外泌体携带的microRNAs在乳腺癌中的作用

廖若蕙，沈国双

（青海大学附属医院乳腺疾病诊疗中心，青海 西宁 810000）

乳腺癌（breast cancer）是导致女性癌症相关死亡的首要原因，自1989 年到2017 年全球女性乳腺癌发病率上升了40%。2020 年由美国国际癌症研究机构发布的数据显示，预计乳腺癌发病率约占女性恶性肿瘤的30%，死亡率约占女性恶性肿瘤的15%[1]。外泌体最初被认为是从肿瘤细胞系释放的含有5-核苷酸酶活性的微囊泡[2]，随着研究不断深入，近年来有学者发现外泌体是一种细胞外囊泡（EVs），膜直径为30～100 nm，呈杯状外观[3]，几乎所有的真核细胞都能分泌外泌体，且在癌细胞中的表达量相比于正常体细胞更高[4，5]。外泌体包裹了许多生物大分子，包括非编码基因家族（microRNA，lncRNA）、蛋白质和脂质等[6]。miRNA 是在转录后水平通过结合其靶信使RNA 的3'-UTR 来抑制表达，其功能障碍会干扰致癌或抑癌靶基因的表达，这与癌症的发病机制有关[7]。现有研究表明，miRNAs 可以封装在外泌体中由肿瘤细胞分泌到肿瘤微环境中，促进肿瘤与基质的相互作用；或释放到主要的远处器官进行循环，以进行随后的转移[8]。本文主要概述乳腺癌中外泌体miRNAs 参与肿瘤发生发展、转移侵袭、治疗等方面的重要作用，以期今后为临床应用这些潜在的生物标志物提供参考。

1 外泌体miRNA 在乳腺癌生长增殖中的作用

1.1 营养代谢是肿瘤细胞生长的重要条件 肿瘤细胞在生长过程中需要大量营养物质来支持其能量需求和生物合成。Yan W 等[9]研究发现将含有高或低水平miR-105 的外泌体（Exosome，Ev）注射到小鼠乳腺癌细胞的生长部位后，肿瘤相关成纤维细胞（cancer-associated fibroblasts，CAFs）模型中乳酸、乙酸和谷氨酸的细胞内水平都升高；将高水平组miR-105 外泌体与其他对照组相比，该组小鼠乳腺癌生长速度和乳腺癌细胞的增殖明显增强。体内数据表明，外泌体miR-105 重编程的CAFs 可产生更多代谢产物滋养肿瘤细胞，促进其生长。

1.2 向正常细胞转移促进癌症进展 Wang B 等[10]发现，外泌体携带的miR-1910-3p 能促进乳腺癌细胞向乳腺正常上皮细胞的增殖和迁移。在体外，富含miR-1910-3p 的外泌体通过转移到正常乳腺上皮细胞中，诱导细胞自噬、抑制细胞凋亡。在体内，其通过下调肌小管相关蛋白3，激活NF-κB 和Wnt/βcatenin 信号通路，促进乳腺癌进展。该研究表明，高水平的miR-1910-3p 可诱导乳腺癌细胞自噬，抑制细胞凋亡；而低水平的miR-1910-3p 表达可降低自噬，增加细胞凋亡，抑制其增殖和迁移能力。

1.3 抑制局部免疫促进肿瘤生长 Xing F 等[11]研究发现，在乳腺癌脑转移瘤患者体内X-灭活特异性转录本（X inactivate-specific transcript，XIST）显著下调，XIST 的缺失增加了外泌体miR-503 的分泌，同时外泌体miR-503 能够通过调节NF-κB 通路，将小胶质细胞从M1 型转化为M2 型。M2 巨噬细胞可以通过表达细胞程式死亡-配体1（Programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1）来抑制T 细胞免疫[12，13]，进而增强其PD-L1 的表达，抑制局部免疫，促进肿瘤生长。

2 外泌体miRNA 在乳腺癌转移侵袭中的作用

2.1 外泌体miRNA 是肿瘤转移的介质 许多研究表明，外泌体miRNA 在癌症转移中起着非常重要的作用。Singh R 等[14]比较了转移性MDA-MB-231 细胞和非恶性人正常乳腺细胞，发现在144 个与癌症相关的miRNA 中，内源性的miR-10b 在MDA-MB-231 细胞中显著表达，而在非恶性人正常乳腺细胞中表达极低。同样，miR-10b 在细胞外（即外泌体）也有类似的表达模式，这表明miR-10b 可以被MDAMB-231 细胞活跃分泌。该研究还发现，外泌体miR-10b 可以从供体细胞转移到受体细胞，表明miRNAs 可以通过外泌体在各种类型细胞间水平转移，证明其在乳腺癌侵袭转移中发挥着重要作用。

2.2 外泌体miRNA 介导肿瘤免疫逃逸 诱导免疫抑制可以促进肿瘤的生长和侵袭，骨髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）在肿瘤逃离宿主免疫监视中发挥着重要作用[15]。Jiang M 等[16]研究发现，乳腺癌细胞来源的外泌体可以分泌大量miR-181a 和miR-9，阻断这些外泌体的释放可完全减弱miRNAs 介导的对MDSCs 发育的调控。这两种miRNAs 通过增强MDSCs 原位浸润使未成熟MDSCs 扩增，从而促进乳腺癌细胞生长和免疫逃逸，其对T 细胞免疫有强烈的抑制作用，最终可导致肿瘤细胞的生长及侵袭。

2.3 通过细胞转型促进肿瘤转移 Xing F 等[11]分析了乳腺癌脑转移瘤患者中的长链非编码RNA，发现XIST 在这些组织中表达下降，其表达水平与脑转移呈负相关。在异种移植模型中发现，小鼠乳腺中XIST 的缺失会加速原发肿瘤的生长，并促进脑内转移的发生。XIST 的缺失同时会促进外泌体miR-503的分泌，外泌体miR-503 也由X 染色体编码且通过调节STAT3 和NF-κB 通路，将小胶质细胞从M1 型重编程为M2 型，M2 小胶质细胞已被报道通过释放细胞因子和生长因子促进脑肿瘤的进展[17，18]。这些研究证明了外泌体miR-503 水平与脑转移状态呈正相关。

3 外泌体miRNA 在肿瘤微环境中的调控作用

3.1 外泌体miRNA 可形成特有的肿瘤微环境 肿瘤微环境通常指与实性肿瘤存在距离较近的区域。1989 年佩吉特首次提出著名的“种子和土壤”假说，使微环境与肿瘤之间的关系引起了广泛关注，该假说认为，只有当癌细胞与潜在转移（种子）所兼容的器官微环境（土壤）共同存在时发才会发生肿瘤转移[19，20]。Melo S 等[21]研究发现，乳腺肿瘤细胞的外泌体可以形成特有的肿瘤环境，然后在其内部生成成熟的miRNAs。当非致瘤性乳腺上皮细胞（MCF-10A）和这些外泌体（MDA-MB-231）共培养时，正常细胞会发生癌变。Baroni S 等[22]研究表明，外泌体可以将肿瘤分泌的miR-9 转移到受体正常的成纤维细胞（normal fibroblasts，NFs），miR-9 在乳腺癌细胞中显著上调且直接靶向于钙黏蛋白（CDH1），miR-9可参与微环境重编程，激活正常成纤维细胞的肿瘤促进能力，进而增加癌细胞的活力和侵袭性。

3.2 外泌体miRNA 诱导微环境代谢 乳腺癌细胞可作为代谢寄生虫，从局部脂肪细胞中获取能量和生物量。有研究表明[23]，来自脂肪细胞的外泌体携带的蛋白质通过增加脂肪酸氧化（FAO）促进癌细胞的迁移和侵袭。Wu Q 等[24]研究发现，含有miR-144 和miR-126 的外泌体在与脂肪细胞共培养的乳腺癌细胞中高度分泌，外泌体miR-144 通过下调MAP3K8/ERK1/2/PPARγ 轴来促进米色/棕色脂肪细胞分化；外泌体miR-126 通过干扰IRS/Glut-4 信号通路，激活AMPK/自噬通路、控制脂肪细胞中HIF-1α 的表达来重塑代谢。此外，在氧化应激和缺氧条件下，外泌体分泌miR-126 增多，表明癌细胞的外泌miR-126 可能参与了肿瘤血管生成和恶性转化[25，26]。

4 外泌体miRNA 对乳腺癌血管的影响

Pakravan K 等[27]研究发现，间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）来源的外泌体以剂量依赖的方式诱导乳腺癌细胞中血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF） 转录水平下调；该研究发现，miR-100 由MSC 分泌的外泌体携带并运输，可显著抑制mTOR 和HIF-1α 在mRNA和蛋白上的表达，且乳腺癌细胞中miR-100 和VEGF 的表达水平呈负相关[28]。这些结果表明，VEGF 的下调是特异性的，很大程度上依赖于外泌体携带的miRNA 的转移。此外，miR-100 的诱导作用可以抵消上皮间充质转化（EMT）诱导转录因子的促瘤作用，从而调控不同的基因参与肿瘤的发生[29]。该研究发现，使用anti-miR-100 可以挽救MSC 来源的外泌体对VEGF 表达的抑制作用，证实了外泌体携带miR-100 在乳腺癌细胞中调控VEGF 表达中的抑制作用。不仅如此，Pan S 等[30]的研究发现，与对照组比较，外泌体miR-145 明显增加人脐静脉内皮细胞（HUVECs）形成，故MDA-MB-231 细胞衍生的自身外泌体对其内皮细胞的增殖有显著作用，可促进肿瘤血管生成。

5 外泌体miRNA 有望成为诊断乳腺癌及预后的指标

目前，临床上关于乳腺癌的诊断主要依靠于病理及影像学指标，但因其有创性、对开展技术所需的人员水平和设备要求高以及费用问题等，导致乳腺癌的早期诊断率仍然不理想，因此需要引入新的生物标志物来克服相关限制。因外泌体包裹的分子在非生理环境中也能表现出与众不同的稳定性和耐药性[31]，使其可以成为监测疾病有前途的生物标志物[32]。有研究证实[14]，乳腺癌患者血清中外泌体miR-1910-3p 的表达明显高于健康志愿者，且患者体内血清CA153 的诊断灵敏度为68%，特异性为60%；血清外泌体中miR-1910-3p 的诊断敏感度为88%，特异性为76%。这些数据表明，血清外泌体miR-1910-3p 的诊断效果明显高于传统的肿瘤标志物CA153，可作为乳腺癌的新分子检测方法。

6 外泌体miRNA 在乳腺癌治疗及耐药中的作用

由于外泌体具有稳定、通透性强、免疫原性差、毒性小、生物相容性差等特性，目前可被模拟作药物传递系统的纳米颗粒载体[31]。有研究证实[33]，化疗药物和小干扰RNA 已成功封装在外泌体中且成功用于靶向乳腺癌、胰腺癌、肺癌和前列腺癌的治疗。有研究将MDA-MB-231 细胞与表达miR-148b-3p 的人类脐带间充质干细胞衍生的外泌体共培养，发现携带miR-148b-3p 的外泌体在体外对MDA-MB-231 的进展有抑制作用[34]，这凸显了含有miR-148b-3p 的外泌体对乳腺癌的治疗潜力。另外，外泌体miR-423-5p 在三阴性乳腺癌细胞中对顺铂具有耐药性[35]；外泌体miR-222 可使阿霉素敏感的乳腺癌细胞对阿霉素产生耐药性，但外泌体miR-770 过表达可通过诱导细胞凋亡增强三阴性乳腺癌细胞系对阿霉素的敏感性[36]；外泌体miR-222 和miR-221也可使他莫西芬敏感的乳腺癌细胞对他莫西芬产生耐药性[37]。这些研究证实了外泌体miRNAs 在乳腺癌转移和耐药中的重要性，也为开展基于外泌体miRNA 的癌症治疗方法的研究提供了理论基础。

7 展望

外泌体miRNAs 受膜泡的保护作用，其在血液和其他体液中的含量较稳定，因此有望成为早期诊断乳腺癌的无创生物标志物[38]。此外，外泌体miRNAs 可通过促进肿瘤细胞免疫逃逸和促进肿瘤微环境改变等途径提高肿瘤细胞的侵袭性。但目前外泌体miRNAs 提取并不能完全适用于临床，有学者从RQ-PCR 的广泛周期阈值中发现，不同人群的外泌体miRNAs 表达水平有显著差异[39]，这种变异会影响外泌体miRNAs 作为乳腺癌生物标记物的临床适用性，且患者的基础疾病等也可能影响miRNAs 的水平，从而该项检测缺乏特异性[40]。此外，现阶段获取外泌体miRNA 方式主要以超离心分离技术为主，其设备成本高、运行时间长、可移植性低，这在一定程度上也限制了该技术的推广应用。

8 总结

外泌体miRNAs 直接参与了乳腺癌的发生、转移及耐药，其可作为一种可被定量检测的，新的乳腺癌生物标志物。但由于人群特异性和检测技术等限制，该技术目前尚未在临床广泛应用。因此，如何快速便捷的获取外泌体miRNA，并提高外泌体miRNAs 作为乳腺癌诊断生物标志物的灵敏度和特异性是未来的研究方向。