糖料作物启动子研究进展

孟帅辰，王希，陈丽

（1.黑龙江大学现代农业与生态环境学院/中国农业科学院甜菜研究所，哈尔滨 150080；2.黑龙江省普通高等学校甜菜遗传育种重点实验室/黑龙江省甜菜工程技术研究中心，哈尔滨 150080；3.国家糖料改良中心/中国农业科学院北方糖料作物资源与利用重点开放实验室，哈尔滨 150080）

0 引言

基因启动子（Promoter）位于基因编码区的上游，负责RNA 聚合酶的识别、结合和起始转录[1]。启动子及其启动子元件是转录水平上基因表达的主要调控因子，启动子需要与转录因子相结合来控制和开启下游基因的表达。另外，启动子是基因工程表达载体的重要元件，对外源基因表达水平影响较大[2]，因此，掌握启动子结构与功能对基因工程也大有助益。目前启动子克隆及分析已涉及到许多作物，如花生、玉米、水稻、棉花、大豆等[3-7]。糖料作物的分子生物学研究虽然起步较晚，但近年来在启动子克隆与分析研究方面也取得了一定进展。通过启动子的克隆和分析，将对糖料作物基因中具有重要作用的功能元件和调控区域进行精准定位，对研究糖料作物的生理适应、遗传改良、外源基因高效表达等方面均具有重要意义；此外，随着糖料作物基因工程工作的进步，对启动子种类、结构、功能的需求增长也将是必然趋势。因此，本文综述了糖料作物中启动子研究的进展情况，以期为糖料作物相关研究提供信息。

1 甘蔗的启动子研究

甘蔗是世界上最重要的糖料作物。此外，甘蔗可作为能源乙醇的原料，为缓解能源问题提供实际帮助。甘蔗属于无性繁殖作物，分蘖茎的生长情况会对甘蔗出苗率和下种量有重要影响，因此挖掘分蘖和腋芽生长的优异基因就显得尤为重要。李旭娟等[8]从甘蔗中克隆到了调控分蘖发育MOC1的同源基因ScMOC1，为了后续能够高效驱动目的基因表达和功能研究，利用巢式PCR 技术克隆到甘蔗ScMOC1基因起始密码子上游1 874 bp 的启动子序列，通过在线分析软件PlantCARE 对该序列分析，结果表明序列中含有TATA-box、CAAT-box、ARE、ABRE、ERE 等重要的顺式调控元件，瞬时表达分析表明该序列可驱动GUS基因在甘蔗叶中表达。分蘖基因对甘蔗分蘖形成起着重要作用，利用好启动子序列对研究遗传育种具有重要意义。相对于模式植物，甘蔗分蘖基因的挖掘和启动子序列的研究较滞后，是目前乃至今后重点的研究方向。

甘蔗糖分代谢相关基因的挖掘和启动子克隆，一直是研究者重点研究的内容。糖分代谢过程较为复杂，其中受蔗糖磷酸合成酶（SPS）、蔗糖合成酶（SS）、可溶性中性或碱性转化酶（ANI）及可溶性酸性转化酶（SAI）等多种酶的调控[9-11]。这些都是参与蔗糖合成、代谢及转运等功能的关键酶，现有研究发现，这些酶除参与蔗糖积累，还与胁迫应答有一定关系，受到不同因素的调控。周平等[12]从甘蔗品种‘FN95-1702’中克隆了SPSⅢ基因的5'侧翼启动子序列，通过基因枪微弹轰击甘蔗愈伤组织观察瞬时表达，证实该序列具有启动子活性。曹辉庆等[13]从甘蔗品种‘新台糖22 号’中克隆了SPSB基因的5'侧翼启动子序列，其序列长度为4 399 bp并具有逆境应答等特性。雷美华等[14]从甘蔗品种‘FN95-1702’中克隆到蔗糖合成酶基因（SS）1.9 kb的上游启动子序列，在线数据库分析表明该序列含有TATA-box 以及糖诱导SURE 元件。牛俊奇等[15-17]从甘蔗品种‘GT28’中克隆到SoSAI1、SoNIN1及SoCIN1基因上游的启动子序列；启动子序列长度分别为417 bp、1 174 bp 及792 bp；软件分析3 个基因的启动子序列，除具有真核生物启动子特定结构TATA-box 和CAAT-box外，SoSAI1还含有胚乳特异表达顺式作用元件（Skn-1_motif）和参与干旱诱导的MYB结合位点，进一步研究表明该基因应对环境胁迫发挥作用。

近年来全球气候多变，甘蔗在生长过程中常受到干旱、低温以及过量光等非生物胁迫因子的影响，甘蔗胁迫响应的分子机制研究也包含了一些与启动子克隆有关的研究。逆境相关蛋白[18]（Stress-associated protein,SAP）基因家族中具有参与植物逆境应答和提高转基因植物抗逆性的重要基因。李晓君等[19]分离获得SAP 基因家族成员ShSAP1基因的1 243 bp 启动子序列；生物信息学分析表明，该序列具有启动子的特征元件，还包含干旱胁迫的相关应答元件及组织特异性相关元件；说明ShSAP1启动子具有逆境应答特性，为后续验证活性和功能提供帮助。PRABU等[20]克隆到逆境转录因子MYB基因ScMYBAS1的5'侧翼启动子序列；通过启动子缺失实验分析，证明该启动子受冻害、高温和干旱诱导，可见ScMYBAS1表达调控的复杂性。KHARTE 等[21]分离了甘蔗MYB 转录因子基因PEaMYBAS1启动子序列，揭示了其转录水平的胁迫耐受机制；启动子缺失分析显示，缺失片段F0（-1032 bp）在非生物胁迫条件下，外源基因PEaMYBAS1启动子转录起始位点上游可诱导GUS基因高表达。GAO 等[22]分离到甘蔗杆状病毒启动子（SCBV21）在甘蔗茎维管束和贮藏薄壁组织中进行基因表达。ISKANDAR等[23]和KHAN等[24]分别证实甘蔗Pr-1DHNSo和OsC3H52启动子受干旱胁迫诱导，基因表达量随干旱胁迫时间的延长而增加。目前，甘蔗中有许多与逆境胁迫相关的关键调控酶基因已相继被克隆出来，例如甘蔗独脚金内酯生物合成基因（ScCCD8）、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因（SsCIPK23）、甘蔗ABA 生物合成关键酶基因（SoNCED）等[25-28]，但关于这些基因的启动子克隆研究仍然较少，后续研究应适当以这方面内容为重点。

2 甜菜的启动子研究

甜菜是一种重要的制糖作物。目前，甜菜启动子克隆的报道较少，仅有少部分学者对其进行了研究。THURAU 等[29]为了研究抗线虫基因Hs1pro-1在细胞水平上的转录调控，从Hs1pro-1基因的YAC-DNA 中分离出3 082 bp 的Hs1pro-1启动子片段，并与β-葡萄糖醛酸酶报告基因（1832prm1::GUS）融合，分别转化为感病甜菜根和拟南芥植株；对携带1832prm1::GUS 构建体的转基因甜菜根和拟南芥植株进行荧光与组织化学GUS分析，结果表明，Hs1pro-1启动子在这两种植物中都有功能，并驱动线虫反应和摄食位点特异性GUS表达；为了阐明Hs1pro-1启动子的调控区域，构建了Hs1pro-1启动子和GUS基因5'缺失的融合基因，并对转基因甜菜根进行分析；负责摄食位点特异性基因表达的顺式作用元件位于Hs1pro-1转录起始位点的-355～+247，而增强子区域位于启动子的-1 199～-705。在甜菜和拟南芥中，Hs1pro-1启动子驱动线虫取食位点特异性GUS表达，表明Hs1pro-1在这两个物种中表达的调节机制是保守的。双生病毒最近已成为世界热带和亚热带地区快速发展的植物病原体，其启动子中的许多转录增强元件位于病毒基因组的编码和非编码区域，甚至位于基因的重叠区域，使病毒的基因组最小化，它们为研究植物中的DNA 复制、转录和基因表达提供了一个良好的模型系统。对甜菜曲顶病毒（BCTV）、甜菜曲顶伊朗病毒、菠菜严重卷曲顶病毒、胡椒黄矮病毒（PeYDV）、萝卜曲顶病毒和小麦矮化曲顶病毒对双向启动子系列分析表明，BCTVs 菌株的宿主范围最广，BCTV 有47 个转录因子结合位点（TFBS），而PeYDV 具有26 个TFBS，在病毒体正义链启动子和病毒体反义链启动子中分别具有最大和最小的TFBS数量。在上述病毒中，病毒体反义链启动子比正义链启动子具有更多的转录因子[30]。

OLTMANNS 等[31]从甜菜中克隆了Tlp、His1-r及Mll基因的启动子，并将其转化到甜菜和烟草中。在转基因甜菜植株中报告基因的表达分析表明，3 种启动子都在贮藏根中具有活性；Mll基因在甜菜的不同发育阶段具有高度的器官特异性；在烟草中，Tlp和Mll启动子优先驱动报告基因在下胚轴和根中表达；Mll启动子的特性可能有利于改变贮藏根的蔗糖代谢；研究还发现，常用的β-葡萄糖苷酸酶报告基因并不适用于甜菜，因为甜菜主根中的酚类化合物会抑制该酶，而荧光素酶基因（LUC）更适合。梁文洁等[32]将克隆到的甜菜Mll启动子与洋葱SST基因重组，实验结果表明，SST基因可以提高甜菜的抗旱性。

兰雪[33]以甜菜基因组为模板，PCR技术扩增出甜菜BvCPD基因启动子区域3个5'端缺失片段，利用烟草GUS 瞬时表达体系分析表明3 个启动子片段均具有启动活性；进一步研究发现，转基因拟南芥在干旱、低温和避光环境下启动子片段驱动的GUS 表达量相比于未处理组均有不同程度的变化，表明BvCPD启动子受干旱、低温和光照诱导调控。于志海[34]从红柄甜菜叶中克隆到BvcTYR基因5'上游1 670 bp启动子序列，预测结果显示在3'端含有转录起始位点（TSS）、TATA-box、CAAT-box 等调控元件，瞬时表达分析表明该序列可驱动GUS基因在拟南芥的根和叶柄中表达。白璐[35]采用LA-PCR方法克隆到甜菜谷氨酰胺合成酶基因5'上游828 bp启动子片段，通过软件TSSP分析启动子序列，结果表明该序列含有TATA-box、CAAT-box以及干旱诱导表达有关的顺式作用元件，为后续了解甜菜谷氨酰胺合成酶基因的表达调控及构建表达载体提供了依据。马冰雪等[36]克隆到甜菜色素合成关键基因UGT和TYR的启动子序列，序列分析表明，2 个基因均含有特征元件TATA-box 和CAAT-box 及光响应元件ACE 和G-Box，推测甜菜UGT、TYR基因的表达对光照较为敏感。王玉婷[37]利用在线分析数据库PlantCARE预测甜菜BvM14-MADSbox基因启动子区域，推测出该启动子为诱导型启动子，可通过促进剂诱导基因表达。

3 甜叶菊的启动子研究

甜叶菊又称甜菊，其叶片中富含的天然甜菊糖苷（Steviol glycosides，SGs）是蔗糖甜度的300 倍[38]。目前在甜菊叶中已鉴定出30种糖苷组分，其中甜菊苷（Stevioside，STV）和瑞鲍迪苷（Rebaudioside A，R-A）为主要成分，占总甜菊糖苷的75%～95%[39]。因此，挖掘甜菊糖苷组分生物积累的相关基因以及研究基因的表达调控，是提高甜菊糖苷含量和品质的关键。杨永恒等[40]发现甜菊葡萄糖苷转移酶基因（SrUGT76G1）是STV 苷和R-A 苷合成的关键基因；为了进一步研究该基因在甜菊中的调控表达模式，采用染色体步移的方法克隆到SrUGT76G1基因上游长度为2 283 bp启动子序列，经在线分析工具PlantCARE对启动子序列进行分析，结果显示该序列具有475 个顺式调控元件，除了含有TATA-box、CAAT-box 等典型保守元件外，还包含干旱、低温等环境因子响应元件，赤霉素等植物激素响应元件，芽、胚乳等组织特异性表达元件；为了验证启动子活性，构建表达载体在甜菊幼苗和拟南芥中进行瞬时表达，结果表明启动子具有活性，但很多顺式元件的功能对SrUGT76G1基因表达调控作用还需进一步深入研究。

ZHANG 等[41-42]采用TAIL-PCR 方法分离到SrUGT76G1基因上游2 050 bp 的启动子序列，序列分析显示存在多个W-box 顺式元件，它们是WRKY 转录因子的识别基序。SrWRKY71 具有典型的WRKY 结构域和一个C2H2 锌指样基序，利用酵母单杂交实验证实SrWRKY71 转录因子直接与甜叶菊SrUGT76G1基因近端启动子区W-box1 和W-box2 结合；此外，SrWRKY71 抑制了SrUGT76G1在烟叶和甜叶菊愈伤组织中的表达水平。鉴定出SrUGT76G1基因的转录因子SrWRKY71为甜菊糖苷生物合成调控网络提供了新的途径。

4 甜高粱的启动子研究

甜高粱是一种高含糖量、高产的作物，目前关于甜高粱启动子研究文献较少。植物WRKY 转录因子家族通过结合下游靶基因启动子区的W-box来调节其生理生化反应参与逆境的响应，甜高粱SbWRKY50基因可直接与其SOS1、HKT1基因和拟南芥的SOS1基因的上游启动子结合，通过调控离子平衡参与其抗盐反应[43-44]。脯氨酸是植物遭受非生物胁迫时积累的一种渗透物质[45]，有助于提高植物的抗逆能力。SU 等[46]在甜高粱中分离到两个脯氨酸合成调节酶基因（SbP5CS1、SbP5CS2）；为了进一步了解基因表达情况，利用染色体步移技术克隆到两个基因起始密码子上游长度为2 000 bp的启动子序列；生物信息学分析后，两个序列不仅包含TATA-box、CAAT-box等典型保守元件，还包含干旱、寒冷、脱落酸响应元件（ABRE）、茉莉酸甲酯响应元件（MEJA）及胁迫诱导转录因子结合位点MYCCONSENSUSAT、WRKY 和MYBCORE；进一步研究发现在干旱和高盐胁迫下两个基因的转录水平存在差异，SbP5CS1基因可以更好地提高甜高粱的抗逆能力。

铝（AI）是植物生长过程中非必需的营养元素。植物根尖胼胝质的形成是响应铝胁迫的敏感现象，同时也是评价植物AI毒害和耐AI性的有效生理指标[47]。已有研究表明，甜高粱根尖胼胝质的降解会受到β-1,3-葡聚糖酶基因的调控，而β-1,3-葡聚糖酶基因具有提高植物的防御作用。张慧[48]将甜高粱耐铝和铝敏感品系的β-1,3-葡聚糖酶基因SbGLU1在拟南芥中异源表达，结果显示拟南芥β-1,3-葡聚糖酶活性增强，铝在根尖上胼胝质的沉积减弱，从而提高拟南芥的耐铝性；PCR 克隆到SbGLU1基因2 kb 的启动子序列，启动子序列分析表明，两个品种启动子核心元件TATA-box相差13 个，而增强子元件CAAT-box相差3 个，导致两个品种间SbGLU1基因的转录水平存在表达差异，为后续深入揭示AI诱导甜高粱根尖胼胝质积累机制提供基础。闫思奇[49]研究发现甜高粱转录因子SbSTOP1 可能通过结合基因SbGlu1启动子与其2 段20 bp 的DNA 序列相互作用，调控SbGlu1的表达，促进β-1,3-葡聚糖酶催化胼胝质降解，从而提高其对Al的耐受性。

5 总结与展望

目前国内糖料作物主要以传统PCR 为基础技术克隆启动子和cDNA 全长，但存在扩增结果易产生非特异性产物的缺点，且其过程过于依赖内切酶的选择，相较于国外在SOE-PCR、COLD-PCR、FPNI-PCR等新型PCR 技术的应用上还存在较大差距，尤其是糖料作物还未发现有相关报道，因此克隆技术还有待于继续进步。启动子功能方面，研究方法主要是利用DNA 和蛋白质相互作用的特性进行分析，而分析系统经常出现灵敏度不高、特异性调控元件失活等问题，因此，分析系统的设计与优化制约着研究的效率与准确性，通过预备性试验建立特定作物或特定元件的分析系统的工作也值得重视；此外，使用某些新技术如离子共振[50]（SPR）也有利于提高启动子和蛋白质相互作用的检测效果，从而进一步了解启动子的结构与功能，但在糖料作物启动子的研究中知之甚少。相信在今后的研究中还会看到更多的技术应用在不同领域，更多技术参数、技术体系得到优化，能够提供更多启动子研究的新途径。

在研究对象方面，糖料作物启动子克隆的研究整体尚处于初步阶段，仅有甘蔗在这方面报道较多，主要研究多集中于分蘖、糖分代谢及非生物胁迫等方面，但相较于模式植物，在抗病性、发育调节及开发组织特异性启动子等方面还不够深入。甜菜、甜叶菊和甜高粱现有研究主要包括抗病性、糖分积累及非生物逆境方面，但研究还比较分散，尚未能系统地分析启动子功能、表达效率及调控能力等方面，如针对启动子的瞬时表达-转录活性分析、GUS-活性分析、启动子缺失体克隆分析等重要后续分析均显不足。与模式植物相比，糖料作物基因资源缺乏，导致捕捉序列信息困难，基因启动子克隆耗时长、操作繁琐，这些因素从客观上限制了糖料作物启动子研究的进步。此外，比较了国内外基因研究策略发现，国内尚处于个别基因的序列获取和功能分析上，而国外更加侧重于基因的分子机制和调控机制的研究，因此国内的启动子研究尚缺乏必要的起始材料和信息。

植物生物技术领域的研究通常关注两个方面：序列信息与调控机制。序列信息的丰富与调控机制的明确，是互相制约、互相依赖的两个研究方向。对于启动子研究而言，其克隆与结构分析对序列信息的依赖性更强，同时其功能分析也需要更多的信号转导、转录因子功能等信息作为支撑；另一方面，启动子功能的明确又将为各种分子机制研究提供至关重要的信息。因此，糖料启动子研究一方面需要数量更多、质量更高、信息更全面的序列信息，一方面需要与各种性状、生理过程、信号转导过程协同研究，以取得更大、更有意义的进展。如今，随着分子生物学的快速发展，测序技术的快速进步与成本的不断下降，基因克隆技术和启动子分析方法不断创新，相信将会有更多糖料作物基因和启动子序列得到深入研究，并由此为基因调控机制、启动子内部功能元件的调控网络、相关基因的信号转导过程等方面的研究提供更多的分子理论参考。