精浆中GDF-15对妊娠结局的影响

马艳民，曹浩哲，李诗卉，徐 珊，郑鹏生

(西安交通大学第一附属医院：1.生殖医学科；2.泌尿外科，陕西西安 710061)

早期妊娠丢失(early pregnancy loss, EPL)是指妊娠前3个月发生的妊娠失败，包括生化妊娠和流产[1]。EPL显著降低了辅助生殖技术(assisted reproductive technology, ART)的成功率以及抱婴率，增加了患者的心理及经济负担[2-5]。宫内人工授精技术(intrauterine insemination, IUI)是治疗男、女性因素不育和不明原因不育的一线治疗方法[6-7]。研究证实精浆中的免疫活性物质参与妊娠早期受精卵着床[8-9]。FRIEDLER等[10]发现，移植前精浆处理阴道可增加体外受精(in vitro fertilization, IVF)的妊娠率。精液中的免疫活性物质可激活子宫内膜中Treg细胞，进而建立免疫耐受微环境，促进受精卵着床[11-12]。SOUCEK等[13]发现人精浆中大量表达生长分化因子15(growth differentiation factor 15，GDF-15)，并证实其免疫抑制特性。本研究通过比较IUI与自然妊娠两者妊娠结局的差异，初步探讨精浆因素在早期妊娠中的作用，为临床提供指导。

1 对象与方法

1.1 对象及数据收集本研究经西安交通大学第一附属医院医学伦理委员会批准(No.XJTU1AF2017LSK-134)。所有受试者均给予书面知情同意。为避免选择偏倚，本研究仅纳入既往有自然流产史且目前为单胎的孕妇，同时排除夫妇双方外周血核型异常或超声证据显示子宫病变的妇女，包括先天性子宫畸形、子宫肌瘤、子宫内膜息肉和宫内粘连等。在本研究中，我们共纳入326例自2015年1月1日—2017年12月31日期间就诊于我科的已知妊娠患者。根据妊娠方式将患者分为IUI组(即通过IUI技术使其妊娠)和自然妊娠组(即通过监测排卵指导同房使其妊娠)。主要研究终点为EPL率、中晚期流产率和活产率。EPL是指妊娠前3个月(≤12周)发生的妊娠丢失。生化妊娠是指血清人绒毛膜促性腺激素β(human chorionic gonadotropin β，β-HCG)>15 U/L，但超声检查不能探及孕囊发生的妊娠失败。流产是指临床超声检查可以探及妊娠囊后发生的妊娠失败。详细记录患者年龄、身高、体质量、甲状腺功能、卵泡刺激素水平(月经周期第2～4天)、子宫内膜厚度(扳机日或排卵日)，男方的年龄及精液质量。

1.2 临床处理对于月经周期规律且能自发排卵的患者按照自然周期处理。对于排卵障碍的患者，从月经周期第5天开始口服克罗米芬50～100 mg或肌注尿促性素(human menopausal gonadotropin，HMG)75～150 U处理。期间定期接受激素检查和超声检查以判断卵泡发育情况。当超声检查显示卵泡直径≥18 mm时，对于排卵障碍者给予5 000～10 000 U 的HCG扳机处理，对于排卵正常者则指导其同房。IUI过程中的精液处理是采用percoll密度离心对新鲜精子进行优化处理，将处理后的精子(不含精浆成分)移入女性宫腔内。妊娠定义为至少连续2次血清HCG≥15 U/L。所有患者在妊娠约5～6周时进行超声常规监测以确定宫内妊娠。确定妊娠后近80%的患者肌注黄体酮20 mg/d(浙江仙琚药业有限公司，中国浙江)进行黄体支持。采用电化学发光免疫分析法检测血清促甲状腺激素(thyroid-stimulating hormone, TSH)、游离甲状腺素(free thyroxine, fT4)和促卵泡生成素(follicle-stimulating hormone, FSH)水平。

1.3 免疫印迹精液离心去除细胞，上清液变性后得到精浆蛋白，25 μg /孔上样，12.5%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis, SDS-PAGE)120 V电泳、110 V电压转膜，20 g/L脱脂牛奶室温封闭1 h。一抗GDF-15单克隆抗体(1∶1 000)孵育4°C过夜。TBST漂洗3次，每次10 min。二抗辣根过氧化酶标记的羊抗鼠(1∶1 000)室温孵育1 h。TBST漂洗3次，每次10 min，使用高灵敏度化学发光仪ChemiDoc XRS 显色系统扫描显色。

1.4 组织块体外培养及实时定量RT-PCR将小鼠新鲜子宫内膜标本切成1 mm×1 mm×2 mm大小，置于24孔培养板中用含有100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的DMEM/F12培养基培养，分别用质量浓度为0、0.1、1.0 ng/mL的GDF-15 (rhGDF-15; 213-10, 128-1, Norcross, GA, USA)分别处理24 h和48 h。使用Trizol(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)提取总RNA，取2 μg总RNA进行逆转录。 mRNA的定量分析使用iQ SYBR Green Supermix(TaKaRa，大连，中国)试剂盒在iCyclerPCR仪上进行，反应条件为：95 ℃、30 s；95 ℃、5 s；60 ℃、30 s，循环数45；50 ℃、5 s。引物序列如下：LIF，5’-AACCAGATCAAGAATCAACTGGC-3’(F) and 5’-TGTTAGGCGCACATAGCTTTT-3’(R)； Integrin ανβ3，5’-CCGTGGACTTCTTCG-AGCC-3’ (F) and 5’-CTGTTGAATCAAACTCAATGGGC-3’ (R)； HOXA10， 5’-CCTGCCGC-GAACTCCTTTT-3’ (F) and 5’-GGCGCTTCATTACGCTTGC-3’ (R)； HOX A11， 5’-TTTGATG-AGCGTGGTCCCTG-3’(F) and 5’-AGGAGTAGGAGTATGTCATTGGG-3’ (R)； β-actin， 5’-GTG ACGTTGACATCCGTAAAGA-3’ (F) and 5’-GCCGGACTCATCGTACTCC-3’ (R)。

1.5 统计学分析采用描述性统计方法分析患者的基本特征。采用GraphPad Prism 5.0(GraphPad Software, Inc, La Jolla, CA, USA)进行统计学分析，组间差异采用t检验或χ2检验进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本特征纳入的326例妊娠者中，IUI组与自然妊娠组两组间在女性年龄、体质指数(body mass index, BMI)、甲状腺功能(TSH及fT4水平)、月经第3天血清FSH水平、排卵日子宫内膜厚度、卵巢储备功能、妊娠后黄体支持及男性年龄、精液参数方面差异均无统计学意义(P均>0.05，表1)。

表1 纳入的 326例患者的基本特征

另外，两组间在促排卵用药、扳机用药以及妊娠后的黄体支持方面差异均无统计学意义(P均>0.05，表2)。

表2 纳入的326例患者刺激排卵时的用药特征

2.2 妊娠结局分析在190例IUI妊娠组中，66例(34.74%)患者发生EPL，其中生化妊娠者占13.68%，早期流产占21.05%。超过12周持续妊娠的患者中，3.68%发生流产，另外有1.05%的患者失访，最终有61.17%顺利分娩。在136例自然妊娠组中，30例(22.06%)发生EPL，其中生化妊娠占8.09%，早期流产占13.97%。超过12周持续妊娠的患者中，1.47%发生流产，另外有5.15%失访，最终有75.19%顺利分娩(图1)。IUI组和自然妊娠组在EPL率和活产率方面存在统计学差异(P均<0.05)，超过12周的流产率在两组间差异无统计学意义(P均>0.05，表3)。

IUI：人工授精；EPL：早期妊娠丢失。

表3 妊娠患者的临床结局 [例(%)]

2.3 免疫印迹既往研究证实，人精浆中含有丰富的GDF-15。为了验证这一结果，我们收集来自门诊5名参数正常的志愿者的精液样本(依据WHO人类的精液检验和处理实验室手册第5版)进行免疫印迹分析。结果显示，GDF-15蛋白在5个样本中均有表达(图2)。

图2 采用Western blot方法检测精浆中GDF-15水平

2.4 实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)采用体外组织块培养和实时定量聚合酶链反应(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)技术研究GDF-15对子宫内膜容受性相关基因表达的影响(图3)。本研究选择LIF、Integrin ανβ3、HOXA 10和HOXA 11基因作为子宫内膜容受性的分子标记。

分别用0、0.1、1.0 ng/mL质量浓度的rhGDF-15处理小鼠子宫内膜组织24 h和48 h，实验重复3次以表示，*P<0.05。

结果显示，LIF、Integrin ανβ3和HOXA 11基因在GDF-15处理24 h和48 h组中的表达水平均显著高于对照组(图3)。该结果提示GDF-15处理可以增加小鼠子宫内膜容受性。

3 讨 论

ART治疗本身是否为EPL的一个危险因素目前尚无定论。PEZESHKI等[14-15]报道，通过ART方式妊娠的妇女与自然妊娠的妇女具有相似的流产风险。然而也有研究表明，在调整女性年龄和反复流产等风险因素后，不育夫妇经ART治疗后妊娠者比自然妊娠者发生流产的风险更高。BRANDES等[16]在一项纵向多中心队列研究中发现，自然妊娠者发生早期流产的风险为14.5%(125/864)，而经IUI妊娠发生早期流产的风险为25.0%(5/20)。此项研究与我们的研究结果较为一致。本项的研究结果显示，经自然妊娠发生早期流产的风险为15.2%(19/125)，而经IUI方式妊娠发生早期流产的风险为24.39%(40/164)。

既往研究提示高龄是导致EPL的风险因素[1,17]。本研究纳入人群中IUI与自然妊娠两组间年龄、BMI、甲状腺功能、子宫内膜厚度、卵巢储备功能、促排卵用药、黄体支持等方面，以及男性年龄、精液参数两组间差异均无统计学意义。此外，夫妇双方染色体异常及孕妇子宫畸形也会增加流产风险，本研究在纳入研究对象时排除了这些方面的偏倚。

值得注意的是，在IUI时我们采用Percoll分层离心法进行优化精子，最终丢弃精浆只收集优质精子。因此，IUI组与自然妊娠组之间最显著的差异是有无精浆。既往研究证实男性精浆中存在多种免疫活性物质[8-9]。FRIEDLER等[10]发现，移植前用精浆处理阴道可增加IVF-ET后的植入率和临床妊娠率。也有研究表明，精液中的免疫活性物质可以激活子宫内膜中的Treg细胞，进而建立免疫耐受微环境促进受精卵着床[11～12]。众所周知，对于母体而言，受精卵是一个半自身抗原，其成功着床依赖于免疫系统中多种细胞参与调节促炎与抗炎反应之间的平衡，以建立母体特异性的免疫耐受(豁免)机制。SOUCEK等[13]发现人类精浆中含有大量GDF-15，并证实其具有免疫抑制特性。据此我们猜测，精浆中的GDF-15可能参与建立子宫内膜免疫耐受状态，进而促进受精卵着床。为此，通过体外实验探讨GDF-15对小鼠子宫内膜容受性的影响。本研究中的qRT-PCR结果显示，GDF-15能够上调小鼠子宫内膜容受性基因LIF、Integrin ανβ3和HOXA 11的表达。子宫内膜容受性是指子宫内膜允许受精卵定位、粘附、侵入并改变子宫内膜间质，最终促进受精卵着床的一种能力。受精卵只有在高容受性的子宫内膜环境下才能顺利定植、发育。相反，容受性较差的子宫内膜往往被认为是不孕和流产最常见的原因。

总之，本项研究采用回顾性病例对照研究的方法，在既往有流产史的育龄人群中，通过比较经IUI(无精浆)妊娠与自然妊娠(有精浆)之间妊娠结局的差异，发现经IUI妊娠后发生EPL的概率显著高于自然妊娠者，而活产率显著低于自然妊娠者。同时，我们发现精浆中的免疫活性物质GDF-15，能够上调小鼠子宫内膜容受性相关基因的表达，提示GDF-15在妊娠早期建立子宫内膜容受性过程可能发挥积极作用。未来，我们将继续探索GDF-15在受精卵着床和妊娠维持中的作用，并进一步探讨GDF-15参与调控子宫内膜容受性的具体分子机制。