小分子干扰RNA抑制鼻黏膜上皮细胞血管紧张素转换酶2的表达

鲍羿岐，刘 洋，崔 娜，朱学伟

(吉林大学中日联谊医院 耳鼻咽喉头颈外科，吉林 长春130033)

血管紧张素转化酶2(ACE2)是一种人体内参与血压调节的蛋白，在肺、心脏、肾脏和肠道广泛存在，ACE2表达于人鼻黏膜上皮细胞(HNECs)以及下呼吸道黏膜上皮细胞[1]。能否通过小干扰RNA(siRNA)技术沉默ACE2在鼻黏膜上皮细胞的表达，进而降低人对呼吸道病毒的易感性是一个非常有意义的科学方向。目前，ACE2表达变化对平滑肌细胞血管紧张素Ⅱ1型受体(AT-1 receptor)蛋白表达、细胞外信号调节激酶1/2蛋白(ERK1/2)、信号转导和转录激活因子3(STAT3)蛋白磷酸化水平的影响已经有相关报道[2]。本研究拟通过构建siRNA沉默呼吸道病毒刺突糖蛋白受体ACE2重组质粒，进一步观察其对HNECs中ACE2的表达下调作用，以及其对p-ERK1/2、p-STAT3蛋白的磷酸化水平表达的影响，为以ACE2为靶点干预呼吸道病毒感染上呼吸道黏膜上皮奠定科学基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

人鼻黏膜上皮细胞株购自吉林省晨裕巴适得生物科技有限公司，呼吸道上皮培养基BEGM-F12为美国Lonza公司。小牛血清细胞培养液为Roche公司产品。RNA提取试剂盒为TRIzol reagent(美国Invitrogen)产品。逆转录试剂盒为SuperScript○RⅢ reverse transcriptase(美国Invitrogen)。兔抗人ACE2、ERK1/2、STAT3、p-ERK1/2、p-STAT3,GAPDH等蛋白抗体购自于英国Abcam公司。转染试剂为美国Invitrogen的脂质体2000(Lipofectamine 2000)。

1.2 方法

1.2.1构建si-ACE质粒及细胞培养 构建血管紧张素酶2的小干扰RNA(ACE2siRNA)重组质粒：根据ACE2基因序列设计靶点特异性的ACE2小干扰寡核苷酸,起始于1205位点，连接到经BamHⅠ-Hind Ⅲ 酶切线性化的pSlincer3.1/H1质粒上制备待转染的重组质粒。再将ACE2siRNA重组质粒与lipo2000脂质体混合均匀，孵育20 min。实验分为3组：空白组，脂质体组(仅加入lipo2000脂质体)及si-ACE2(将上述混合液转染人鼻黏膜上皮细胞，siACE2终浓度为500 ng/mL)。各组细胞培养72 h。

1.2.2RT-PCR检测各组HNECs中ACE2 mRNA的表达 将上述各组细胞培养72 h后，提取鼻黏膜上皮细胞的总RNA，取每组细胞总RNA500 ng用于逆转录。基因扩增的引物如下。内参造物采用GAPDH。RT-PCR扩增反应体系为20 μl，其中RNA模板2 μg加入引物及去离子水使最终体积为20 μl。RT-PCR循环条件如下：37℃，15 min，50℃，5 min，然后在98℃下5 min，最后保持在4℃。然后，然后将PCR产物稀释6倍并储存在-20℃的冰箱，进行琼脂糖凝胶电泳。引物:ACE2(Fw) 5’-CTCTACAGAAGCTGGACAGAAAC-3’,ACE2(Rev)5’-GAGCAGTGGCCTTACATTCA-3’,GAPDH(Fw) 5’-TGCACCACCAACTGCTTAGC-3’，GA-PDH(Rev) 5’-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3’。

1.2.3Western blot检测各组中ACE2及ERK1/2,STAT3,p-ERK1/2,p-STAT3蛋白表达情况 上述各组细胞培养72 h后，将细胞裂解，并提取细胞裂解液蛋白，进行聚丙烯凝胶电泳。加入兔抗人ACE2(1∶500)及兔抗人ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3(1∶1 000)，孵育过夜，洗脱，再加入二抗采用辣根过氧化物标记的鼠p-STAT3抗兔IgG(1：10000)。转膜，成像(美国Bio Spectrum-UVP凝胶成像系统)，结果灰度分析采用ImageJ软件进行。

1.3 统计学方法

采用SPSS 22.0软件进行数据的统计分析。计量资料以均数±标准差表示，计数资料用率表示。采用卡方检验比较各组间率的差异。两组均数间的比较采用t检验。相关性分析采用Pearson方法进行。所有的统计检验均采用双侧检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RT-PCR检测各组ACE2 mRNA的表达水平

各组细胞培养72 h后RT-PCR检测ACE2的mRNA表达水平发现，各组都有ACE2 mRNA的表达。但si-ACE2组细胞中的ACE2的mRNA水平明显低于空白对照组和脂质体组(P<0.05)，见图1。

图1 各组中ACE2的mRNA及蛋白的表达

2.2 Western blot 检测各组的ACE2蛋白表达及ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3、p-STAT3蛋白及磷酸化水平

各组细胞培养72 h后，行Western blot检测各组ACE2蛋白表达水平。检测各组的ERK1/2和STAT3蛋白表达及磷酸化水平，发现si-ACE组ERK1/2和STAT3蛋白都明显降低，p-ERK1/2、p-STAT3蛋白磷酸化水平却显著高于其他各组，结果具有统计学意义(P<0.05)，如表1及图2所示。

表1 各组鼻黏膜上皮细胞中ERK1/2、p-ERK1/2、STAT3及p-STAT3蛋白表达水平

图2 各组鼻黏膜上皮细胞中p-ERK1/2、p-STAT3蛋白表达水平

3 讨论

有研究通过电镜显示了病毒刺突糖蛋白受体结合结构域(RBD)与ACE2全长蛋白的复合物空间结构，揭示其可能互为受体[3]。ACE2是肾素-血管紧张素系统(RAS)血管保护轴的关键成员，调节心血管功能并在心血管疾病中发挥有益作用。有研究发现呼吸道病毒的刺突糖蛋白以三聚体形态存在，每一个单体中约有1 300多个氨基酸，其中300多个氨基酸构成了RBD，即病毒刺突糖蛋白与ACE2相连接的地方[4]。许多呼吸道病毒刺突糖蛋白的RBD的序列非常接近，相似性达到82%[5]。

鼻黏膜是呼吸道的门户，也是病毒侵入机体的首要步骤。相关研究发现，鼻黏膜组织、支气管活检样品、鼻甲和肺组织进行单细胞RNA-Seq测序，细胞角蛋白8(KRT8)在鼻黏膜上皮组织，支气管活检样品、鼻甲和肺组织的细胞中广泛表达。将KRT8作为表面细胞的标记，并表达ACE2、KRT8，和两者都表达的细胞分别进行统计，发现在鼻刷黏膜上皮组织和鼻甲样品中约有3.2%和2.1%的细胞共表达KRT8和ACE2[6]。进而，分别对7名患者通过PCR检测其鼻和咽拭子中呼吸道病毒滴度，并通过循环阈值(CT)测量。研究发现W1，Z1及Z2 3名患者在其鼻拭子中检测到了相关病毒，但在其咽拭子中未检测到。在Z4患者中，鼻拭子和咽拭子中均检测到病毒。此外，CT值比较结果表明鼻拭子中的病毒滴度高于咽拭子[7]。所以，下调鼻黏膜上皮ACE2的表达可能是降低易感性的一个重要手段。

通过靶向敲除技术抑制ACE2的表达已经有相关的科学探索[8]。研究结果显示，ACE2的表达能够降低MI诱导的细胞凋亡、巨噬细胞浸润，同时ACE2基因敲除能够促进HMGB1和促炎细胞因子的表达(TNF-α和IL-6)[9]。通过将含有ACE2基因的质粒DNA及si-ACE2用脂质体法转染到各组SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)中，Western-blot检测发现si-ACE2组ACE2蛋白表达量明显降低，同时P-ERK1/2、P-STAT3蛋白磷酸化水平明显提高。ERK是extracellular regulated protein kinases的英文缩写，指细胞外调节蛋白激酶，包括ERK1和ERK2，在介导细胞分化、增殖、存活中起重要作用，可被多种信号证实ACE2siRNA能抑制ACE2基因转染的SD大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞ACE2蛋白的表达，ACE2蛋白表达的减少能上调AT1受体蛋白表达，同时提高其下游信号通路ERK1/2、STAT3蛋白磷酸化水平[10]。

本研究中发现，通过小核酸干扰技术可以下调鼻黏膜上皮细胞ACE2的表达进而激活ERK1/2信号通路。激活P-ERK1/2、P-STAT3是将信号从表面受体传导至细胞核的关键[11]。鼻黏膜上皮细胞是呼吸道病毒感染人体的关键靶细胞。既往研究中证实HMGB1是鼻部炎症中重要的因子，它参与呼吸道病毒的感染应答[12]。总之，本研究发现，起始于1205位点的小核酸对ACE2在基因水平有明显的抑制效应。通过ACE2小核酸干扰不但能够减少鼻黏膜ACE2表达，同时可能进一步活化ERK1/2 以及STAT3细胞信号通路，诱导下游 C-fos等信号的强化，抗炎功能受到抑制，但这些信号的释放也可能是激活鼻黏膜局部防御性免疫应答的一部分。目前对于如何控制病毒在呼吸道传播仍处于研究阶段。本研究通过si-ACE2干扰鼻黏膜对ACE2的表达，以期可以达到控制、干预呼吸道病毒的复制及向呼吸道播散的目的，为干预病毒的传播提供新的可能。