2016 年，Feng 等［167］整合蛋白质组学和转录组学，在侵袭性和非侵袭性NFPAs中鉴定出1 160 个DEGs 和283 个DEPs。在细胞迁移网络中，表达差异最为显著的分子有COL11A1、BMP6、RHOU、RGS4、AGT、PRDX2、CDK6、BTG2、MITF、SERPINC1、AKAP12、PRL 和CHGA，该研究的差异分子表达模式有助于对侵袭性NFPAs 的进一步探索。2016 年，Yu 等［166］通过整合侵袭性和非侵袭性NFPAs 的蛋白质组学和转录组学数据，在mRNA 和蛋白质水平上确定出29 个经常改变的分子，包括AGL、ATP1B1、CALD1、CAT、CHGA、CKB、CLU、CRABP2、CYB5R1、ECHS1、EPB41L2、EZR、FKBP5、GLS、HK1、IQGAP2、ITGA2B、KRT8、LGALS3BP、LIMA1、LTA4H、NEFL、PFKFB2、POR、PTPRN、RPS6KA5、SH3GLB2、SLC2A1 和SRCIN1。2019 年，Long 等［136］基于对9 个NFPA 数据集的Meta分析，从62 个网络中确定了共861 个中心分子，这些中心分子可以归为16个功能类别的42个中心分子组合中。该研究中，在分子网络中出现超过3 次的中心分子定义为高频中心分子。经PTMs验证的24个高频中心分子包括ERK、creb、ERK1/2、MAPK、Mek、AKT、PI3K 复合体、HSP90、p85、PKC、钙调蛋白、FAK、PLC、Rac、Shc、rock、Jnk、NFκB 复合体、p38 MAPK、组蛋白H3、AP1、肌动蛋白、PKA 和STAT5a/b［136］。2020年，Liu等［137］整合转录组学和磷酸化蛋白质组学，得到了第一个大规模的磷酸化蛋白谱和磷酸化相关分子网络，并在侵袭性NFPAs中确定了相对于对照的130个重叠分子（磷酸化蛋白；侵袭性DEGs）以及10 个中心分子，包括ALB、APOL1、SLC2A4、CHGB、AKT1、SCG3、TSC2、ACACA、SPARCL1 和IGFBP5。这些发现揭示了与NFPAs 磷酸化相关的基本分子机制，同时有助于磷酸化生物标志物和治疗靶点的开发。

5 基于信号通路的垂体瘤治疗靶点和治疗药物

基于垂体瘤多组学的信号通路研究表明，线粒体功能障碍、MAPK信号异常、氧化应激和细胞周期失调是垂体瘤的主要发病机制［218］。目前，已经开发出一些基于这些信号通路的治疗靶点和药物［32，225］。例如，线粒体是一种多功能细胞器，参与细胞周期、细胞增殖、细胞凋亡、能量代谢、氧化应激、耐药、自噬、肿瘤生长和免疫等多种生物学过程［226］。电镜下可以观察到垂体OCM细胞中的异常线粒体［227］。此外，不同垂体瘤亚型的线粒体体积也不相同，例如，泌乳素瘤中线粒体体积大于肢端肥大症中线粒体体积［228］。据报道，一些靶向线粒体的药物已经用于垂体瘤患者的治疗，包括右归丸、替莫唑胺、褪黑素、T-2毒素、褪黑素抑制剂、乙胺嘧啶、18β-甘草次酸、芍药苷棉酚乙酸酯、环孢素A、灰叶酸和多巴胺激动剂［32］等。线粒体功能障碍和线粒体动力学涉及垂体瘤发展中的潜在分子机制，专注于研究基于线粒体的生物标志物和治疗性药物有助于垂体瘤的临床治疗。具有保守的Thr-Xaa-Tyr 模体特征的MAPKs 包括3 个经典亚家族：ERK1/2、JNK（Jun N 端激酶）和p38［229］。这些亚家族分子具有不同的功能，激活的ERK 诱导细胞增殖，而激活的p38 和JNK 诱导细胞凋亡［230］。据报道，MAPKs与多个细胞过程都有广泛联系，如免疫防御、炎症、分化、氧化应激、增殖、能量代谢、凋亡、自噬和应激反应［231］。一些靶向MAPK信号通路的药物已经用于垂体瘤患者的治疗，包括SOM230、OCT、卡麦角林、溴隐亭、维甲酸、18β-甘草次酸、多巴胺-生长抑素嵌合物、乌索酸、氟维司群和BIM-23A760［225］。此外，一些靶向MAPK信号通路的小的生物活性分子正处于开发实验阶段，包括具有EGF 样结构域和两个卵泡抑素样结构域的跨膜蛋白、miR-16、Raf激酶抑制蛋白、哺乳动物不育-20-样激酶、冷诱导RNA 结合蛋白和表皮生长因子途径8号底物［225］。垂体瘤发生和发展的潜在分子机制涉及MAPK 信号通路的改变，关注基于MAPK 的生物标志物和治疗药物有助于垂体瘤的临床治疗。

在垂体瘤中还发现了其他潜在的治疗靶点。例如，R18作为凋亡调节因子14-3-3蛋白抑制物，可以通过阻断垂体OCMs 中mTOR 信号通路与PRAS40 的相互作用来抑制垂体瘤细胞的增殖［232］。DAPT是γ-分泌酶抑制物，通过靶向Notch信号通路抑制细胞增殖和侵袭，并降低原代GH-PA细胞中的GH含量［233］。基于针对垂体瘤在内的多个多组学分析的疾病模型，Feng等［233］对重编程代谢通量进行研究。结果发现，IDH2在垂体瘤重编程代谢中起着至关重要的作用，并证实与GH 分泌和肿瘤细胞生长有关。垂体瘤代谢谱表明，IDH2通过调节异常代谢抑制垂体瘤的生长，可以成为潜在的治疗靶点［195］。在大多数衍生培养物中，使用特异性抑制剂S3I-201抑制STAT3，进而抑制GH 转录，减少GH 分泌［234］。STAT3特异性抑制剂S3I-201通过干扰STAT3和GH之间的正反馈回路，降低垂体生长激素腺瘤的肿瘤生长和GH 分泌。GH 可诱导STAT3 的磷酸化和核转位，而STAT3 又可促进垂体瘤中GH 的高分泌［234］。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）在人类ACTH 分泌型垂体瘤中过表达；噻唑烷二酮类化合物PPAR-γ 激活剂可在垂体瘤中促进AtT20的细胞凋亡，抑制ACTH分泌，诱导G0/G1细胞周期阻滞。基于此，噻唑烷二酮类化合物在库欣病的临床治疗方面具有潜在价值［235］。阿司匹林或生存素小分子抑制剂可抑制细胞增殖并调节细胞周期（S和G2/M 期），从而抑制垂体瘤细胞的生长［236］。LncRNA H19表达下调与垂体瘤的发生发展显著相关［237］。在机制上，lncRNA H19 可以通过mTORC1介导的信号通路阻断4E-BP1的磷酸化，并抑制4EBP1 与Raptor 亚基的结合。对H19-mTOR-4E-BP1轴的关注有助于垂体瘤的临床治疗［237］。垂体瘤非编码RNA 研究表明，miR-133可以通过降低FOXC1表达抑制垂体瘤细胞的迁移和侵袭［238］。BRD4 在NFPAs 和GHPAs 中 上 调［239］。ZBC-260 是BRD4 抑制剂，通过降低Bcl2、c-Myc和其他相关基因的表达抑制垂体瘤细胞的增殖和肿瘤发生［239］。

6 未来展望

整合组学/多组学在阐明垂体瘤的分子机制、建立基于多组学的信号通路网络、基于通路网络的模式生物标志物以及垂体瘤的有效PPPM或精准医疗的治疗靶点等方面均具有重要作用，并做出了巨大贡献。MS在垂体瘤多组学分析中同样具有重要作用。今后在垂体瘤的研究和实践中应重点关注以下几个方面。同时，这些策略也可以应用到其他癌症的研究中。

6.1 垂体瘤研究实践从以基因组为重心到以表型组为重心的转变

需要注意的是，不同组学在垂体瘤的PPPM 或精准医疗临床实践中的贡献并不恒定，多组学的重心正从基因组学转向表型组学，而表型组是连接基因组与临床实践的桥梁［27］。表型组的核心是蛋白质组和代谢组，两者在临床实践中同等重要。

在这种范式转移模型中，必须清楚认识到：（1）基因组学的主要目标是发现突变、缺失、插入和融合基因，同时发现发生在DNA水平上的修饰也很重要［240-244］。（2）在转录组水平，除了编码蛋白质氨基酸序列的mRNA 外，非编码RNA（ncRNA）也很重要［245-249］。这些RNAs 可以促进基因的突变、插入、缺失和融合。更重要的是，选择性剪接发生在转录过程中［1］，并产生“一个基因—多个转录本”模型。此外，RNA水平上的转录后修饰也是非常复杂且重要的。（3）代谢组包含来源于糖、脂类、蛋白质、核酸等各种物质的所有代谢产物，这些代谢产物在代谢网络系统中发挥重要作用，其中许多代谢途径由代谢酶催化。代谢酶符合蛋白质或蛋白质组的基本特征。（4）在蛋白质组水平，蛋白质以转录本为模板在核糖体中合成。核糖体合成的蛋白质必须转位并分配到其目标部位，如胞外、细胞膜、细胞质、线粒体、高尔基体、细胞核等，形成特定的空间构象，并与周围分子相互作用，进一步形成复合物并最终发挥其功能和生物作用。蛋白质在转位和再分配过程中会发生多种翻译后修饰。蛋白质的最终结构和功能形式被称为蛋白质存在形式或蛋白质组分。因此，蛋白质存在形式被定义为：蛋白质氨基酸序列+翻译后修饰+辅因子+结合伴侣+构象+位置+功能［168］。从中可以得出，“蛋白质”是一个“总括性术语”，它包含了由一个基因编码的所有蛋白质存在形式，此外，所有这些蛋白质存在形式都参与一个动态信号通路网络系统。

蛋白质组和代谢组变异比基因组和转录组变异复杂得多［27］。人类蛋白质存在形式的数量高达十亿［27，86］。许多因素均会导致蛋白质组的变化，如PTMs、转位/再分配、蛋白质间相互作用以及空间构象。已经研究过的PTMs包括泛素化、糖基化、磷酸化、甲基化、类泛素化、乙酰化、硫酸化、脱酰胺化、硝化、羟化、琥珀酰化、异戊烯化、豆蔻酰化和棕榈酰化。迄今为止，已经鉴定出数百个PTMs并编入PTM数据库（http：//web.expasy.org/findmod/findmodmasses.html；http：//www.uniprot.org/docs/ptmlist）［27］。大多数PTMs在不同病理和生理条件下以及不同疾病阶段会发生动态改变，进而产生更为复杂的蛋白质组学变异［250］。

代谢组学主要研究生物样本中完整的小分子。代谢产物均由内源性代谢组（如核酸、氨基酸、脂肪酸、有机酸、维生素、胺、糖、抗生素、辅因子、色素）和外源性代谢组（如药物、食品添加剂、环境污染物、毒素和其他外源性物质）产生［251］。代谢组学变异来源于各种生物过程。目前对蛋白质组和代谢组变异的研究并不深入［27］。高通量、高重复性和高灵敏度方法的开发将最大限度地扩大蛋白质组和代谢组变异的覆盖范围，以促进PPPM实践，包括新的分子机制、可靠的生物标志物和对治疗靶点作用的发现［27］。

在未来的研究中，必须重视垂体瘤PPPM 实践中的表型组研究。

6.2 加强对垂体瘤生物大分子修饰和蛋白质存在形式的研究

范式转移模型清楚地表明，在DNA、RNA 和蛋白质水平上会广泛发生多种修饰，系统地调节不同的生理和病理过程。修饰是发生在这些生物大分子中的重要分子事件，对生物大分子甚至整个生物系统的结构和功能都起着重要的调节作用。生物大分子的修饰与不同的病理和生理条件广泛相关，包括癌症、炎症性疾病、神经退行性疾病、代谢性疾病和糖尿病。生物大分子的修饰是引起生物分子多样性的复杂因素。许多修饰均可以调节DNA 的结构和功能，如DNA 中胞嘧啶甲基化和羟甲基化，以及至少20 种发生在DNA 结合蛋白组蛋白中的PTMs［242，252］。RNAs 中至少有150 种PTMs 参与调节RNA 的结构和功能，如3-和5-甲基胞嘧啶（m3C，m5C），N1-和N6-甲基腺苷（m1A，m6A，m6Am），假尿苷（Ψ），5-羟甲基胞嘧啶（hm5C）和2′-O-甲基化（Nm）［243，253］。调控蛋白质结构和功能的蛋白质PTMs共有400 ～600个，如磷酸化、糖基化、泛素化、甲基化、类泛素化、乙酰化、硫酸化、脱酰胺化、硝化、亚硝基化、羟化、琥珀酰化、异戊烯化、豆蔻酰化和棕榈酰化等［27］。不同的生物大分子修饰具有不同的特点，并需要特定的研究方法。基因组学、转录组学、蛋白质组学和生物信息学的发展推动了对生物大分子修饰的大规模研究，包括对PTMs 的定性和定量分析，以及对这些PTMs 的细胞信号机制和功能的阐明。

此外，PTMs 之间的拮抗和协同作用会使其生物学效应复杂化。迄今为止，在生命科学和医学领域，对PTMs 的研究还远远不够。PTM 研究的广度和深度有待进一步提高。

蛋白质存在形式源自许多不同的影响因素，如可变剪接、PTMs 等。深入了解不同病理生理条件下的蛋白质存在形式可以为PPPM实践阐明分子机制，发现新的治疗靶点，并确定可靠的生物标志物［168］。

因此，在不同的病理生理条件下，如垂体瘤中，必须加强蛋白质存在形式的全面识别和定量研究，阐明不同的生物大分子修饰和蛋白质存在形式的功能和分子机制。

6.3 扩大和加强垂体瘤的基于多组学的信号通路网络、基于分子网络的模式生物标志物和治疗靶点的研究

多组学是从系统的角度研究复杂垂体瘤的有效技术手段。来源于多组学数据的信号通路网络有助于垂体瘤的PPPM和PM实践，进而阐明分子机制、发现新的治疗靶点及药物、并识别有效和可靠的模式生物标记物［30］。目前已经发现了多个基于多组学的信号通路网络、基于分子网络的模式生物标志物和治疗靶点。然而，由于以下原因，对垂体瘤的研究还远远不够：（1）对DNA、RNA和蛋白质PTMs的组学研究远远不够，在基因组、转录组和蛋白质组水平上很少有关修饰组学的研究；（2）蛋白质存在形式尚未广泛识别；（3）代谢产物尚未完全确定；（4）生物大分子相互作用网络和信号通路数据库不完整，限制了挖掘信号通路网络的能力。

因此，拓展和加强组学方法的发展，以最大限度地覆盖基因组、转录组、蛋白质组和代谢组非常重要。需要有计算方法对基于多组学的信号通路网络的识别进行优化和最大化，发现垂体瘤的生物标志物和治疗靶点及药物［14，30］。

6.4 强调垂体瘤研究中基于质谱的蛋白质组学和代谢组学的重要性

蛋白质组和代谢组是表型组的核心组成部分，以表型组为重心的多组学是生命科学和医学科学的发展趋势。MS 在鉴定蛋白质的氨基酸序列、丰度、修饰位点、PTM丰度、代谢产物结构和代谢产物丰度等方面都起着重要作用。此外，“自上而下”MS和2DE-MS 可以实现大规模蛋白质存在形式的鉴定。4D（停留时间、m/z值、强度和离子淌度）MS［254］和非数据依赖性数据采集技术如SWATH［255］的发展也显著促进低丰度、极低丰度蛋白质存在形式和代谢产物的探测、鉴定和定量。

7 结 论

以蛋白质组为重心的人类垂体瘤的多组学和分子网络研究系统阐明了其对PPPM的发展贡献，包括DNAs（基因组）、RNAs（转录组）、蛋白质（蛋白质组）、多肽（肽组）、代谢产物（代谢组）和图像特征（影像组）。本文从基因组学的角度综述了体细胞突变、染色体改变、线粒体DNA基因突变、SNPs、基因拷贝数、微卫星不稳定性、组蛋白修饰和DNA甲基化状态；从转录组的角度综述了RNA 剪接、修饰、胞质中的分布、定位、降解和mRNA转录稳定性；在蛋白质组学方面，综述了对照垂体和垂体瘤的蛋白质表达谱、垂体瘤的比较蛋白质组学、硝基化蛋白质组学、磷酸化蛋白质组学、泛素化蛋白质组学、定量蛋白质组学（侵袭性和非侵袭性垂体瘤）、GH蛋白质存在形式、PRL蛋白质存在形式；在多肽组学方面，综述了候选生物活性肽、疾病生物标志物、神经肽组学、膳食蛋白消化谱；在代谢组学方面，综述了不同类型的代谢组的特定代谢异常；在影像组学方面，综述了基于数据科学和机器学习的现代医学成像。基于多组学整合的分子通路、网络和生物标志物为垂体瘤的PPPM提供了循证医学依据。此外，需要进一步强调作为多组学研究重心的表型组（尤其是蛋白质组和代谢组）在未来垂体瘤研究中的重要性。

利益冲突所有作者均声明不存在利益冲突