种子低温保存应答机制研究进展※

●王 晨 王 盼 赵 越 曹 焜 王晓楠※※ 孙宇峰, ※※

（1.黑龙江八一农垦大学 黑龙江 大庆 163319；2.黑龙江省科学院大庆分院 黑龙江 大庆 163319）

1 概况

种质资源是农业科技原始创新和现代种业发展的物质基础，也是维持生物多样性的重要资源之一[1]。应用安全合理的方法，做好种质资源保护和利用有利于农业可持续发展。在众多种质资源保存方法中，低温保存技术应用由来已久，因其具有不受气候、环境等外界因素影响，有效延长保存期限等优势而得到了广泛应用，实现了作物生命的延续。近年来，种子低温保存技术受到越来越多研究者的关注，本文主要从种子低温保存方法、生理调控及应答、分子生物学研究等方面对近年的研究情况进行综述。

2 种子低温保存方法及条件

全世界拥有的作物种质资源中，有96%以上是以种子形式保存[2]，但不同植物种子的保存方法各不相同，种子保存温度、时间、含水量都对其利用率及寿命具有一定影响，因此选择适宜的贮存方法是非常重要的，具体还需要根据植物以及种子的特性进行选择。如花榈木种子采用沙藏方法最佳，胡杨种子则用超干保存的方法可以有效提高种子的抗老化能力，九里香种子、黑麦种子则是在低温保存条件下可减缓种子的退化[3-6]。目前，在种子保存方面，低温保存技术是最重要的常用手段之一。

2.1 保存时间和含水量影响

低温条件下，保存时间和含水量将影响种子的活性。在超低温（-196℃）保存条件下，保存时间365 d，益智种子的发芽率随冷冻时间延长呈先下降后上升再下降最后趋于平稳[7]。玉米、小麦、大豆、水稻种子在0℃保存条件下，1～7年发芽率降低缓慢，9年时发芽率显著降低[8]。

种子低温保存前，需要进行干燥处理，以使种子含水量达到理想保存状态，否则形成冰晶刺破细胞膜会对种子内部细胞结构造成不可逆的伤害。通常采用的降低含水量方法有自然干燥、干燥剂干燥及微波干燥等，实验室常采用硅胶干燥法，避免种子在低温条件下受到损伤。胡杨种子含水量为4.30% 时种子活力最高[9]。马尾松种子含水量为6.1%时细胞抗氧化能力强，细胞代谢旺盛[10]。毛竹种子自然干燥后在4℃条件下保存最适含水量为7.45%且一年为最佳保存期[11]。油松和板栗种子则采用硅胶干燥法，适宜含水量分别为3.34%和34.12%，超氧化物歧化酶（SOD）活性、可溶性糖含量随着种子含水量的下降均呈先上升后下降趋势[12]。采用微波干燥法对小麦种子进行干燥，在800W干燥功率下可实现对其快速干燥，又能保证干燥后种子的发芽率[13]。

2.2 保存温度影响

许多研究者选取不同的温度梯度来分析种子活力，如对于芍药种子来说，-40℃低温处理30 d后可以有效打破该种子下胚轴休眠，贮藏一年的芍药种子生根效果最好[14]。枫香种子在含水量10.54%时，贮藏时间控制在360 d以内的室温条件下即可保持种子活力；贮藏730 d，在4℃、-20℃和-70℃低温条件下方可有效保持种子活力[15]。药用植物灯盏花种子在湿度15%和温度4℃和-20℃条件下贮藏，种子萌发率在80%以上[16]。超低温保存通常在-196℃的液氮中进行，在此条件下种子的物质代谢和生长活动几乎完全停止，但细胞活力仍保存，可达到长期保存的目的，是稳定保存种质资源最理想的方法。如肉豆蔻种子[17]、降香种子[18]在超低温保存条件下，其各项生理指标表明不影响种子活性，是安全可靠的。

3 种子低温条件下的生理调控及应答

国内外相关研究表明，低温条件下种子会启动一系列生理物质及相关酶类进行低温生理应答反应，脱氢酶、α-淀粉酶、超氧化物歧化酶、过氧化物酶等活性直接反映了种子生理应答状态。

3.1 代谢相关酶

植物种子萌发时需要大量能量维持生命代谢活动，淀粉是植物体储存能量的物质之一，α-淀粉酶可分解淀粉，为种子萌发提供能量。脱氢酶是植物种子重要的保护酶，其活性大小关系着种子生命活动强弱。陈红等[19]以贵州酥李种子为材料，发现低温条件下脱氢酶、α-淀粉酶活性降低，丙二醛（MDA）含量增加。刘禹辰等[20]研究指出低温胁迫下玉米种子中淀粉分解酶活性随萌发天数增加逐渐提升但未达到最适酶活性。益智种子作为我国四大“南药”之一，在超低温保存条件下，随保存时间延长α-淀粉酶活性呈波动性下降上升趋势，脱氢酶活性则持续下降[7]。油松种子经超低温贮藏后脱氢酶活性变化较大[21]。因此，种子在低温条件下保存改变了其催化氧化还原酶的能力，并通过α-淀粉酶分解淀粉为生命活动提供能量。

3.2 脯氨酸及膜脂过氧化

对于耐低温的花生种子，经4℃处理后，可溶性糖和游离脯氨酸含量大幅上升[22]。当生菜种子受到低温胁迫时，游离脯氨酸含量也会发生显著提高[23]。一方面由于脯氨酸亲水能力强具有降低冰点的作用，另一方面脯氨酸可以增加细胞内溶质量，防止细胞过度失水，从而达到降低低温损伤、增强抗寒能力作用。丙二醛（MDA）是细胞膜脂过氧化的主要产物，其含量直接反映膜脂被过氧化而受损害的程度。蓖麻种子在15℃胁迫下萌发受到阻碍，可溶性糖和可溶性蛋白含量显著低于对照，而MDA含量显著高于对照[24]。红豆草种子经60 d超低温保存后，可溶性糖含量变化差异极显著，丙二醛含量增加[25]。综上可知，低温环境可促进种子可溶性糖的积累，提高细胞的抗逆性，而脯氨酸含量的降低及丙二醛含量的增加，反映其对种子抗寒及低温适应方面的调控作用。

3.3 抗氧化活性酶

超氧化物歧化酶 （SOD）具有特殊的生理活性，是植物体内一种很重要的参与氧代谢的酶，其活性高低是表征生物体衰老、死亡和抗逆性的直观指标。蔡文燕等[26]研究发现马拉巴栗种子在5℃、10℃、15℃温度下随着贮藏时间的延长，种子发芽率表现出不同程度的下降，SOD活性及MDA 含量升高，综合分析发芽率和抗氧化酶变化得出，15℃为适宜的短期贮藏温度。过氧化物酶 （POD），是普遍存在于植物体内的一种保护酶，能将H2O2分解为O2和H2O，使机体免受H2O2的毒害作用，其活性随着植物生长发育进程以及环境条件的改变而变化。低温胁迫使萌发期陆地棉种子种胚内SOD、POD和CAT（过氧化氢酶）活性先上升后下降，但能够在短时间内恢复至接近对照水平或超过对照[27]。4种耐低温棉花品种种子过氧化物酶活性随胁迫时间延长而不断上升[28]。Dragana Jakovljević等[29]研究在冷、热胁迫下对罗勒叶和根生理生化的影响，在低温条件下SOD、CAT、A-POX（抗坏血酸盐过氧化物酶）和P-POX（焦棓酸过氧化物酶）活性相对于热胁迫更显著。由此可知，抗氧化活性酶活性在种子低温保存及萌发过程中大部分呈现上升趋势，保持体内活性氧的平衡，减缓衰老。

4 分子生物学研究

随着现代分析技术的不断发展和数据处理方法的不断完善与创新，不同分子生物学技术已被广泛应用于植物响应逆境胁迫的相关研究中。

在植物生长发育过程中，温度的高低直接影响种子生命活力，适宜的温度有利于种子贮藏和后期的生长发育。张迪等[30]发现，不同干燥温度（自然干燥、39℃干燥和65℃干燥 ）对苜蓿种子进行代谢组的检测显示，65℃干燥相对自然干燥对种子嘌呤代谢途径影响最大，有10个代谢物变化明显，有腺苷、磷酸腺苷、3'-磷酸腺苷、2'，3'环磷酸腺苷等，从而引起核苷酸代谢变化影响种子活力。部分研究表明，目前响应低温胁迫相关的代谢物主要为糖类、氨基酸、有机酸、硫代谢物和三羧酸循环中间代谢物[31]。解丽霞[32]分析水稻种子在低温条件（15℃）下萌发应答情况，鉴定了2273个代谢物QTL，发现调控种子活力的主效QTL qSV-5c与调控葡萄糖、果糖、蜜二糖、蜜三糖的QTL共定位，表明低温条件下糖代谢可能参与表达。周茜[33]对独行菜种子在4℃条件下萌发并进行转录组（RNA-Seq）测序及分析，发现差异基因主要富集在转录调控、核糖代谢及合成和植物激素信号转导等相关过程。

大豆种子在低温条件下（10℃/H2O）下通过LC/nanoESI-MS鉴定出59种蛋白质，揭示了9种参与植物防御的蛋白质如乙醇脱氢酶、超氧化物歧化酶、甜菜碱醛脱氢酶和抗坏血酸过氧化物、10种参与碳水化合物代谢各种轨迹的蛋白质如半胱氨酸蛋白酶等[34]。王文军[35]研究结果显示，与大豆冷害胁迫相关的蛋白主要涉及细胞的生长与分裂、疾病与防御、蛋白质定位与贮藏，而核苷二磷酸激酶、Os12g0160400转录蛋白仅被冷胁迫诱导且只和冷胁迫相关，不受渗透胁迫的影响。棉花种子在-80℃处理下共鉴定7535个差异表达基因（DEG），发现参与能量代谢途径的DEG显著富集，耐受基因型KN27-3中IAA（吲哚乙酸）、CTK（细胞分裂素）和GA（赤霉素）水平升高和ABA（脱落酸）水平的降低，推测其影响了能量代谢并发挥维持氮、碳平衡作用，另外参与甘露糖、海藻糖和棉子糖生物合成的基因可能对低温胁迫提供有效的保护[36]。对在低温库（-18℃）保存10年的小麦种子进行蛋白质组学分析，如LEA-蛋白、谷胱甘肽转移酶、乙醛脱氢酶的表达变化对防御氧化损伤和维持脂质贮藏等以延长种子寿命具有一定功能[37]。分子生物学研究在种子低温储藏方面的研究处于初步探索阶段，大量耐低温基因及调控机制仍需挖掘。通过组学分析，可以揭示种子在低温贮存下启动的响应途径及和低温相关重要物质的表达，为今后选育耐低温品种奠定基础。

5 总结

种质资源作为植物生命的延续，隐藏着各种潜在的可利用基因，不断探索安全合理保存方法有利于保持作物遗传物质完整性。低温保存技术，在国内外无论从生理调控应答还是分子调控机制等方面都得到了可靠验证。探索作物种子在低温条件下保存的生理、分子等调控机制，进而为深入探索种质资源低温保存研究提供技术理论支持，是种质资源研究方向的重要议题。