珍珠粉复合支架在骨修复的研究进展*

张 楷 徐 普

骨缺损是较为常见的一种疾病，每年至少有数百万相关病例需要进行骨修复。而珍珠粉具有良好的生物相容性，价格低廉、易获取，因而有进一步深入相关研究的必要[1,2]。现在学者常将珍珠粉制备成复合支架，进行实验室研究和动物实验，以研究其骨修复能力，故本文选取常用相关复合支架以探讨其性能及发展前景。

1.珍珠粉在骨修复的作用

珍珠粉主要产于珍珠贝类和珠母贝类软体动物体内，由珍珠研磨而成。很早以前即开始应用于人类医学，作为中药历史悠久[3,4]，有明目[5]、护肝[6]、缓解心律失常[7]、抗皮肤衰老[8]等功效，同时，也可消炎抑菌[9]、促进创口愈合[10]。其理化和生物学特性接近骨[11]，自Löpez 发现其成骨潜能以来受到国内学者广泛的关注[12]。

其组成、结构类似骨,由95%的无机物和5%的蛋白质、多糖、几丁质等有机物组成[1]。无机部分多为碳酸钙，可作为成骨的原料。相比羟基磷灰石，珍珠粉的有机基质可作为粘接剂分布于碳酸钙板层间，二者形成的砖墙结构使珍珠具有良好的力学性能，同时也增强了骨诱导和蛋白吸附能力[1,13]。虽然只占5%，但有机基质才是珍珠粉对于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促进成骨细胞增殖和分化，并产生新的界面结构，影响表面稳定性和调节组织特性，在晶体成核、微观结构中起着相当重要的作用[14]。另一方面，有机基质本身也有多种促进成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受体活化因子配体，减少破骨细胞的骨吸收，而骨形态蛋白2也使得其相比羟基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

珍珠粉可促进细胞外基质合成和组织再生，体内外实验均显示了它有良好的生物相容性以及优于羟基磷灰石的成骨作用及骨诱导性[17]。陈灵将其植入兔股骨远端缺损处，3个月后可见骨缺损边界模糊，新生组织几乎覆盖完全。而CBCT显示材料基本降解完全，缺损边缘新生成组织的灰度值与周围正常骨组织相近。同时组织学观察发现有大量的软骨细胞及软骨基质增生，有较明显软骨化现象[18]。而毛秋华实验发现，将其浸提液加入肘部静脉血后溶血率为仅为1.01%，注入兔背部皮内72 h后皮肤无红斑和水肿表现[19]。郑斌将其与小鼠骨髓间充质干细胞共培养，发现细胞毒性为Ⅰ级，细胞形态呈梭形、无明显改变，未见大面积细胞脱落，符合我国生物材料应用标准，与同浓度纳米羟基磷灰石相比，具有更好的细胞相容性，是良好的骨修复材料[20]。而将其小鼠成骨细胞共培养后，廖军发现，在各时间点碱性磷酸酶活性高于加入纳米羟基磷灰石的阳性实验组，且细胞汇合呈集落生长,细胞间红褐色，茜素红结节面积可达45.79% ，亦大于纳米羟基磷灰石组[21]。

然而，该材料孔隙率较低，机械强度不足以有效支撑，且不易成形，在体内易流失[14,22]，有机基质将无机质连接成同一晶型方向的结构也阻碍了其降解，故临床上需要将珍珠粉作为功能性填料，制成复合支架，进行骨组织工程以改善其性能，使之易加工、便于操作，作用持久[1,23]。

2.珍珠粉复合支架在骨修复中的作用

骨组织工程是目前修复骨缺损最有前景的方法之一，即将自体细胞种植于支架内，培养一段时间后移植体内，以修复骨组织[24]。而构建支架对组织工程技术最为关键，即采用支架为种子细胞、生长因子提供空间，自身降解的同时引导新骨的长入，达到骨修复的目的。

能与珍珠粉共同制备成复合支架的材料，多为可降解聚合物，如聚乳酸、聚乳酸-羟基乙酸、聚己内酯、多羟基苯甲酸酯、透明质酸、壳聚糖等。可根据需要人为调节理化及生物学性能，实现高孔隙率和表面积。其降解速度可控、产物可吸收，故而能避免二次手术。同时易成型，可在无机非金属材料之间可充当粘接剂[25]。但是，纯聚合物单一组分的生物活性较弱，且它们多存在机械性能不足、降解快且产物呈酸性而引起不良反应等缺点，骨传导、骨诱导能力尚不足[26]。而将珍珠粉均匀分散于支架中，可与可降解聚合物取长补短，使其获得理想的孔隙结构和强度，更有利于细胞的生长及矿化，从而提高成骨效果[27]。因此，以聚合物为基质、无机非金属材料为功能填料的复合支架得到了广泛发展。

目前研究最多的珍珠粉复合支架为珍珠粉/壳聚糖-透明质酸复合支架和珍珠粉/聚乳酸复合支架[1,28]。

2.1 珍珠粉/聚乳酸复合支架及珍珠粉/聚乳酸-羟基乙酸复合支架聚乳酸由L-乳酸、D-乳酸聚合而成，易于加工制成有各种孔结构和孔隙率的三维多孔支架，且降解产物易为人体所吸收，在各种珍珠粉复合支架中最广为学者所研究[28]。

珍珠粉均匀分布于支架，可改善支架亲水性和成骨效果。朱磊制备出圆柱体的左旋聚乳酸/珍珠层粉复合支架，电镜下见阶梯状多孔结构，孔壁和边缘上珍珠层粉均匀分布，未见明显团聚，部分珍珠层粉粘附在左旋聚乳酸表面，使孔壁粗糙。将其植入兔1.5 cm桡骨骨缺损处，12周时骨折断端有大量骨痂连接，骨髓腔基本再通达到骨性愈合[29]。而珍珠粉的结构也影响着性能，Qianli Huang将文石结构的聚乳酸/文石复合支架与人成骨肉瘤细胞SaOS-2共培养，发现3天后细胞接近融合，边界模糊，在第4 天和第7 天，对SAOS-2细胞的碱性磷酸酶活性有促进作用，14天后，观察到左旋聚乳酸/文石支架表面形成骨样结节，探测到Ca、P元素，骨钙蛋白和骨桥蛋白的表达水平显著升高。证明要聚乳酸/文石复合支架对细胞的促进增殖作用与成骨作用要优于聚乳酸/球文石复合支架[23]。乳酸可造成酸性环境，但相关实验无明显炎症反应，刘渊声认为，这是因为珍珠粉碱性产物提供了相对稳定的环境，中和了酸性，也延缓了支架降解，故无明显炎症反应[30]，也有学者认为这是由于其酸性弱，对高孔隙率支架影响过小[23]。除此以外，也有人将抗生素加入了支架，制成了同时具备抗感染和成骨能力的利福平/莫西沙星-聚乳酸-羟基乙酸共聚物微球，将其植入兔长度、直径6 mm的桡骨感染性骨缺损模型，8周后Micrö-CT见无感染迹象，新生骨在骨缺损处形成持续愈合的骨组织，表明其在治疗感染性骨缺损方面具有显著的潜力[28]。

然而聚乳酸自身机械强度不足，且有大量酯键，因此亲水性、生物相容性不足，故而骨诱导性不足。除此以外，其降解缓慢，难以控制降解周期[30]。而羟基乙酸拥有较好的生物降解性、生物相容性，可与聚乳酸共聚形成聚乳酸-羟基乙酸[31]。因此，胡涛以低温沉积法1:1还原制备了珍珠粉/聚乳酸-羟基乙酸下颌骨骨块[32]。可通过聚乳酸-羟基乙酸与珍珠粉的比例控制其降解速率，通常羟基乙酸含量越高，降解越快，但比例为1：1时，降解最快[30]。珍珠粉的引入能改善支架的压缩强度等综合性能，尤以聚乳酸-羟基乙酸：珍珠粉比例为5：2时综合评价最好：压缩弹性模量为36.097MPa；接触角为77.98°；14 天降解了40.23%。

2.2 珍珠粉/聚己内酯复合支架聚己内脂由己内酯单体聚合而来，具有良好的生物相容性，在37°C生理溶液中比较稳定，与珍珠粉几乎无化学反应，因此具有长期的机械强度[22]。虽力学性能不足，且本身疏水，不利于细胞粘附生长，但可溶于多种有机溶剂，通过与其他材料共混或表面改性来改善自身不足[33]。

三维打印法是较新颖的支架制备技术，能精细控制支架的孔径、孔隙率和强度，在口腔领域应用愈发增多[34]。杜晓宇用三维打印法制备出的具有约350 mm大孔，强度约8 Mpa的珍珠粉-硫酸钙/聚己内脂复合支架，大体满足松质骨抗压强度的要求，同时也能调节支架降解并稳定环境PH变化。相比其他组，随着珍珠粉含量增加，支架力学强度得到了更好的改善，骨髓间充质干细胞的细胞增长率及细胞在支架表面的增长率也显著增加。这表明珍珠粉含量可调控复合支架的理化和生物学性能[35]。而Xu Zhang等通过三维打印制备了不同浓度珍珠粉的复合支架，使孔径得到了严格控制，规则均匀的500 μm方形大孔结构与58.4%的孔隙率利于细胞血管长入、细胞增殖分化，也保证了支架2.47±0.40 MPa到7.58±0.15 MPa的近似于骨小梁的抗压强度[22]。

2.3 珍珠粉/聚3-羟基丁酸-3-羟基戊酸共聚物(pöly lactic-cö-glycölic acid，PHBV)复合支架PHBV是微生物合成的高分子材料。因其降解性、生物相容性和优异的材料改性而被广泛研究。降解物不含有害物质，且有很好的诱导骨细胞生长的作用。但是，该材料也有机械性能不足、热稳定性低、强疏水性等不足，无法单独使用[36]。

白敬敬发现不含珍珠粉的试样在1-3天羟基磷灰石增长率小，长量约为0.23 mg/cm2，而后增长率增加，但小于加珍珠粉的复合薄膜。这是因为前者矿化初期会先形成晶核，而含珍珠粉的PHBV薄膜会释放钙离子，使周围局部浓度升高，羟基磷灰石更快成核及沉积，在相同条件下生成羟基磷灰石更多。同时，为了缓释药物、治疗肿瘤，白敬敬又采用电纺法制备了载阿霉素(döxörubicin,DOX)的DOX/PHBV/珍珠粉静电纺纤维支架，发现珍珠粉含量高则缓释药物快，其对于肿瘤的治疗有一定的前景[37]。

2.4 珍珠粉/壳聚糖-透明质酸复合支架壳聚糖由氨基葡萄糖和N-二氨基葡萄糖组成，生物相容性、降解性、粘附力、可塑性较优，也有良好的扩散特性[38]。虽然有抑菌、促进愈合等优点，但也有机械性能较弱，β-（1,4）键导致的降解过快等不足。然而，其阳离子性质及氨基反应活性，使其易修饰成各种物理或化学衍生物以改善其性质，同时可调节体内PH值，改善部分材料降解时产生的炎症反应[39]。

透明质酸由存在于人体的大多数结缔组织中，是细胞外基质的主要成分。具有抗炎、抑菌、抗肿瘤的能力[40]，能调节基质中的水分，可被用于构建具有结构的支架[24]。但机械性能较低，性能不稳定，无法单独用做骨替代材料。然而，可与壳聚糖发生反应生成稳定聚合物，弥补壳聚糖脆性大，黏弹性弱等缺点[41]。

为模拟骨基质，王秋子[1]等采用低温干燥法制成了纳米珍珠粉/壳聚糖-透明质酸复合支架。该支架的孔隙率在89%～93%之间，随着珍珠粉的增加而略有降低。同时，复合支架的亲水性和力学性能增加，但孔形态略微受到干扰，其中25%的支架表现尤为明显。珍珠粉含量较高的支架有利于小鼠颅顶前成骨细胞增殖和分化，其中珍珠粉含量为10 wt%和25 wt%的支架效果最好，第14天，逆转录-聚合酶链反应可见添加10%和25%纳米珍珠粉的支架骨钙蛋白、成骨特异性转录因子的表达均高于对照组(P<0.05)。并且蛋白印迹条带清晰，形状规则，与对照组相比，添加10%和25%纳米珍珠粉的复合支架对骨钙蛋白、骨桥蛋白、I型胶原蛋白和成骨特异性转录因子的蛋白的合成增加。而骨钙蛋白、骨桥蛋白、I型胶原蛋白和成骨特异性转录因子基因的表达上调可能是其促进分化的机制之一[42,43]。

2.5 其他复合支架除组成上述支架以外，珍珠粉还可与聚氨基酸[44]等可降解聚合物以及硫酸钙[45]等骨水泥复合成支架，骨形态蛋白2[46]等生长因子作为第三要素亦可载入其中，但物理刺激等第四元素尚少见于相关支架。

3.珍珠粉及其复合支架在骨修复应用中的可能机制

一方面，珍珠粉可以通过经丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路促进细胞自噬，从而促进成骨细胞分化[47]。另一方面，它能抑制破骨细胞组织蛋白酶K进而减少骨吸收[48,49]。除此以外，珍珠粉还可通过c-Jun氨基末端激酶信号通路调控Fös相关抗原-1表达促进成骨细胞矿化[50]。

珍珠粉的各组分也有促进骨修复的作用。其无机部分多为碳酸钙，多孔性结构可令生物组织可长入其中并与其表面键合，同时产生成骨作用，因此具有骨传导性[38]。同时，其降解时可改变钙离子浓度，随之产生的碱性微环境也可刺激成骨细胞活性[51]。它也具有良好的生物相容性，能促进成骨细胞的粘附生长，诱导骨形成，因此具有骨诱导性[22]。虽然有机基质只占5%，但该部分才是珍珠粉对于生物活性起主要作用的成分。一方面，它可促进成骨细胞增殖和分化，并产生新的界面结构，有机/无机界面的电荷可影响表面稳定性和调节组织特性，在晶体成核、微观结构中起着相当重要的作用[14]。另一方面，有机基质能清除细胞内活性氧自由基及抑制脂质体氧化，维持活性，阻止成骨细胞凋亡[15]。而珍珠的有机基质本身也有多种促进成骨效果的成分。珍珠蛋白N16能抑制核因子κB受体活化因子配体，减少破骨细胞的骨吸收，而骨形态蛋白2也使得其相比羟基磷灰石有更好的骨再生活性[15,16]。

将珍珠粉均匀分散于支架中，可与可降解聚合物取长补短，使其获得理想的孔隙结构和强度，提高亲水性。更有利于细胞的生长及矿化，从而提高成骨效果[27]。同时，降解产物产生的碱性微环境可稳定环境PH，减轻部分可降解聚合物导致的炎症[30]。

4.总结和展望

因相关蛋白与砖墙结构，珍珠粉具有优于羟基磷灰石的成骨性能和生物相容性。制成复合支架时，也能均匀分散于支架，从而提高力学性能和亲水性。同时，降解产物产生的碱性微环境可稳定环境PH，减轻部分可降解聚合物导致的炎症。

目前研究较多的为珍珠粉/聚乳酸复合支架以及珍珠粉/壳聚糖-透明质酸复合支架。在搭载药物方面，不少支架已开始探寻抗感染、抗肿瘤的方法，以及在制备方法上使用三维打印令孔隙形状更适合细胞的长入和力学性能的改善。在众多研究中，珍珠粉复合支架均展现了其潜力，但目前仅是实验室研究和简单的动物实验，与其它材料的比较也需进一步探索。与此同时，种子细胞的研究，金属离子掺杂的研究，磁等物理刺激的研究等，尚少见于珍珠粉复合支架。同时，细胞毒性、成血管、免疫排斥等性质以及何种复合支架更适合人体骨修复仍需进一步研究。