紧密连接蛋白在非小细胞肺癌中的研究进展

陈 琪，何明旭，韩丽萍

(1.济宁医学院 临床医学院，山东 济宁 272000；2.济宁市第一人民医院 呼吸与危重症医学科，山东 济宁 272000)

非小细胞肺癌是最常见的最致命的原发性肺部恶性肿瘤，占所有肺癌患者的85%，且通常在晚期确诊[1]。在非小细胞肺癌中，腺癌是最常见的亚型，其次是鳞状细胞癌(鳞癌)[2]。尽管目前非小细胞肺癌在手术、化疗和靶向分子治疗方面取得了一定的进展，但其预后仍较差，而癌细胞转移是影响治疗效果的重要原因之一。非小细胞肺癌来源于上皮，上皮细胞间紧密连接完整性的破坏将导致细胞间的黏附性丧失和细胞分化障碍，引起细胞增殖失控，从而导致肿瘤侵袭性增加。紧密连接蛋白(Claudins)是紧密连接的重要组成部分，决定着屏障性质、细胞极性和细胞旁通透性。虽然Claudins在肿瘤细胞中的许多功能尚未阐明，但目前研究认为，Claudins在非小细胞肺癌发生、侵袭和转移中发挥着重要作用。本文就Claudin-1、Clauidn-3、Clauidn-6、Clauidn-7在非小细胞肺癌中的研究进展进行综述，旨在进一步明确Claudins在非小细胞肺癌中的作用，为非小细胞肺癌的基础研究及临床治疗提供依据。

1 紧密连接

紧密连接是位于上皮细胞和内皮细胞顶端的细胞间黏附结构，主要存在于上皮细胞、 内皮细胞间的连接复合体中。紧密连接由3种完整的跨膜蛋白(Claudins、连接黏附分子、闭锁蛋白)和闭合小环蛋白(ZO-1、ZO-2和 ZO-3[3]等外周胞浆蛋白组成，其中跨膜蛋白介导细胞间的接触，外周胞浆蛋白连接跨膜蛋白与细胞骨架。紧密连接的屏障功能可调节细胞外电荷的选择性和溶质渗透性，从而维持体内液体和电解质的平衡[4]。除了屏障功能外，紧密连接还具有栅栏功能，将细胞膜的顶端与其他区域隔开，从而阻止顶端和基底外侧细胞膜之间的膜蛋白相互混合，参与细胞极性的形成[5]。

2 Claudins概述

目前在哺乳动物中，Claudins家族包括27个成员, 是紧密连接中最重要的结构和功能成分，以组织和(或)细胞特异性的方式表达。Claudins家族成员之间具有相似的结构：在细胞质中的N-端和C-端4个跨膜结构域之间有2个细胞外环(EL1和EL2)，内部跨膜结构域之间有1个短的、由20个残基构成的细胞内环[6]。第一个细胞外环由约53个氨基酸组成，影响细胞外电荷的选择性；第二个细胞外环只有约24个氨基酸组成，比第一个细胞外环要小得多，是产气荚膜梭菌肠毒素的受体。细胞外环是维持紧密连接功能和上皮屏障完整性所必需的，其羧基末端与信号转导有关[7]。Claudins在调节上皮细胞通透性及维持细胞极性等方面发挥重要作用[8]。此外，Claudins还与多种与细胞增殖和分化相关的信号通路有关[9]。

3 Claudins与非小细胞肺癌

Claudins的丢失以组织依赖的方式导致细胞连接缺失，故被认为在肿瘤进展(以癌细胞的增殖、侵袭和转移为特征)中发挥重要作用。具体机制为:①Claudins异常表达引起紧密连接紊乱和渗漏，有利于肿瘤的转移和侵袭;②细胞极性的降低增加了肿瘤的营养和生长因子供应，使肿瘤细胞的增殖加快;③细胞间黏附的减少可能会增加转移风险并促进肿瘤的侵袭[10]。Claudins家族在相邻细胞间形成同源和异源的相互作用，是肿瘤发生和转移的关键调控因子。近年来研究表明，Claudins的异常表达与非小细胞肺癌的发生、进展和预后密切相关，可作为判断非小细胞肺癌诊断、治疗及预后的潜在标记物[11]。在非小细胞肺癌中，Claudins的表达不同，作用也不尽相同。

3.1Claudin-1与非小细胞肺癌 Claudin-1分布广泛，尤其高表达于肝脏、肾脏、皮肤等组织中，在上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)过程中起重要作用[12]。

Claudin-1在非小细胞肺癌细胞的侵袭、迁移和转移中发挥了重要作用，受到相关学者广泛研究。有研究通过芯片分析发现，Clauidn-1 过表达增加了侵袭抑制因子(结缔组织生长因子、血小板反应蛋白1等)的表达，敲除外源性或内源性Claudin-1增加了肿瘤的侵袭和迁移能力，使患者的生存期缩短[13]，推测Claudin-1可能是肺腺癌患者预后的有力预测因子。一项纳入344例肺癌患者的研究发现，非小细胞肺癌患者Clauidn-1和Clauidn-7的表达均明显降低，生存时间较短的肺腺癌患者Clauidn-1表达较低[14]。Clauidn-1的过表达抑制了癌细胞的迁移、侵袭和转移。Zhang等[15]对81例肺腺癌患者进行研究发现，Claudin-1受C-fos(癌基因)信号通路的调控，从而抑制肿瘤的侵袭和转移，Clauidn-1过度表达预示着肺腺癌患者的总体生存预后良好。Clauidn-1通过抑制细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路来抑制锌指转录因子的表达，从而抑制肺腺癌细胞的迁移和转移[16]。Pyo等[17]进行的meta分析显示, Clauidn-1低表达与非小细胞肺癌预后不良显著相关，与腺癌显著相关，但与鳞癌无显著相关性。另一方面，Sun等[18]使用免疫组化技术检测了258例肺腺癌患者组织中Claudin-1的表达情况发现，在大鼠肉瘤和表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)信号通路的调节作用下，Claudin-1表达阳性患者的预后比Claudin-1表达阴性的患者更差。目前关于Claudin-1对非小细胞肺癌患者诊断与预后的影响尚无统一定论，可能与入组患者在组织学亚型、肿瘤分期和吸烟史方面的差异相关。

3.2Claudin-3与非小细胞肺癌 Claudin-3是Clauidns家族的一员，又称产气荚膜梭菌肠毒素受体2，由CLDN-3基因编码，位于第7号染色体上[19]。 Claudin-3与产气荚膜梭菌肠毒素结合导致细胞快速裂解，而产气荚膜梭菌肠毒素能够有效地抑制 Claudin-3表达阳性的恶性肿瘤[20]。

Che等[20]对103例肺鳞癌术后患者进行回顾性分析发现，Claudin-3通过E-钙黏蛋白和β-连环蛋白信号通路调控细胞间的相互作用，抑制肿瘤细胞的转移，是肺鳞癌术后患者预后的独立危险因素。此外，通过实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction ，qRT-PCR )和免疫蛋白印迹方法检测Claudin-3在肺鳞癌组织和细胞中的表达，结果发现，Claudin-3在肺鳞癌组织中表达明显低于正常肺组织，Claudin-3异位过表达显著抑制肺鳞癌细胞株(H520)的迁移、侵袭和EMT[21]。有研究发现，Claudin-3在腺癌组织中表达增加与患者癌症进展、生存期缩短均相关(P=0.041和0.029)[22]。Ma等[19]对非鳞状非小细胞肺癌细胞株(H460、H1792、H157、H292和A549)进行研究发现，Claudin-3在雌激素受体α的调控下发挥促癌调节作用，促进肿瘤的侵袭。

Claudin-3在鳞癌中低表达，过表达Claudin-3的肺鳞癌患者预后较好；而Claudin-3在腺癌患者中高表达，低表达Claudin-3的腺癌患者预后较好。Claudin-3可作为区分肺腺癌和鳞癌的生物学标志物，并作为治疗的靶点。

3.3Claudin-6与非小细胞肺癌 Claudin-6是极化上皮和内皮细胞Claudins的重要组成部分之一，在维持细胞完整性方面起着至关重要的作用，可参与调节表皮屏障并保持上皮通透性[23]。Claudin-6是唯一具有潜在特异性的Claudins，它可以激活细胞黏附信号，调节核受体的活性, 其异常表达还与肿瘤细胞的生长和侵袭有关[10]。既往研究表明，Claudin-6在胎儿胃、胰腺、肺、肾等组织中高表达，但在健康成人组织中不表达[24]。Claudin-6已被证实在子宫内膜癌、食管鳞癌、胃癌等多种癌症中差异表达，并参与发病[10, 25]。近年来Claudin-6在非小细胞肺癌中的作用得到了广泛关注，其研究并正在进行中。

有研究发现，Claudin-6在各种人类实体癌(如睾丸癌、卵巢癌、子宫癌和肺腺癌等)组织中高表达[26]，认为Claudin-6是一种严格的癌胚细胞表面抗原，仅在肿瘤组织中表达。Micke等[27]发现Claudin-6高表达与肺腺癌患者的预后不良相关。Claudin-6在包括肺腺癌和鳞癌在内的大多数恶性肿瘤中表达上调，作为促癌基因，促进肿瘤的迁移和侵袭[28]。另有研究发现，Claudin-6在非小细胞肺癌细胞中呈阳性，但在正常肺细胞和支气管上皮细胞中呈阴性，Claudin-6的表达与淋巴结转移和肿瘤分期(tumour-node-metastasis，TNM)相关[10]。但是，Wang等[29]研究发现Claudin-6在非小细胞肺癌组织中的低表达率明显高于周围非肿瘤组织，相对于对照组，低表达Claudin-6的非小细胞肺癌患者的肿瘤分期较晚，更容易发生淋巴结转移，生存率更低、预后更差。

关于Claudin-6在非小细胞肺癌患者中的临床意义存在争议，导致研究结论不一致甚至矛盾的原因有很多，包括实验标本的选择、单克隆抗体的使用、不同的实验方法和对结果的解释等，所以需要更多可靠研究得出更有说服力的结果。

3.4Claudin-7与非小细胞肺癌 Claudin-7广泛分布于胃、肠道、肺、肾脏、膀胱和皮肤，与通常只位于肠上皮细胞顶部的其他Claudins不同，Claudin-7具有独特的细胞分布特征，它不仅分布于肠顶端上皮细胞，还高表达于肠上皮细胞侧面和基底部[30]。Claudin-7的异常表达导致紧密连接的破坏、细胞接触抑制的丧失、增殖和迁移的异常，并与非小细胞肺癌的发生、发展密切相关。

Akizuki等[31]通过半定量PCR和qRT-PCR检测肺鳞癌Claudin-5，Claudin-7，Claudin-18 的表达水平发现，上述Claudins在肺鳞癌中的表达水平明显低于正常组织，并且Claudin-5，Claudin-7和Claudin-18通过抑制蛋白激酶B的磷酸化，从而抑制人肺鳞癌细胞的增殖。Lu等[32]通过免疫共定位和免疫共沉淀法证实，Claudin-7在人肺癌细胞中与整合素β-1共定位并形成蛋白质复合体，抑制肺癌细胞增殖。敲除Claudin-7不仅促进了肿瘤细胞的增殖，而且破坏了整合素β-1的定位。一项对非小细胞肺癌细胞系(HCC827)的研究证实，在包括肺腺癌在内的各种癌细胞和组织中，Claudin-7通过与整合素β-1的调节作用，维持肺腺癌细胞系的上皮细胞附着，从而抑制肺腺癌细胞增殖[33]。Claudin-7在肺癌组织中低表达，是一种潜在的抗癌蛋白，敲除Claudin-7，非小细胞肺癌细胞的侵袭性增加[34]。Claudin-7在正常组织中的表达高于肺癌组织, 表达水平越高，肺癌细胞分化程度越高(P<0.05)[35]，提示Claudin-7的表达抑制肺癌进展。

Claudin-7是潜在的抑癌基因，Claudin-7的低表达与非小细胞肺癌患者的不良预后紧密相关，可作为诊断和预后的标记物。

4 Claudins与非小细胞肺癌的治疗

Claudins是肺癌细胞中EMT的诱导物，而EMT负责癌细胞的侵袭和转移[36]。越来越多的证据表明，Claudins与EMT、癌症干细胞的形成、对临床常规化疗药物的耐药性相关[6]。研究表明，分化细胞可通过EMT过程产生具有干细胞特征的细胞，因此EMT和肿瘤干细胞之间的轴可能是非小细胞肺癌的有利治疗靶点[11]。Claudins介导的信号传导功能的失调是癌症的危险因素，Claudins通过与许多其他信号分子的相互作用，参与了非小细胞肺癌的转移，涉及不同的信号通路，可为将来非小细胞肺癌的靶向治疗提供更多的靶点[37]。

5 小结

Claudins作为细胞间紧密连接的重要参与者，它在非小细胞肺癌中表达的失调与非小细胞肺癌的发生、恶性程度、局部复发和远处转移密切相关。在不同非小细胞肺癌病理类型中，Claudins家族的表达也不尽相同，目前Claudins的功能特点、调控机制、与其他紧密连接成员的相互作用及促进非小细胞肺癌侵袭、迁移和转移的具体机制仍在研究当中。随着研究的进一步深入，Claudins作为生物标记物和治疗靶点在非小细胞肺癌的临床诊治中会有更加广泛的应用。