新型无创技术在指导自身免疫性肝炎诊疗中的作用

刘怀鄂， 钱建丹， 张 驰， 刘艺琪， 李 志， 赵 鸿， 王贵强,3

1 北京大学第一医院 感染性疾病科， 北京 100034；2 昆明医科大学第一附属医院 感染性疾病科， 昆明 650032； 北京大学国际医院 感染性疾病科， 北京 100034

自身免疫性肝炎(autoimmune hepatitis, AIH)是以自身免疫性抗体阳性、高球蛋白血症和组织界面肝炎为特征的免疫损伤为基础的肝脏疾病。由于起病隐匿和诊断条件限制，大约30%的患者被诊断时已经存在肝硬化[1]。严重的未经治疗的持续AIH活动患者病死率很高，诊断后5年内病死率超过50%[2]。

皮质类固醇为基础的治疗方案在国内外都是AIH的一线治疗方案[3-5]。但是除了激素类药物的大量副作用，约20%的黄疸患者在治疗3年后仍将无法缓解[6]，这使得医生对AIH患者激素治疗方案的制订存在很大困难。在各国治疗指南中IgG和转氨酶水平是最常用的AIH患者病情评估和激素疗效评价的指标[3-5]。然而转氨酶与AIH进程可能并不一致，即便出现生化学应答，AIH也不一定获得完全控制。激素类药物的过早停用可能导致AIH的复发、加重，甚至治疗失败[7]。而对于急性和儿童AIH患者，以及自身抗体阴性AIH患者，由于基线免疫球蛋白较低，IgG水平不能作为激素治疗的评价指标[5,8]。常规的无创指标无法满足AIH患者病情评估及激素治疗评价需要。现将近年来发现的可用于AIH患者病情评估及皮质类固醇治疗效果评价与预测的无创手段进行综述。

1 新型血清学标志物

1.1 microRNA(miRNA) miRNA是由21～25个核苷酸组成的双链非编码RNA，可以影响调节性T淋巴细胞(regulatory T cell, Treg) Foxp3转录因子表达，并影响这些细胞的免疫调控[9]。在AIH的动物模型中发现内吞作用和丝裂原活化蛋白激酶信号通路是miRNA在AIH中发挥调控作用的重要通路，并有可能成为AIH治疗的新靶点[10]。国内学者[11]的一项miRNA-143在小鼠AIH模型和肝细胞损伤模型中潜在作用的研究中发现，miRNA-143在减轻AIH小鼠肝细胞肝损伤中有重要作用，它通过磷酸化转化生长因子-β激活激酶1(transforming growth factor-B activated kinase-1, TAK1)来调节肝脏炎症和纤维化。在Migita等[12]的研究中发现，与慢性丙型肝炎患者和健康对照相比，AIH患者的血清miRNA-21水平显著升高，miRNA-21和miRNA-122血清水平与ALT水平相关，循环miRNA-21的水平与AIH肝脏炎症的组织学分级显著相关；而伴有肝硬化的AIH患者中miRNA-21和miRNA-122的循环水平显著降低，并且与纤维化阶段的增加呈负相关。这表明miRNA-21和miRNA-122血清水平的变化可以反映它们在介导AIH炎症过程中的作用。另一项相关研究[13]也提示，miRNA-122可能是AIH肝损伤的生物标志物，而miRNA-21可能是细胞介导的炎症和免疫反应的生物标志物。虽然这些研究还存在一些不足，比如miRNA-143的研究目前主要基于动物实验，而miRNA-21相关研究的人群例数非常有限，一系列的miRNA在AIH作为治疗性生物标志物的价值尚不清楚，但它们能够在外周血被量化的特点，使得其作为AIH的皮质类固醇治疗的反应标志物具有临床运用价值。

1.2 血清紫藤紫胶凝集素阳性Mac-2-结合蛋白[wisteria floribunda agglutinin positive Mac-2-binding protein, WFA(+)-M2BP] WFA(+)-M2BP是由肝细胞、成纤维细胞等多种细胞分泌的细胞外基质组分。Kuno等[14]在基于慢性肝炎的研究中报道了这种新型指标的肝纤维化诊断作用。随后WFA(+)-M2BP在慢性丙型肝炎、原发性胆汁性胆管炎等肝脏炎症疾病中预测和评估肝纤维的作用逐渐得到报道[15]。一项在137例接受肝活检和 WFA(+)-M2BP血清学检查的原发性胆汁性胆管炎患者中进行的研究[16]发现，WFA(+)-M2BP的基线测量值是此类患者肝纤维化和预后的一种简单可靠的无创替代指标。Nishikawa等[17]在AIH患者中进行的相关研究发现，WFA(+)-M2BP与患者肝脏组织学表现关系密切，不仅可以预测患者肝纤维化，而且可以用于肝脏炎症程度的评价。在这项研究中将WFA(+)-M2BP水平3.9作为截止值时，预测患者存在肝硬化的受试者工作特征曲线下面积(AUC)为0.853，敏感度为94.4%，特异度为75.8%；将WFA(+)-M2BP水平3.7作为截止值时，预测患者存在进展期纤维化的AUC为0.747，敏感度为64.3%，特异度为83.3%；将WFA(+)-M2BP水平3.4作为截止值时，预测患者存在严重肝脏炎症活动的AUC为0.739，敏感度为72.4%，特异度为70.9%。虽然作为一种临床尚未常规开展的指标，目前WFA(+)-M2BP运用于临床实践存在一定困难，但随着其在肝纤维化评估方面的作用逐渐被临床专家认识，尤其是在皮质类固醇治疗的AIH患者炎症评价指标非常有限的背景下，具有非常重要的研究价值。

1.3 新型细胞外高级糖基化终产物结合蛋白受体(extracellular newly identified receptor for advanced glycation end products binding protein, EN-RAGE)、可溶性高级糖基化终产物受体(the receptor for soluble advanced glycation end products, sRAGE)或EN-RAGE/sRAGE sRAGE、EN-RAGE被发现可以通过作用于RAGE 介导的下游级联反应，在炎症性免疫反应中起重要的调节作用[18-19]，因此在AIH的进展评估中的作用最近逐渐受到关注。国内进行的一项队列研究[20]发现，AIH患者表现出较高的EN-RAGE和sRAGE水平，同时RAGE/sRAGE比值升高，表明EN-RAGE和sRAGE在AIH发病中的调控机制上可能发挥相反的作用。研究发现AIH治疗后缓解的患者EN-RAGE和EN-RAGE/sRAGE较低，但sRAGE较高。值得关注的是EN-RAGE、sRAGE或EN-RAGE/sRAGE在ALT正常的AIH患者中可以筛查进展期的肝炎患者，预测效能最高的EN-RAGE在18.73 ng/mL的截止值时预测的AUC为0.85(95%CI: 0.72～0.97)。这些参数也可以用于AIH患者肝硬化发生的预测，预测效能最佳的sRAGE的AUC为0.82(95%CI: 0.72～0.92)。并且在对接受皮质类固醇治疗有反应的患者疗效预测中发现，当EN-RAGE/sRAGE的截止值选择36.65时，具有最高预测价值，AUC为0.83(95%CI: 0.73～0.93)，敏感度为76.1%，特异度为81%。研究表明EN-RAGE、sRAGE或EN-RAGE/sRAGE三个参数与AIH患者肝脏坏死性炎症、肝硬化发生率和激素治疗反应均密切相关，在AIH的诊断、病情评估、疗效评价方面都有潜在的临床指导价值。

1.4 基线IL-2水平 IL-2是Treg的重要调控因子，可以挽救其免受CD95介导的细胞凋亡作用[21]。而作为免疫抑制性调节细胞的Treg在AIH的发病中扮演重要角色，并有研究[22]认为基于Treg的生物疗法可以有效控制AIH。Treg在AIH的发病机制、治疗中的作用越来越多受到关注。但遗憾的是，研究[8]发现，在皮质类固醇治疗后发生完全生化应答的AIH患者，未检出明显更高的肝内Treg数量，无法用于激素治疗的疗效预测与评价。而IL-2基线水平在AIH应答者和非应答者之间表现出明显差异，并且在发生生化学应答的患者血液中IL-2明显下降[8]。AIH患者较高的IL-2基线水平与激素治疗后的生化学应答相关。进一步的研究发现，以10.8 μg/mL的IL-2截止值用于在未治疗的小儿AIH的亚人群中对激素标准疗法的治疗反应进行预测的AUC为0.701。而联合简易AIH评分的IL-2预测模型可以将激素治疗的生化应答的AUC提升至0.759，明显优于IgG的预测模型。IgG的预测模型在研究中虽然也对激素治疗后的生化学应答有预测效果，但AUC仅为0.654。IL-2水平与AIH患者Treg的免疫调控机制发挥密切相关，不仅有可能运用于临床激素治疗效果的评价，而且有可能作为Treg为基础的生物学治疗方案治疗效果预测与评估的有效指标，但仍需更多的相关研究进行验证。

1.5 程序性死亡蛋白1(programmed death-1 protein, PD-1)及其抗体和配体 PD-1是一种T淋巴细胞增殖和功能的抑制剂，其与程序性死亡配体1(programmed death ligand-1, PD-L1)和程序性死亡配体2(programmed death ligand-1, PD-L2)的连接产生抑制T淋巴细胞活化并减少淋巴细胞增殖的信号,在将幼稚的CD4+T淋巴细胞转化为Treg过程中起关键作用[23]。熊克宫等[24]研究发现AIH患者肝组织PD-1表达上调,与肝组织炎症活动密切相关,但与纤维化分级无相关性，提示PD-1参与了AIH肝脏炎症的发生及发展。Agina等[25]在儿童AIH患者中的研究表明，PD-1表达在皮质类固醇治疗有反应者和无反应者中相当，而PD-L1在有反应者中显著上调。反映免疫攻击的PD-1/PD-L1比率在AIH患者中显著高于丙型肝炎患者，在治疗无应答AIH患者中显著高于应答者。相关研究[26]还发现，在未经治疗、对免疫抑制疗法反应不完全或停药后复发的AIH患者，其PD-1基因的变异产物可溶性PD-1血浆水平明显高于对疗法完全反应的患者。Matsumoto等[27]的研究发现，AIH患者中抗PD-1的出现频率高于健康人、药物性肝病患者、急性病毒性肝炎患者和原发性硬化性胆管炎患者，血清抗PD-1阳性还与泼尼松龙的治疗反应较慢和停药后的复发率较高有关,并且在多中心验证研究中已经描述了类似的发现。PD-1及其抗体和配体在AIH的发病机制及皮质类固醇治疗后的免疫反应中的作用目前尚不完全清楚，但PD-1在炎症及免疫控制中的重要作用为这类指标作为AIH患者激素治疗的疗效评价标志物提供了可行的理论基础。

2 影像学诊断技术的运用

2.1 18 F-FAC示踪剂显影的正电子发射计算机断层扫描成像技术 目前临床用于评估体内肝细胞炎症和肝内T淋巴细胞浸润情况的临床方法非常有限，主要通过转氨酶和代谢产物进行间接推断。但是这些措施都不能完整、准确的反映整个肝脏的炎症情况。而近期正电子发射计算机断层扫描成像技术的相关研究表明，在示踪剂18 F-FAC的辅助下可能实现肝脏炎症细胞的可视化定量操作。早期的研究[28]表明，示踪剂18F-FAC可用于自身免疫性结肠炎的小鼠模型的体内炎症细胞的可视化评价。近期的研究[29]发现，在小鼠AIH模型的肝内，18 F-FAC的蓄积增加了61%，远高于病毒性肝炎的对照组小鼠。肝内18F-FAC积累的增加集中在浸润的CD4和CD8细胞中。并且发现在诱导AIH前给小鼠预注射地塞米松的小鼠肝18 F-FAC积累水平明显低于直接进行AIH诱导的小鼠。这一发现表明，用18 F-FAC进行PET成像可以对AIH的肝内炎症进行可视化的定量分析，提供了地塞米松治疗AIH模型功效的非侵入性生物标记，有可能用作开发治疗AIH的免疫调节疗法评估的直观监测手段。

2.2 瞬时弹性成像技术 肝纤维化，甚至肝硬化是AIH的常见进展期表现，而肝纤维化的控制与改善情况也是AIH治疗效果评价的重要环节。常规的血液及影像学检测手段无法对肝纤维化程度进行准确的评估，有些情况下甚至需要借助肝穿刺活检。但肝活检作为一种有创操作，很难常规运用于AIH患者的连续治疗反应评价。而瞬时弹性成像技术(transient elastography, TE)是一种基于超声的非侵入性技术，可基于对肝硬度测量值的评估来量化评判肝纤维化程度，在病毒性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎等慢性肝脏疾病纤维化评估中的作用逐渐得到肯定[30-31]。Mahmud等[32]在一项回顾性队列研究中发现，TE可以用于区分AIH患者的组织学纤维化分期。而我国学者在非侵入性检测对AIH肝纤维化分期的诊断准确性的系统评价研究[33]中发现，与其他实验室无创指标相比，TE在AIH患者的肝纤维化分期方面表现良好，而APRI和FIB-4模型的诊断准确性较差。我国学者[34]指出，TE是评估AIH患者肝纤维化的一种有价值的非侵入性方法，AIH患者F2阶段的最佳检测临界值为6.27 kPa，F3阶段为8.18 kPa，F4阶段为12.67 kPa。在TE对治疗反应的检测方面，Hartl等[35]在生化缓解和TE在监测AIH病程中作用的研究表明，完全生化缓解是AIH良好预后的可靠预测指标，并导致纤维化消退，可通过TE进行监测。TE技术作为一种真正的无创、简便并可以为肝纤维化提供较为准确的定量检测手段，已成为当前纤维化定量检测的主流技术。但在AIH患者中开展TE技术时，同样不能忽视TE技术在其他慢性肝脏疾病诊治过程中存在的问题,如肝炎明显活动期和合并脂肪性肝病对检测准确度的影响及存在无法判读的灰色区域等问题[30]。所以有学者[36]提出，为了提高TE在AIH活动患者中评估的准确性，在活动性AIH的患者肝纤维化评估时采用肝脾二维剪切波弹性成像。也有研究[37]提出磁共振弹性成像可以为AIH患者提供比TE更高的纤维化诊断性能，尤其是肝纤维化的早期阶段。面对TE技术诊治过程中的这些问题，需要更多的临床研究进行评价。

3 预测模型研究

由于发病隐匿和诊治条件的限制，持续活动的AIH进展为肝硬化、肝衰竭的患者临床并不少见[3-5]。在此背景下，终末期肝病的评估模型(MELD)也被引入AIH治疗的评估。Mendizabal等[38]在皮质类固醇治疗暴发性AIH的研究中发现，MELD得分低于27分且仅有轻度肝性脑病的患者在皮质类固醇治疗中能够获益。Yeoman等[6]在合并黄疸的AIH患者的皮质类固醇治疗失败的早期预测指标相关研究中发现，MELD、MELD-Na和英国终末期肝病(United Kingdom endstage liver disease，UKELD)模型的评分与治疗失败密切相关。MELD、MELD-Na和UKELD模型用于预测激素治疗失败的第7天AUC分别为0.79、0.83和0.83。也有学者[39]曾在12岁以下的儿童AIH患者人群中使用新的模型进行泼尼松和硫唑嘌呤联合治疗的一线方案的疗效预测研究。这项研究指出，较高的儿科终末期肝病(pediatric end-stage liver disease, PELD)模型评分可以预测AIH患者激素治疗失败的风险。其中预测贡献最高的参数国际标准化比值(international normalized ratio, INR)的AUC为0.72(95%CI: 0.58～0.86)。在Biewenga等[40]针对急性严重AIH患者的研究中也发现，INR≥1.5是患者皮质类固醇治疗失败进行肝移植的最佳预测因素，基线INR预测的敏感度为86%，特异度为89%；在治疗2周时，INR预测的敏感度为80%，特异度升高为96%。虽然这类模型在临床终末期AIH患者已有应用，但对于未达到肝衰竭阶段的AIH患者，这些模型或者改良后的模型能否用于皮质类固醇治疗效果评估，尚需进一步研究。

4 小结

AIH患者的预后主要取决于患者对免疫抑制疗法的反应，治疗反应良好的患者长期生存率与健康人群相当[2,5]。所以准确评估AIH进展程度，筛选需要皮质类固醇治疗的患者，评价激素治疗的效果，明确激素治疗的疗程，在AIH患者的治疗与管理中具有重要意义。新的无创技术在AIH患者纤维化的评估方面取得了较好效果，例如以TE技术和WFA(+)-M2BP检测在内的新的无创检测手段对AIH患者肝纤维的评估效果已逐渐被临床专家认可和推广。但在肝脏炎症活动度的评估方面，虽然在PD-1及其抗体和配体、miRNA和sRAGE系列产物的相关研究中都取得了不错的结果，但机制尚不完全清楚，距离临床使用尚有一定距离。而在激素的治疗效果评价与预测方面，除了上述纤维化指标和肝衰竭的预测模型评价效果较为肯定外，PD-1及其抗体和配体、sRAGE系列产物在研究中表现出较好的研究前景。由于当前的研究还非常有限，新型的无创指标能否单独或者在改良后的模型中准确的评估AIH患者肝脏炎症和纤维化程度，同时预测皮质类固醇治疗效果尚需要进一步的研究证实。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。

作者贡献声明:刘怀鄂负责文献检索及文章撰写；钱建丹、张弛、刘艺琪、李志负责文献的查找与总结；赵鸿、王贵强负责文章修改及审定。