采用CRISPR/Cas系统的基因编辑技术在肾脏疾病研究中的应用进展

罗楚漩 何强

基因编辑是一种利用细菌核酸酶有效准确地修改生物体基因组特定目标基因，研究基因功能、构建疾病模型以及治疗特定疾病的新型基因工程技术[1-2]。目前常用的基因编辑技术主要包括锌指核酸酶（zinc finger nucleases,ZFN）、转录激活样效应因子核酸酶（transcription activator-like effector nucleases,TALEN）以及规律成簇间隔短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）/CRISPR相关蛋白质（CRISPR-associated proteins,Cas）系统。然而，昂贵、费时、剪切效率低等缺陷限制了前两种技术在生命科学研究领域中的广泛应用。CRISPR/Cas系统是一种由细菌或古生菌的适应性免疫系统发展而来的第三代基因组定点编辑技术，能够快速有效地对基因组内特定的DNA序列进行编辑。由于其操作简单、效率高、特异性强、应用多样等诸多优点，已成为目前最受研究人员欢迎的基因编辑技术。随着CRISPR/Cas系统的出现，人类基因组研究发生了革命性的变化，人们能够更好地理解单个基因产物对生物体疾病的贡献。

已知许多肾脏疾病的发病机制与遗传因素密切相关，研究发现高达15%的病例直接源自孟德尔突变，而更多的病例可能涉及更为复杂的遗传模式[3]。虽然许多导致肾脏疾病的基因已经被确认，但还需要功能性实验来验证遗传学研究中产生的候选基因，并确定突变如何在细胞和组织水平上导致疾病。此外，还有许多未知的与肾脏疾病相关的基因等待研究人员进一步探索。CRISPR/Cas系统使人们能够进行有针对性的实验来解决这些问题，更加深入地理解肾脏疾病的病理生理学，因此越来越多地被应用于肾脏疾病的研究。本文主要从CRISPR/Cas系统的发现、基本原理、分类及其在肾脏疾病研究中的应用进展等方面作一综述，旨在为今后应用该基因编辑技术进行相关研究提供参考。

1 CRISPR/Cas系统概述

1.1 CRISPR/Cas系统的发现 CRISPR/Cas系统的发现最早可以追溯到1987年，Ishino等[4]首次报道在革兰阴性杆菌中发现负责碱性磷酸酶同工酶转化的iap基因中存在一段特殊的串联间隔重复序列，且该序列在多种细胞功能中均发挥着重要的作用。随后，人们相继在革兰阳性菌、古生菌中也发现了相似序列[5]。2002年Jansen等[6]正式将其命名为CRISPR，并在含有CRISPR的原核生物中发现了4个Cas基因。2005年Bolotin等[7]研究发现，间隔区基因与噬菌体已知基因之间存在一定的同源性，提示CRISPR/Cas系统可能是一种获得性的免疫防御系统。2007年CRISPR/Cas系统被进一步证实为原核生物的一种DNA修复机制，即病毒入侵后，细菌整合了噬菌体基因组序列的新间隔，通过去除或添加特定的间隔修饰细胞的噬菌体抗性表型[8]。2013年科学家们首次将CRISPR/Cas技术应用于人类细胞和小鼠细胞的基因组编辑[9-10]。2020年四川大学卢铀教授团队报道了全球首个采用CRISPR/Cas系统基因编辑人体临床试验，为该技术进一步向临床研究转化提供了重要依据[11]。CRISPR/Cas系统的发现为基因组学研究开辟了一条新途径，对遗传疾病和生物工程的应用产生了重要的影响。

1.2 CRISPR/Cas系统的基本原理 CRISPR/Cas系统通过引导核酸酶结合和剪切特定的核酸序列，为微生物提供针对外源基因元件的RNA引导的适应性免疫。虽然CRISPR/Cas系统的详细作用机制目前尚未完全阐明，但该系统发挥作用大致包括以下3个过程：第1个过程为适应，微生物捕获外源基因片段，并将外源DNA或RNA片段整合进基因组CRISPR序列；第2个过程为表达，将该外源片段转录成RNA，即CRISPR RNA（crRNA）；第三个过程为干预，在crRNA引导下，通过RNA-RNA或RNA-DNA配对，Cas蛋白作用于外源入侵DNA使其降解[12]。

1.3 CRISPR/Cas系统的分类 2011年Makarova等[13]将CRISPR/Cas系统分为3种类型和未分类的系统。Ⅰ型CRISPR/Cas系统主要包含Cas3基因。该基因不仅编码具有解旋酶和DNA酶活性的蛋白质，而且编码包含不同组分的级联复合物[14]。Ⅱ型CRISPR/Cas系统只存在于细菌中，该系统中的特征基因Cas9被证实能够产生crRNA和切割目标DNA。Ⅲ型CRISPR/Cas系统常见于古生菌中，该系统的特征基因Cas10能够编码一种结构域与核酸聚合酶和核酸环化酶结构域同源的蛋白[15]。

近年来，随着对CRISPR/Cas系统认识的不断深入，2015年Makarova等[16]对CRISPR/Cas系统进行重新分类。根据干预阶段参与蛋白，新的分类将CRISPR/Cas系统分为2大类，需要多个蛋白协同作用被分为1类系统，只需要一个蛋白参与的被分为2类系统。由于2类CRISPR/Cas系统组分较为简单，该系统成为目前研究最多、应用较为广泛的系统。

2 CRISPR/Cas系统在肾脏疾病研究中的应用

2.1 CRISPR/Cas系统在研究肾脏疾病治疗靶点中的应用

2.1.1 肾间质纤维化 肾间质纤维化是各种病因导致的慢性肾脏病不断进展的共同最终途径，以细胞外基质的过度生成和沉积为主要特征，被认为是导致肾功能损害的常见原因之一[17]。然而目前肾间质纤维化的发病机制尚未完全阐明。CRISPR/Cas系统为肾间质纤维化发病机制研究提供了新手段。大量研究结果表明，转化生长因子 β（transforming growth factor β,TGF-β）在组织纤维化的发生、发展过程中起着重要作用[18]。然而，抑制TGF-β预防纤维化的同时也会破坏其抗炎和创面愈合作用[19]。因此，如何平衡这两种相反的作用成为一个主要的临床难题。β-连环蛋白（β-catenin）是大多数TGF-β信号通路中常见的辅助因子。既往有研究表明，β-catenin与T细胞因子（T-cell factor,TCF）结合时可激活促纤维化基因，而与叉头转录因子（forkhead transcription factor O,FoxO）结合则促进细胞在氧化应激下的存活。2019年Rao等[20]采用CRISPR/Cas系统特异性敲除小鼠肾小管上皮细胞中的FoxO1或TCF1，证实了FoxO1可以抵抗TGF-β诱导的促纤维化蛋白表达，而TCF小分子抑制剂可预防单侧输尿管梗阻肾纤维化。该研究结果揭示了FoxO是肾间质纤维化的潜在治疗靶点。

2.1.2 急性肾损伤 急性肾损伤是一种以肾功能迅速下降、氮质血症、少尿或无尿为主要特征的综合征[21]。既往有研究表明，Klotho可防止肾脏损伤，该基因在衰老和急性肾损伤后表达减少[22-23]。IL-10是一种抗炎细胞因子，可改善顺铂治疗后的肾损伤[24-25]。大多数CRISPR/Cas系统发挥基因编辑作用主要依赖于诱导DNA双链的断裂，但DNA双链断裂引起的不必要的突变可能会带来有害的影响，因此影响了它们在临床治疗中的应用。科学家们开发了一种新型的Cas9蛋白，这种蛋白不仅能结合到基因组上的特点位置，而且不会造成双链DNA的断裂[26]。这些Cas9蛋白和另一些能影响基因表达的分子开关蛋白融合在一起，能起到转录调控蛋白的作用，从而定点启动特定的基因。腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）是一类结构简单的单链DNA缺陷型病毒，目前被认为是一种相对安全的基因转移载体，可以感染多种类型的细胞，包括分裂和非分裂细胞，在临床前研究中展现出了极大的前途[27]。2017年Liao等[28]利用不同的AVV载体分批把Cas9蛋白、分子开关、Klotho和IL-10的向导RNA（guide RNA,gRNA)递送到细胞内，观察到不仅这些基因表达的蛋白水平增加，而且还会改善急性肾损伤发生后的肾脏功能，该研究为开发针对急性肾损伤的表观遗传疗法开辟了新途径。

2.2 CRISPR/Cas系统在构建肾脏疾病模型中的应用

2.2.1 常染色体显性多囊肾病 常染色体显性多囊肾病（autosomal dominant polycystic kidney disease,ADPKD）是一种常见的遗传性肾脏病，以肾脏体积增大、高血压和各种肾外并发症为主要临床表现[29]。据估计，全球有大约600万ADPKD患者，其中超过一半的患者会发展为终末期肾脏病，并且需要透析或肾移植[30]。然而，目前尚缺乏治疗ADPKD的有效药物。ADPKD药物的开发依赖于疾病动物模型进行药物药效及药理筛选。随着CRISPR/Cas系统的迅速发展，该技术已被广泛应用于构建疾病动物模型领域，成为研究相应疾病的有效策略，为解决临床问题提供了良好的工具。大部分ADPKD主要由PKD1基因突变引起。2019年Tsukiyama等[31]运用CRISPR/Cas系统成功构建了敲除PKD1基因的恒河猴模型，该实验动物肾脏表现为体积增大伴大量囊肿形成，证明敲除PKD1基因可成功模拟ADPKD患者肾脏。2020年Kuraoka等[32]将CRISPR/Cas系统应用于人诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cell,iPSC）。研究者敲除人iPSC细胞中的PKD1基因，并诱导细胞向肾单位前体细胞和输尿管芽分化，同样成功地构建了ADPKD模型。上述模型为阐明ADPKD的发病机制，探索有效的治疗策略，奠定了良好的基础。

2.2.2 法布里病 法布里病又称Anderson-Fabry病，最早由两位皮肤科医生William Anderson和Johannes Fabry报道，由此得名，是一种罕见的X伴性遗传的溶酶体贮积病，由编码α-半乳糖苷酶A（α-galactosidase A,α-Gal A）基因（GLA）突变引起[33]。α-Gal A 能够催化球形三酰神经酰胺（globotriaosylceramide,Gb3）部分水解，因此，α-Gal A的不足会导致血浆中Gb3和其他鞘糖脂水平升高，并在各种器官组织的细胞内积累，引起一系列脏器病变[34]。2016年Pereira等[35]将CRISPR/Cas系统应用于人永生化足细胞，GLA敲除细胞如预期表现出法布里病生化表型，α-Gal A活性降低，Gb3水平升高，成功构建了靶向GLA的人永生化足细胞法布里病模型。该模型为检验法布里病发病机制假说提供了有力的工具。

2.3 CRISPR/Cas系统在异种肾移植中的应用 肾移植是目前治疗终末期肾脏病最有效的方法。与维持性血液透析相比，肾移植可显著提高患者的生活质量，降低死亡率[36]。尽管医学取得了较大的进步，人们对器官捐献和移植的认识也有所提高，但供求之间的差距仍在继续扩大。据估计，在美国有超过10万名患者在等待肾移植[37]。异种移植为缓解人体器官捐赠长期短缺的问题提供了可能性。猪肾目前被认为是临床移植理想的供体器官来源。这在很大程度上是因为猪肾在大小、结构、肾小球滤过率、内源性肌酐清除率等主要生理指标上与人肾相似[38-39]。然而异种肾移植仍然面临着一些难题，由于猪的体内存在内源性逆转录病毒（porcine endogenous retroviruses,PERVs），移植动物的器官后可能引发人类出现新的疾病。2015年Yang等[40]利用CRISPR/Cas系统将猪的PERV基因彻底破坏，证明了猪肾用于肾脏异种移植的可能。此外，与人体器官相比，异种器官的移植后免疫排斥反应更严重。为了解决这个难题，2018年Adams等[41]利用CRISPR/Cas技术敲除猪细胞分别负责α-半乳糖残基（α-galactosyl residues,α-Gal）和Sda这两种异种抗原生成酶相关的基因GGTA1和B4GALNT2，从而克服了超急性排斥反应。研究者通过以野生型猪外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells,PBMCs）为对照，对GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs进行表型分析，发现GGTA1/B4GALNT2基因敲除的PBMCs完全不含α-Gal和Sda两种抗原，而对照组的两种抗原均呈强阳性，说明不存在脱靶效应。不久前，美国纽约大学成功实施了全球首例转基因猪肾移植人体手术，且未立即出现排斥反应，为解决移植器官短缺问题带来曙光[42]。

3 展望

本文介绍了CRISPR/Cas系统的发现、基本原理、分类及其在肾脏疾病研究中的应用。最近开发的CRISPR/Cas系统能够有效地在各种生物体和细胞类型中精确修改基因组，现已成为研究包括肾脏在内许多系统疾病的有力工具。虽然CRISPR/Cas系统具有操作简单、效率高、特异性强、应用多样等诸多优点，但仍存在一些缺陷，如递送效率低、脱靶效应等。如何恰当地将CRISPR传递到特定器官以纠正突变，以及如何从基因上设计包含适合移植的人体器官的嵌合体需要进一步探讨。未来的肾脏疾病研究应基于强有力的临床前数据，将这种强大的技术安全有效地应用于确定补充或改进现有疗法的有效策略。笔者相信技术进步和新应用的快速发展无疑会使CRIPSR/Cas系统成为未来肾脏疾病研究的重要组成部分。