2株海豚链球菌的分离鉴定及药敏特性分析

张凤贤

(河北省水产技术推广总站，河北 石家庄 050035)

鲟鱼属于硬骨鱼纲、硬鳞总目、鲟形目，具有个体大、生长快、适应性强等优点[1]，其肉厚骨软，味道鲜美，肉和卵的蛋白质含量高，是高级营养品，具有极高的经济价值。当前鲟鱼养殖产业得到迅速发展，养殖规模不断扩大，在养殖规模和产量不断扩大的同时，养殖环境也发生了巨大变化，高密度养殖、水体恶化，细菌病不断发生，直接影响鲟鱼养殖的发展。根据报道和文献研究，目前，鲟鱼细菌病的主要致病菌有：金黄杆菌(Chryseobacteriumsp.)[2]、停乳链球菌(Streptococcusdysgalactiae)[3]、海豚链球菌(Streptococcusiniae)[4-5]、迟钝爱德华氏菌[6]、嗜水气单胞菌(Aeromonashydrophila)[7]、荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)[8]、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)[9]等。

海豚链球菌(Streptococcusiniae)属于芽孢杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，链球菌属，具有感染宿主广、传染性强、死亡率高等特点，为球形或卵圆形，直径0.2～0.8 μm，为革兰氏阳性菌，在水体中普遍存在，是人鱼共患病原菌。在20世纪70年代海豚链球菌开始被人们认知，20世纪90年代链球菌属细菌对鱼类疾病的感染危害加重，成为全球重要的鱼类病原菌，易感染的鱼类有：鲟鱼、虹鳟、罗非鱼、黄鳍鲷、黄颡鱼、鲳鲹等，且从当年鱼种至成鱼均受害，海豚链球菌感染流行于夏季，死亡率高[10]。

2020年河北省鲟鱼养殖面积约113 hm2，年产量约6 900多吨，且大规模养殖主要集中在石家庄、邯郸和保定地区[11]。近几年，石家庄地区鲟鱼海豚链球菌感染屡有发生，所以对海豚链球菌感染及海豚链球菌药物敏感特性研究对于该地区实际生产中海豚链球菌感染鲟鱼的防治具有非常重要的意义。

本文结合国务院兽医主管部门批准的水产养殖用兽药，采用微量肉汤法对分离获得的病原菌菌株进行药敏试验，筛选出敏感抗生素，用于实际水产养殖中指导养殖户对鲟鱼海豚链球菌感染疾病合理使用抗生素治疗。

1 材料与方法

1.1 材料

脑心浸液(BHI)肉汤培养基、BHI营养琼脂培养基购自美国BD公司，细菌生化鉴定管及配套相关试剂购自青岛海博生物技术有限公司，药敏分析试剂板购自南京菲恩医疗科技有限公司，PCR相关试剂购自TakaRa公司。患病鲟鱼分别取自河北省石家庄市井陉县及平山县两个鲟鱼养殖场。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 2021年7月和8月，河北省石家庄市井陉县和平山县分别有一鲟鱼养殖场发生鲟鱼发病大量死亡的情况，发病鲟鱼临床症状主要表现为：嘴部发红发黑，肛门红肿，鳃盖及鳍条基部出血；解剖可见腹部出血、肝脾肿大。对2个养殖场分别选取具有典型发病症状的鲟鱼，无菌条件下解剖，无菌接种环取其肝脏、脾脏、肾脏组织，分别划线于BHI固体培养基进行病原菌的分离培养，25 ℃，培养72 h，选取优势菌落，纯化培养3次，各获得1株纯化菌株，并分别命名为JX-1和PS-3。将纯化菌株JX-1和PS-3分别挑取单菌落于BHI液体培养基中，25 ℃，振荡培养24～48 h，保存甘油菌(25%甘油浓度)于-80 ℃冰箱中备用。

1.2.2 病原菌的形态和生理生化特性鉴定试验 观察菌株JX-1和PS-3在BHI固体培养基上的菌体形态特征，并进行革兰氏染色，镜检观察；利用细菌生化鉴定管，根据鉴定管使用说明书对2菌株分别进行生理生化特性鉴定。

1.2.3 病原菌的16S rDNA序列分析 对菌株JX-1和PS-3进行基因组DNA提取，然后采用通用引物(27F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3，1492R: 5-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3)进行PCR扩增，获得16S rDNA序列产物，PCR产物送派诺森生物科技有限公司进行基因测序，测序结果与NCBI Blast数据库中的序列进行比对分析，确定种属。

1.2.4 药敏试验 采用微量肉汤稀释法分别对菌株JX-1和PS-3进行药物敏感性试验，根据国务院兽医主管部门批准的水产养殖用兽药品种(恩诺沙星、硫酸新霉素、甲砜霉素、氟苯尼考、盐酸多西环素、氟甲喹、磺胺甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶)定制专用药敏分析试剂板，具体操作方法依照药敏分析试剂板使用说明书进行。当试剂板中阳性对照组细菌生长良好时，肉眼观察能够抑制细菌生长的最低药物浓度，作为该药物对受试菌的最小抑菌浓度(MIC)。

2 结果与分析

2.1 菌株JX-1和PS-3的形态和生理生化特性

菌株JX-1和PS-3在BHI固体培养基中生长乳白色、圆形、针尖大小的菌落，边缘整齐，表面光滑，不透明。经革兰氏染色为革兰氏阳性链球菌(见封三图1)。

菌株JX-1和PS-3的生理生化特性鉴定结果见表1。

由表1可知，菌株JX-1和PS-3可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖；不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚；不产生苯丙氨酸脱氨酶；有动力；可产生鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶；发酵不产生硫化氢；不产生尿素酶；不可以利用柠檬酸盐；MR、VP试验阴性。

根据《常见细菌系统鉴定手册》[12]，菌株JX-1和PS-3的形态特征和生理生化特性与海豚链球菌(Streptococcusiniae)高度相似。

2.2 菌株JX-1和PS-3的16S rDNA序列分析结果

根据测序结果，与NCBI Blast数据库中的序列比对分析，发现菌株JX-1和PS-3与海豚链球菌(Streptococcusiniae)的同源性均大于99.0%。

综合菌株JX-1和PS-3的形态特征、生理生化特性和16S rDNA序列分析结果，确定菌株JX-1和PS-3为海豚链球菌。

2.3 药敏试验结果

根据菌株JX-1和PS-3的药敏试验结果，获得各药物对2菌株的最小抑菌浓度MIC(见表2)。

表2 各药物对菌株PS-3和JX-1的MIC μg/mL

由表2最小抑菌浓度MIC可知，菌株JX-1对硫酸新霉素、甲砜霉素、盐酸多西环素、磺胺甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶高度敏感，对氟苯尼考中度敏感，对恩诺沙星、氟甲喹耐药；菌株PS-3对甲砜霉素、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶高度敏感，对硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，对恩诺沙星、氟甲喹耐药。根据表2数据可知，恩诺沙星对JX-1的MIC是16.00 μg/mL，对PS-3的MIC是8.00 μg/mL，2菌株对恩诺沙星均耐药；硫酸新霉素对JX-1的MIC≤0.125 μg/mL，对PS-3的MIC是1.00 μg/mL，JX-1对硫酸新霉素高度敏感，PS-3对硫酸新霉素中度敏感；2菌株对其他抗生素的敏感性差异不大。

3 讨论

海豚链球菌作为当前河北省石家庄地区鲟鱼主要感染链球菌种类，其特性研究和防治对鲟鱼类生产养殖工作非常重要。

本文通过对菌株JX-1和PS-3的生理生化特性研究，发现2菌株可分解利用甘露醇，不能分解利用肌醇、山梨醇、蜜二糖、核糖醇和棉子糖，不能分解蛋白胨中的色氨酸生成吲哚，不产生苯丙氨酸脱氨酶，有动力，可产生鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶，发酵不产生硫化氢，不产生尿素酶，不可以利用柠檬酸盐，MR、VP试验阴性。其他特性待进一步研究。

通过药敏试验结果发现，菌株JX-1对硫酸新霉素、甲砜霉素、盐酸多西环素、磺胺甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶高度敏感，对氟苯尼考中度敏感，对恩诺沙星、氟甲喹耐药；菌株PS-3对甲砜霉素、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶高度敏感，对硫酸新霉素、氟苯尼考中度敏感，对恩诺沙星、氟甲喹耐药。根据国务院兽医主管部门批准的水产养殖用兽药，进行药敏试验，试验结果可以更好地指导水产养殖中感染海豚链球菌的治疗，有效预防和控制滥用药和过量用药现象的发生。

由最小抑菌浓度可知，作为石家庄地区两个相邻区域获得的2株病原菌JX-1和PS-3对各抗生素的耐药性差异不大，JX-1对硫酸新霉素高度敏感，而PS-3对硫酸新霉素中度耐药，说明相邻地域的致病菌的耐药性差异不大。

4 结论

在石家庄市两相邻地区分离获得的2株海豚链球菌，对抗生素的药物敏感性差异较小，在水产养殖实际生产中，对于石家庄区域内鲟鱼海豚链球菌的感染，可以利用甲砜霉素、盐酸多西环素、磺胺间甲氧嘧啶钠、磺胺甲噁唑+甲氧苄啶等抗生素进行治疗，且感染早期用药效果更佳。