棘球蚴疫苗及诊断试剂候选抗原研究现状

张春霞，李 鑫，欧兰欣，叶碧锦，李 波，王红彩，张浩吉，唐文强，王海峰，黄福强*

(1.青海农牧科技职业学院，青海湟源 812100；2.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，广东佛山 528231；3.西藏自治区农牧科学院畜牧兽医研究所，西藏拉萨 850009；4.常加(上海)农业科技有限公司，上海 201414)

棘球蚴病(Echinococcosis)由棘球绦虫属绦虫感染引起，是全世界范围流行的人畜共患慢性寄生虫病。根据感染棘球绦虫的种类不同，棘球蚴病可分为由细粒棘球绦虫(Echinococcusgranulosus)的幼虫引起的囊型棘球蚴病(Cystic echinococcosis，CE)和多房棘球绦虫(Echinococcusmultilocularis)的幼虫引起的泡型棘球蚴病(Alveolar echinococcosis，AE)[1]。我国是棘球蚴病发病率较高的国家之一，并且某些地区以泡型棘球蚴病为主。

棘球绦虫虫卵在外界环境中耐受性较强，0℃可以存活116 d，50℃可以生存1 h，并且对化学物质的抵抗力也极强[2]。成虫寄生于食肉类动物犬、狼等动物的小肠，中间宿主为偶蹄类动物如牛、羊等以及灵长类(包括人)动物。棘球蚴通过消化道进入宿主体内，再借助血液或者淋巴循环迁移到其寄生部位[3]，主要侵犯肝脏，其次是肺脏，其他部位也可受罹。

目前，临床上常用阿苯达唑、吡喹酮以及奥苯达唑等药物为感染病畜治疗，但是治疗效果欠佳，副作用大，且存在耐药性等潜在风险[4]。相反，疫苗具有安全、无残留、接种动物无休药期等优点，并且符合当前“预防为主，治疗为辅”的工作方针，疫苗免疫是疫病防控的重要手段之一。因此，加速研制出有效的棘球蚴病疫苗对畜牧养殖业以及人类的健康均具有重要意义。

自2013年开始，来自多个国家的两个联合科研团队分别完成了细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫的全基因组测序工作[5-6]。基因组测序工作的完成，为后续对棘球蚴代谢、发育和免疫逃避等生命活动的研究奠定了重要基础，其诊断标志物和疫苗的研究也得以受益。研究人员也利用各种先进技术合成了多种棘球蚴标志性抗原分子，例如AgB、Eg95、EgA31等，并利用这些标志性抗原制成了针对棘球蚴病的疫苗和诊断试剂。

1 疫苗

抗蠕虫疫苗的研发是一个非常有挑战性的课题，因为蠕虫在宿主体内的寄生过程中会触发一系列的逃避机制。有科研团队研究发现，在细粒棘球蚴和多房棘球蚴的基因组中分别有7个和6个抗原B基因，这些基因所表达的蛋白能分泌到体外，在其免疫逃避中发挥了重要作用[7]。这些逃避机制大大增加了疫苗研制的难度。除此之外，由于棘球绦虫是多细胞寄生虫，抗原结构和生活史相对都比较复杂，使得单价抗原疫苗可能出现抗原漂移，从而造成疫苗的免疫效果大打折扣。

寻找对不同宿主、不同发育阶段的棘球蚴都有效的疫苗抗原是现在疫苗研发工作最重要、最艰难的任务，尤其是针对终末宿主犬疫苗的研发。目前，疫苗的研发工作中，已经出现了比较成熟的可用于对羊大面积免疫接种的Eg95抗原以及诸如EgA31、EgM、EgTPx和TSP3等在实验室表现较好的候选抗原。

1.1 粗抗原

最初的棘球蚴疫苗主要是以棘球绦虫分泌物和代谢物、六钩蚴或原头蚴分泌物等为抗原制成的。朱兴全、Osborn PJ曾分别对细粒棘球绦虫六钩蚴分泌物的免疫原性进行研究，结果发现其免疫保护力可达96%～99%。但是由于粗抗原的成分过于复杂，含有多种抗原蛋白，并且生产成本过高，很难批量生产，因此现在已经不可避免地被其他类型的疫苗所替代。

1.2 Eg95/Em95基因家族

Eg95/Em95基因家族分别属于细粒棘球绦虫和多房棘球绦虫，都由多个基因组成,该基因家族成员编码的蛋白均含有类纤连蛋白Ⅲ结构域(fibronectin type Ⅲ domain-like).该基因家族不仅在同基因型不同基因间高度保守，在不同基因型之间亦高度保守[8]。

棘球绦虫六钩蚴、原头蚴以及成虫的体表都含有大量Eg95/Em95基因所编码的蛋白质，该蛋白表面共有6个抗原决定簇。Eg95/Em95蛋白在棘球绦虫的整个生长发育过程中必不可少，这提示了其能够诱导宿主产生免疫保护，可以利用这一特性以Eg95/Em95蛋白为抗原制作棘球蚴病的疫苗。

1.2.1 合成肽疫苗 构象表位是Eg95蛋白诱导免疫应答的主要部位，同时也是宿主的保护性抗原表位结构类型，这为棘球蚴病合成肽疫苗研发提供了理论依据。Woollard D J曾完成了合成Eg95表位4条多肽的工作，并在做成偶联肽后加入佐剂制成合成肽疫苗。试验结果显示，该疫苗具有较高的免疫保护率，但是这些多肽都仅具有免疫原性，能够诱导宿主产生大量特异性抗体，却都没有反应原性[9]。Lightowlers M W也做过类似的试验，为羊注射Eg95重组蛋白疫苗，羊群同样得到了较好的保护。

合成肽疫苗全部是由人工合成的，没有核酸成分，并且可以弥补常规疫苗的一部分不足，因此被认为是一种更加高效、稳定、经济的疫苗。但是疫苗的自身组成和宿主的免疫系统都可以影响其抗原性及免疫原性，免疫对象的免疫力也不能垂直传播，还有一些中和表位都为构象表位。这些问题极大地限制了合成肽疫苗的开发和推广。

1.2.2 核酸疫苗 核酸疫苗即DNA疫苗，是通过为宿主接种某种编码特定抗原蛋白的核酸，使该蛋白在宿主体内得以表达，从而刺激宿主产生针对该抗原蛋白的特异性免疫应答反应。

林仁勇团队研究发现，Eg95抗原基因在棘球绦虫不同成长阶段的基因序列几乎没有差异，这一发现提示了Eg95基因的核酸疫苗针对不同发育阶段的棘球绦虫都是有效的[10]。该团队还成功克隆并构建了棘球蚴的核酸疫苗pcDNA3-Eg95，后续试验也证明了该疫苗的有效性。Scheerlink JP也开展了相关试验，不同的是他先用携带有Eg95基因的质粒进行免疫，然后用了Eg95蛋白疫苗进行加强免疫，结果显示免疫对象体内产生了相当高水平的IgG1抗体[11]。

1.2.3 基因工程疫苗 基因工程重组疫苗的原理就是利用DNA重组技术，将编码保护性抗原的基因导入到原核或真核表达系统，使其高效表达，从而提取到保护性抗原的肽链，再加入佐剂即制成了基因工程的重组疫苗。

棘球蚴病首个Eg95基因工程重组疫苗由Heath DD研制成功，实验室试验结果显示免疫效果较好。此后多个研究团队也陆续展开了对棘球蚴基因工程疫苗的相关研究与探索。丁剑冰团队成功构建了Eg95基因的原核表达质粒，于琳琳团队也成功构建了Eg95-(C3d)3重组杆状病毒表达系统。这些试验都强有力地证明了重组质粒所表达的重组蛋白具有良好的免疫原性。

除此之外，还有一种应用非常广泛的基因重组疫苗是重组病毒活载体疫苗。有研究团队曾用羊口疮病毒作为重组疫苗病毒(recombinant vaccinia virus,VACA)载体，成功构建了Eg95载体病毒活疫苗。使免疫动物在产生针对口疮病毒抗体的同时，也产生了针对Eg95的特异性抗体，并且该抗体水平不亚于用纯化抗原制备疫苗刺激产生的抗体水平。

1.2.4 其他类型疫苗 除了以上3种主流疫苗以外，还有一些新型疫苗技术被用于棘球蚴病疫苗的开发，例如基因工程重组细菌载体活疫苗、转基因植物疫苗等。这些疫苗所具有的共同点就是都利用了Eg95基因或Eg95基因家族所编码的蛋白。尽管现在已经有了如此多种类的疫苗，但是只有细粒棘球绦虫羊株(G1)的Eg95基因工程亚单位疫苗在生产中应用，其余大多数疫苗都还处于实验室探索阶段。

1.3 EgA31、EgTrp

EgA31和EgTrp蛋白均在胚乳期表达，尤其是在原头节下水平表达，参与了原头蚴和成虫的发育过程，是细粒棘球绦虫成虫发育调控的重要蛋白之一[12]。以EgA31为抗原的疫苗主要是针对细粒棘球蚴病的终末宿主犬，该类疫苗可以大幅度降低棘球绦虫的产卵率，减缓虫体发育速度，并能提高宿主的IgA抗体水平[13]。

Fraize M的研究表明EgA31、EgTrp或EgA31-EgTrp能大幅提高IgG和IgA的抗体滴度[14]。Petavy AF以沙门氏菌弱毒株为载体，制成了EgA31和EgTrp的口服重组疫苗，对犬口服免疫，这也再次证明了EgA31可以作为包虫病终末宿主疫苗的候选蛋白。

1.4 EgM家族

EgM家族蛋白主要由EgM4、EgM9以及EgM123共3种蛋白组成，可以抑制棘球绦虫虫体的生长，对虫卵和六钩蚴的抑制作用尤为明显[3]。并且EgM蛋白疫苗的主要免疫对象为棘球绦虫的终末宿主犬，可以在犬的体内发挥免疫保护作用，诱导其产生免疫应答从而阻止虫体的发育。

张文宝团队成功利用EgM家族蛋白中的EgM9对犬进行免疫，结果显示抑制虫体发育的效果非常显著，使虫体发育受阻，不能产卵。这也正是针对终末宿主的疫苗最需要的效果之一。

1.5 EgTPx

EgTPx蛋白是棘球绦虫体内的一种硫氧还蛋白过氧化物酶，可以保护虫体免受宿主氧化损伤过程造成的伤害，起着非常重要的抗氧化作用[15]。对虫体在人和其他中间宿主内稳定寄生、生长和存活十分重要。王慧团队成功实现了EgTPx编码基因的原核表达，又通过对小鼠进行免疫，制备了EgTPx抗体。

1.6 p29

作为一种重组抗原分子，p29也得到了多方学者的研究。据GO富集和KEGG通路联合分析的结果可以得出，在p29免疫和细粒棘球蚴感染的两个阶段中，和免疫有关的多个过程比如免疫正调控、炎症反应、B细胞稳态以及细胞因子受体相互作用等，被注释出了多种差异表达的mRNA[2，16]，而这些过程正是宿主在疫苗免疫和感染后机体会产生的变化。

Shi Z的团队也对p29抗原分子做了相关研究，结果显示对继发感染细粒棘球蚴的小鼠可以产生96.6%的免疫保护力，对感染虫卵的绵羊也能产生94.8%的免疫保护力[17]。

1.7 FABP

蠕虫寄生虫体内含有一种多基因家族编码的低分子质量包浆蛋白，称为脂肪酸结合蛋白(FABP)。目前已经在细粒棘球绦虫中鉴定出两种类型的脂肪酸结合蛋白家族，即EgFABP1和EgFABP2[18]。现已有研究证明，在宿主体内将脂质分子运输到寄生虫细胞的过程中，FABPs作为载体蛋白发挥着关键的中间作用[19]。这也提示了这些FABP可用于构建针对细粒棘球绦虫的疫苗。在后来的疫苗试验中，口服rEgFABP1免疫产生了比较显著的高水平抗体。

1.8 其他疫苗候选分子

除了前文介绍的这些抗原分子，还有大量蛋白被研究团队作为疫苗的候选抗原研究，并且效果较好。比如包虫囊肿液(HCF)中的Antigen 5,因为rEgAg5含有多个具有高免疫原性的B细胞和T细胞激活表位，可作为终末宿主和中间宿主疫苗的候选抗原[20]。但因为EgAg5在成虫期仅有弱表达，并且容易与p29发生交叉反应[21],因此该抗原还停留在实验室研究阶段。还有如Eg14-3-3，作为一个普遍存在的蛋白质家族，是棘球绦虫成虫喙腺的分泌成分，它在细胞周期、分化以及生长调节和细胞凋亡调节等多个过程中发挥着关键作用[22]。除此之外，还有EmⅡ/3-10[23]、ANX[24]、EgTeg[25]、TSP3[26]等，还有学者将多个抗原整合起来制成一个多细胞表位的抗原，都有不错的免疫效果。

2 诊断

目前，棘球蚴病的诊断方式主要是采用影像学检查，再结合临床症状和流行病学确诊。遗憾的是影像学技术还无法实现棘球蚴病的早期诊断，这时就需要借助在早期诊断中非常有优势的免疫学检测方法[27]。

2.1 血清学诊断

棘球绦虫病免疫诊断的抗原主要来自于包囊液(HF)。针对不同类型的棘球蚴病，所用到血清中的抗原也不尽相同。

2.1.1 细粒棘球蚴抗原 HF脂蛋白抗原B(AgB)和抗原5(Ag5)广泛应用于细粒棘球蚴引起的囊性棘球蚴病(CE,即包虫病)的血清学分析。经手术切除证实的CE患者血清学检测方法的敏感性和特异性从60%～90%不等。使用富集Ag5以及基于重复串联细粒棘球蚴的重组AgB和Ag5均可以极大地提高其诊断价值[28]。大量其他新抗原例如表皮蛋白EgTeg、碱性磷酸酶EgAP和EpC1在所选血清样本上也都表现出了90%左右的敏感性和特异性[29]。

但是，对它们的性能还从未进行过大规模的评估，仅停留在实验室阶段。目前报告的抗原敏感性和特异性还不够高，导致其无法作为诊断或大规模人群筛查的首选工具。Casoni的皮内试验也证实了这些抗原的特异性和敏感性不够高，仅可用于侧面印证影像学的诊断结果。

2.1.2 多房棘球蚴抗原 相比于CE，由多房棘球蚴引起的泡性棘球蚴病(AE)所用到的血清学检查较为可靠。Em2和Em492代表了完整囊尾蚴排泄物和分泌物的成分，EmAP和EmP2对多房棘球蚴感染诊断具有较高的特异性[30]。Em10或其衍生物EmⅠ/3以及由Em10部分基因序列编码的蛋白Em18在诊断AE方面显示出较高的性能，但其纯化十分困难，难以满足需求。目前一种商业化的EM2-葡聚糖酶联免疫吸附试验(ELISA)已广泛用于AE的临床诊断，其敏感性和特异性均超过了90%。

一些报告显示，在一些大规模使用血清学筛查的地方，一部分人口的血清学检查呈阳性，却没有AE病变。在患有AE的免疫抑制患者中，血清学检查也经常呈阴性，因此还不应将血清学诊断结果单独用作该疾病的诊断论据[31]。

2.2 卵抗原

棘球绦虫的主要卵抗原(major egg antigen，EmMEA)中的p40(MEAp40)是一种免疫原性良好的分子，可以诱导宿主产生较为强烈的体液免疫和细胞免疫反应，可以作为诊断试剂甚至疫苗的候选抗原。Western-blot和ELISA的结果也进一步证实了重组EmMEA可与多房棘球蚴感染小鼠的血清发生特异性反应，且敏感性和特异性均达到了99%以上[32]。

2.3 游离DNA

存在于血液、尿液和唾液等体液中的细胞外游离状态的DNA分子被称为游离DNA(cell-free DNA，cfDNA)。通过基因组重测序技术和生物信息学分析相互印证，发现在细粒棘球绦虫病患者的血浆中存在着属于细粒棘球蚴的虫源cfDNA，近期也有相关研究再次证实了这一观点[33]。这些结果都表明了体液中的虫源cfDNA可以作为标志物应用于棘球绦虫病的诊断。后续通过采集感染不同生长时期、不同型别棘球绦虫患者的血样，有望筛选出更加理想的核酸诊断标志物。

2.4 其他抗原

曾用于棘球绦虫病疫苗的粗抗原也可用于AE或CE的免疫学诊断，但是因为容易与其他寄生虫的抗原发生不同程度的交叉反应，所以即使其具有较好的敏感性和特异性，也不能制成可靠的诊断试剂。除此之外，还有学者通过构建pET30α-Eg95-5载体，成功获得了Eg95-5蛋白。Western blot的结果显示该蛋白可以与患病动物的阳性血清发生反应[34]，提示其具有用于棘球蚴病检测的潜力。

3 展望

不管是AE还是CE，都是十分严重的人畜共患寄生虫病，对畜牧养殖业和人类生活都能产生巨大的影响。在棘球蚴的生活史和传播途径中，犬是一个十分重要的终末宿主，在其体内还有大量的虫卵。因此，目前控制该病传播的重要措施便是给犬定期驱虫，阻止在中间宿主体内的发育。这也提示了根据免疫对象的不同，需要不同功能的疫苗。针对终末宿主犬，需要让疫苗发挥清除虫卵，降低成虫产卵率，阻止棘球蚴传播的作用。针对中间宿主牛、羊，更需要疫苗可以激发免疫对象的免疫系统，使其被棘球蚴感染以后可以快速产生大量抗体，增强其抵抗力。虽说已经探索出多种可以作为候选抗原的蛋白和基因，甚至可以在不同的宿主体内亦或是针对不同时期、类型的寄生虫发挥不同的作用，但其中的大部分都还没有经过大规模的试验，都还仅仅停留在实验室探索阶段。这就需要开发出免疫效果更好的候选抗原或接种方式。

棘球蚴病的传播范围较广，传播方式也较为隐蔽，这就需要能够尽早诊断出宿主的棘球蚴病。而常用的影像学技术还无法实现早期诊断，只能依靠在早期诊断比较有优势的免疫学诊断。前面描述的目前常用的免疫试剂总体效果不错，但都存在各种各样的缺陷或者不足，比如诊断试剂所用的抗原常与宿主体内针对其他绦虫甚至吸虫产生的抗体发生交叉反应[35]。因此，需要开发出特异性和敏感性极高且假阳率较低的蛋白作为新的诊断试剂和候选抗原。