黑胫病不同抗性烤烟品种对哈茨木霉的生理响应

殷全玉，匡志豪，王 景，任天宝，张松涛，姬小明，刘国顺，穆耀辉

（1. 河南农业大学 烟草学院，河南 郑州 450002；2. 陕西省烟草公司商洛市公司，陕西 商洛 726000）

烟草黑胫病是由烟草疫霉（Phytophthora nicotianae）引起的一种土传真菌病害[1]，其有效防治是烟叶生产中面临的突出性难题[2]。目前，烟草黑胫病仍以化学防治为主[3]，但大量施用化学农药导致病原菌抗性增强、烟叶品质降低，同时对生态环境产生一系列负面影响。因此，探索烟草生产中的绿色防控措施，是减少病害损失、实现优质烟叶生产、维护烟区生态环境安全的重要途径。

木霉菌是一类普遍存在于土壤中的重要生防资源，能够对18 个属20 余种病原真菌表现出拮抗作用，在生物防治中备受关注[4⁃6]。田艳艳等[7]通过平板对峙试验发现，哈茨木霉对尖孢镰刀菌和烟草疫霉菌有较强的拮抗作用。陈小均等[8]研究表明，哈茨木霉T150 孢子悬液蘸根和灌根能有效降低烟草黑胫病的发生，小区和大区示范试验防治效果均达76%以上。研究显示，木霉菌通过诱导植物体内POD（过氧化物酶）、PPO（多酚氧化酶）、PAL（苯丙氨酸解氨酶）和CAT（过氧化氢酶）等防御性酶活性升高，产生多种抗菌因子，抵制病原菌入侵，有效降低病害发生[9⁃11]。朱洪江[12]研究表明，与清水处理对照相比，经哈茨木霉菌孢子悬液灌根后烟草青枯病发病率由73.33%降至47.00%以下，POD 和PAL 活性显著升高。此外，木霉菌作为重要的植物根际促生菌（Plant growth⁃promoting fungi，PGPF），能加快植株对矿质营养的吸收，促进宿主生长[13]。近年来，关于木霉菌对植物促生防病效果的报道[14⁃15]已有很多，但由于植物品种差异，木霉对其生理代谢过程的影响及防病效果均存在差异。刘朝辉等[16]利用哈茨木霉T23孢子悬浮液分别处理黄萎病不同抗性茄子品种，结果显示，各品种防御性酶活性较清水处理均明显升高，相同处理下不同品种幼苗POD、PPO、SOD（超氧化物歧化酶）活性存在差异；杜安楠等[17]研究表明，木霉菌能有效提高草莓植株的植物学性状、生理指标和抗病酶活性，但不同品种间作用效果存在较大差异。目前，关于哈茨木霉对烤烟生长、生理特性以及防病效果的影响尚缺乏系统研究。鉴于此，初步探索了哈茨木霉对3 个黑胫病不同抗性烤烟品种生长发育、黑胫病发病情况和防御性酶活性的影响，旨在明确烤烟生产中木霉菌剂的使用效果，为绿色烟叶生产提供技术支撑。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试烤烟品种 黑胫病高抗品种G28、中抗品种K326、高感品种净叶黄均由河南农业大学烟草学院提供。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂培养基（PDA）：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 值自然。燕麦琼脂培养基（OA）：60 g 燕麦仁，20 g 蔗糖，8 g 琼脂，蒸馏水1 000 mL，pH值自然。

1.1.3 供试菌株 哈茨木霉CGMCC23294 由中国农业科学院农业微生物菌种保藏中心提供，烟草疫霉由河南农业大学烟草学院保存、提供。

1.1.4 菌液制备 将哈茨木霉接入PDA 平板，（27±1）℃培养5～7 d 后用无菌水将孢子冲洗下来，制成1×107cfu/mL 哈茨木霉孢子悬浮液备用。将烟草疫霉接入OA 培养基，（26±1）℃培养6～7 d 后用无菌水将孢子冲洗下来，并制成1×105cfu/mL 疫霉孢子悬浮液备用。

1.2 试验处理

试验在河南农业大学许昌校区烟草基地温室大棚内进行，盆栽土壤采用大田耕层土壤，除去杂草和碎石后过1 cm×1 cm 筛网，按1.83 g/kg 添加复合肥[m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1.5∶3]，充分混匀，装入内口径20.5 cm、高度13.5 cm 的花盆，每盆装土3 kg。

采用常规漂浮育苗方法，待烟苗长至移苗期装盆移栽，移栽时利用哈茨木霉孢子悬浮液（1×107cfu/mL）进行灌根处理，每株烟接种20 mL，以清水灌根为对照（CK），每个烤烟品种接种木霉菌与未接种木霉菌处理各50株。

1.3 试验测定指标及方法

1.3.1 生物学性状 移栽后28 d，测量各处理烟株株高、茎围和叶面积（自上而下第5 片叶，叶面积=0.634 5×叶长×叶宽）；小心挖出完整烟株根部，抖落土壤，清洗干净，吸干水分称量地上部和地下部鲜质量，计算根冠比（地下部鲜质量/地上部鲜质量）。利用EPSON 根系扫描仪完整扫描根部，将扫描后图像存入计算机，通过WinRHIZO分析总根长、根表面积、平均根直径、根体积和分支数，扫描后的根部同地上部于105 ℃杀青15 min 后，70 ℃烘干称质量，各处理重复5次，每次重复3株。

1.3.2 生理生化指标 分别在移栽后7、14、21、28 d 对各处理取样，按照丙酮-乙醇提取法测定叶绿素含量，采用TTC 法测定根系活力，采用活体分光光度法测定根系硝酸还原酶活性，每个处理5 次重复。

1.3.3 防治效果及诱导抗性指标 烟苗移栽后28 d，采用灌根接种法取配制好的烟草疫霉孢子悬浮液（1×105cfu/mL）20 mL/株均匀接种至烟株根部土壤，14 d 后调查发病率，计算病情指数及防治效果，取各处理烟株根部按赵世杰等[18]方法测定POD、PAL、PPO 和CAT 活性，5 次重复。烟草黑胫病分级标准参照烟草病虫害分级及调查方法（GB/T 23222—2008）。发病率=[病叶（株）数/调查总叶（株）数]×100%，病情指数=∑（病级数×该级病株数）/（最高病级数×调查总株数）×100，

防治效果=[（对照病情指数-处理病情指数）/对照病情指数]×100%。

1.4 数据处理

数据采用Excel 2019 和SPSS 25.0 进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 哈茨木霉对不同烤烟品种生物学性状的影响

2.1.1 地上部生物学性状 由表1 和图1 可知，移栽后28 d，经哈茨木霉处理的各烤烟品种烟株株高、茎围、叶面积均显著高于清水处理，说明哈茨木霉对烟草地上部生长具有显著促进作用。与CK 相比，接种哈茨木霉后K326 株高、茎围和叶面积提高最显著，增幅分别为54.21%、32.83%和67.42%，其次是G28，增幅分别为39.00%、21.45%和47.09%。综合各生长指标促进效果来看，哈茨木霉对烟草叶片和株高生长的促进效果强于对茎围生长的促进效果，即叶面积>株高>茎围。接种哈茨木霉后，各烤烟品种间仍以K326 长势最好，其次是净叶黄，两品种烟株叶面积较为接近，相比G28扩展能力更强。

图1 哈茨木霉对不同烤烟品种烟株长势的影响Fig.1 Effects of Trichoderma harziana on the growth of different flue-cured tobacco varieties

表1 哈茨木霉对不同烤烟品种地上部农艺性状的影响Tab.1 Effects of Trichoderma harziana on agronomic traits of shoot of different flue-cured tobacco varieties

2.1.2 地下部生物学性状 由表2 和图2 可知，烤烟移栽时利用哈茨木霉孢子悬浮液灌根对各烤烟品种根部发育有不同程度的促进作用。与CK 相比，移栽后28 d，哈茨木霉处理各烤烟品种根体积和分支数增幅较大，均达80%以上；其中K326 平均根直径和根体积增加更显著，3 个品种总根长和根表面积增幅接近。说明哈茨木霉处理有利于烟株根系扩展，促使根系发达。接种哈茨木霉后，G28和净叶黄各根系指标相近，均低于K326。综合各烤烟品种烟株根系发育指标分析，K326在哈茨木霉作用下长势更好。

图2 不同处理下各烤烟品种的根系扫描结果Fig.2 Root scanning results of flue-cured tobacco varieties under different treatments

表2 哈茨木霉对不同烤烟品种烟株根系发育的影响Tab.2 Effects of Trichoderma harziana on root development of different flue-cured tobacco varieties

2.1.3 烟草生物量积累 由表3 可知，哈茨木霉处理后各烤烟品种地上部和地下部生物量积累均显著高于CK。与CK 相比，不同烤烟品种地下部鲜质量增加均在80%以上，略高于地上部鲜质量增幅。3 个品种中，K326 地下部鲜质量和地上部鲜质量分别提高84.16%和82.12%，增幅最大。接种哈茨木霉后，各烤烟品种地上部干质量增幅均达78%以上，以净叶黄地上部干质量增幅（92.31%）最大，其次是G28（83.05%）。哈茨木霉接种后，净叶黄烟株根冠比有所升高，但未达显著水平，说明哈茨木霉能促进烟草地上部和地下部生物量积累，但对烟株根冠比的提高效果不显著。

表3 哈茨木霉对不同烤烟品种生物量积累的影响Tab.3 Effects of Trichoderma harziana on biomass accumulation of different flue-cured tobacco varieties

2.2 哈茨木霉对不同烤烟品种生理特性的影响

2.2.1 叶绿素含量 由图3 可知，各处理烟株叶片叶绿素含量随移栽后时间延长逐渐增加，哈茨木霉接种后3 个品种叶绿素含量均表现为K326>净叶黄>G28，且哈茨木霉接种处理显著高于CK。其中K326和净叶黄经哈茨木霉灌根后叶绿素含量较CK增幅先升高后降低，在移栽后14 d 增幅达到峰值，分别为47.34%和46.86%；G28经哈茨木霉处理后叶绿素含量较CK 增幅随移栽后时间延长而逐渐降低，移栽后7 d 达到最大（39.89%）。移栽后28 d，哈茨木霉处理G28、K326 和净叶黄叶绿素含量相比CK 增幅分别为27.76%、21.45%和20.14%。总体来看，哈茨木霉灌根后各烤烟品种叶绿素含量与CK差值随移栽后时间延长而减小，但移栽后28 d 仍显著高于CK。

图3 哈茨木霉对不同烤烟品种叶片叶绿素含量的影响Fig.3 Effects of Trichoderma harziana on chlorophyll content in leaf of different flue-cured tobacco varieties

2.2.2 根系活力 由图4 可知，哈茨木霉处理可以不同程度地提高烟草根系活力，各烤烟品种根系活力随移栽后时间延长而升高。哈茨木霉接种后，G28和净叶黄根系活力较CK增幅在移栽后7 d达到最高，分别为22.42%和27.62%，K326根系活力在移栽后14 d较CK 提高21.89%，增幅达到最高；移栽后28 d，哈茨木霉处理G28、K326和净叶黄根系活力较CK分别升高13.57%、11.81%和13.97%。

图4 哈茨木霉对不同烤烟品种根系活力的影响Fig.4 Effects of Trichoderma harziana on root activity of different flue-cured tobacco varieties

2.2.3 根系硝酸还原酶活性 如图5 所示，哈茨木霉灌根处理后3个烤烟品种根系硝酸还原酶活性均显著高于CK。移栽后14 d，K326 硝酸还原酶活性最高，且较CK 增幅最大（46.32%），G28 增幅其次，为38.47%；移栽后14～28 d，G28 和净叶黄根系硝酸还原酶活性迅速升高，3 个品种根系硝酸还原酶活性差异减小。哈茨木霉处理后，G28、K326、净叶黄根部硝酸还原酶活性较CK 增幅分别在移栽后21、14、7 d 达到最高，移栽后28 d 三者硝酸还原酶活性分别较CK提高20.81%、29.83%、17.29%。

图5 哈茨木霉对不同烤烟品种根系硝酸还原酶活性的影响Fig.5 Effects of Trichoderma harziana on nitrate reductase activity in roots of different flue-cured tobacco varieties

2.3 哈茨木霉对不同烤烟品种诱导抗性的影响

2.3.1 对烟草黑胫病的防治效果 由表4 可知，经哈茨木霉灌根后，不同黑胫病抗性烤烟品种黑胫病发病率和病情指数较CK 均显著降低，其中接种哈茨木霉对G28 黑胫病的防治效果最显著，达到84.09%，病情指数由32.42 降至8.34；其次是K326，防治效果为75.94%。综合各烤烟品种特性分析，哈茨木霉能有效拮抗烟草黑胫病，且接种哈茨木霉对烟草黑胫病的防治效果与烤烟自身抗性呈正相关，即在黑胫病高抗品种G28 上的防治效果优于中抗品种K326和高感品种净叶黄。

表4 哈茨木霉对不同烤烟品种黑胫病的拮抗效果Tab.4 Antagonistic effects of Trichoderma harziana on black shank disease of different flue-cured tobacco varieties

2.3.2 防御性酶活性 为探索哈茨木霉诱导烟株抗烟草黑胫病的机制，于烟株移栽后28 d 接种烟草疫霉孢子，14 d 后对烟株根系POD、PPO、PAL 和CAT 活性进行了分析。从表5 可看出，哈茨木霉对4种防御性酶活性具有激发效应。

表5 哈茨木霉对不同烤烟品种防御性酶活性的影响Tab.5 Effects of Trichoderma harziana on defensive enzyme activities of different flue-cured tobacco varieties

哈茨木霉处理有助于提高各烤烟品种根系POD 活性，与CK 相比，高感品种净叶黄POD 活性增幅（58.38%）略高于高抗品种G28和中抗品种K326，但高抗品种G28 的POD 活性高于中抗品种K326 和高感品种净叶黄。

哈茨木霉菌处理可以不同程度地提高烟草根系PPO 活性，对高抗品种G28 作用效果最显著，较CK 增幅为90.63%，其次是中抗品种K326，增幅为71.34%，高感品种净叶黄增幅为57.52%。

与PPO 活性变化相反，哈茨木霉处理后，高感品种净叶黄根系PAL 活性较CK 增幅最高，为69.44%；其次是中抗品种K326，增幅为51.56%；高抗品种G28增幅较低，仅为30.07%。

哈茨木霉处理能显著提高烟草根系CAT 活性。与CK 相比，中抗品种K326 增幅为105.92%，高抗品种G28 和高感品种净叶黄增幅分别为73.33%和80.00%。

综上，哈茨木霉处理后，不同烤烟品种根系防御性酶活性均显著升高，其中POD 活性受烤烟品种抗性影响较小，PPO 和PAL 活性变化趋势相反，哈茨木霉灌根有利于激发烤烟根系CAT 活性；同时，黑胫病不同抗性烤烟品种防御性酶活性总体表现为高抗品种G28>中抗品种K326>高感品种净叶黄。

3 结论与讨论

目前，关于应用木霉菌促进植物生长的报道已有很多，如伍晓丽等[19]发现，深绿木霉对不同品种青蒿株高、茎围、地下部干质量、地上部干质量以及叶质量均有促进作用，但各品种间作用效果存在差异。宋玉娟等[20]研究发现，不同浓度棘孢木霉T-6孢子液对烟草株高、根长、叶面积以及生物量积累有显著促进作用，但未进行多品种验证。本研究选取不同烤烟品种进行哈茨木霉接种，避免了单一品种造成的差异性，接种哈茨木霉后各烤烟品种烟株株高、叶面积、总根长、根体积、地上部鲜质量和地下部鲜质量均较CK 显著提高，其中总体以K326 以上各指标提高最显著，这可能是木霉菌株和烤烟品种之间的差异造成的。木霉菌代谢产物中含有促进种子萌发和幼苗生长的类植物生长素6-PP（6⁃n⁃pentyl⁃6H⁃pyran⁃2⁃one）以及可降解乙烯前体物质的ACC 脱氨酶，缓解了乙烯对烟株生长的抑制作用[21⁃22]；在根系各指标中，经哈茨木霉处理后烟株总根长、根表面积、根体积和分支数显著提高，说明哈茨木霉能够通过增加侧根、丛生根，延伸根系长度等方式形成发达的根系网络，使得烟株根部与土壤间有更大的接触面积和吸收范围，能在更广泛的土壤中获取水和养分[23]。另外，部分微溶或难溶的矿物质在木霉作用下溶解后被根系吸收，从而加快烟株生长[24]。本试验结果显示，接种哈茨木霉显著促进了烟株各营养器官生长和生物量积累，增强了烟株长势。

生理指标变化是衡量植株生长质量的重要依据，有研究表明，棘孢木霉和哈茨木霉通过灌根处理均能显著提高黄瓜幼苗叶绿素含量、根系活力、叶片硝酸还原酶活性等生理指标[25]。本试验中，烟株接种哈茨木霉后以上各生理指标较CK 增加显著，品种间表现为K326>净叶黄>G28。NIELSEN等[26]研究发现，同一作物不同品种对营养物质的吸收利用能力存在一定差异。本试验中，接种哈茨木霉后K326 烟株叶绿素含量最高，这对提高叶片光合速率，增加碳水化合物的形成和积累具有促进作用；同时，其根系活力和硝酸还原酶活性较其他2个烤烟品种更高，有利于提高根系对土壤水肥的吸收和对氮素的利用效率，从而促进烟株株高、叶面积、根体积扩展和生物量的积累，这也是木霉促进植物生长的机制之一。

活性氧和酚类化合物积累是植物应对病原菌侵染的早期反应[27]。活性氧影响植物多种细胞的功能，过量的活性氧导致细胞处于氧胁迫状态，引发膜脂过氧化，改变生物膜流动性，使酶失活和蛋白质发生交联，阻碍蛋白质合成，造成核酸受损等，最终导致细胞发生程序性死亡[28⁃29]。POD、PPO、PAL、CAT 是植物体内重要的防御性酶[30⁃31]，POD、CAT 是植物体内清除活性氧的主要酶，且POD 能诱导木质素的合成，清除胺类毒性[32]；PAL 是莽草酸-苯丙酸类代谢的限速酶，其活性是反映植物抗病性的重要指标[33]；而PPO 可将多酚类物质氧化为抗菌效应更强的醌类物质，被认为是植物防御机制中的重要组成部分[34⁃35]。LIANG 等[36]发现，生防菌L8 能有效降低黄瓜猝倒病的发病率，同时幼苗根部和叶片POD、PPO、PAL 和CAT 活性较未接种L8 菌株的幼苗显著升高。VANITHA 等[37]利用RT-PCR 方法证实，接种荧光假单胞菌后，番茄幼苗体内PPO、PAL等防御性酶活性显著提高，相关防御性酶合成基因表达水平升高，从而增强了番茄对青枯病的抗性。本试验中，接种哈茨木霉均有效降低了不同烤烟品种烟草黑胫病的发病率和病情指数，烟株根系防御性酶活性大幅升高。因此，哈茨木霉可能通过激发烟草体内相关基因表达，提高酶活性共同参与防御反应。其中G28 根系POD、PPO、PAL 和CAT 活性最高，分 别 较CK 提 高49.27%、90.63%、30.07% 和73.33%，对烟草黑胫病防治效果达到84.09%。不同抗性品种接种哈茨木霉对烟草黑胫病的防治效果表现为高抗品种G28>中抗品种K326>高感品种净叶黄，说明G28 对哈茨木霉的响应程度更高，虽然不同烤烟品种经诱导产生的抗病能力存在差异，但总体上对黑胫病的抑制效果显著。

综合以上分析，哈茨木霉对不同烤烟品种植物学性状、生理特性和生物量积累均有显著促进作用，本试验条件下对K326 作用效果最为显著；在烟草疫霉胁迫下，哈茨木霉诱导提高了烤烟对烟草黑胫病的拮抗作用。