乳酸菌发酵蓝莓汁工艺优化及功能特性研究

张晨颜，张丽霞*，魏照辉，周存山

1.江苏大学 食品与生物工程学院，江苏 镇江 212000 2.江苏省农业科学院农产品加工研究所，江苏 南京 210014

蓝莓(Vacciniumspp.)系杜鹃花科、越橘属多年生灌木小浆果果树，果实营养丰富，果肉细腻、甜酸适度，享有“水果中的皇后”之美称，富含花青素、黄酮醇、酚酸等多种活性成分。蓝莓主要分布于北半球的温带和亚热带，我国的主要产区为东北大兴安岭、山东、江苏、贵州和浙江等[1]。田密霞等[2]对60种蓝莓果的花青素含量进行了检测，发现花青素平均含量可达5.378 mg/g。蓝莓花青素具有抗炎症[3]、降血脂[4]、抗氧化[5]、抗癌[6]等多种生物活性。白沙沙等[7]利用高效液相色谱法检测出蓝莓花青素的优势单体为矢车菊色素和芍药色素。乳酸菌是一种益生菌，具有促进机体生长、维持肠道菌群平衡、改善免疫力等功能[8]。李虹甫[9]利用植物乳杆菌LJ26发酵蓝莓果汁，其活菌数达1×109CFU/mL；乳酸菌发酵能够提高桑葚汁中总花青素、酚类和类黄酮的含量，发酵后其清除DPPH自由基能力明显增强[10]。

我国蓝莓的加工利用起步较晚，开发的产品比较单一，深加工技术的滞后已成为其产业可持续发展的瓶颈问题。乳酸菌发酵被认为是最有效的保持与提高果蔬营养价值和风味的处理方式。近年来，国内外乳酸菌发酵果汁及其产品研发呈现加快趋势，主要集中在单一菌种的发酵工艺优化方面。乳酸菌发酵型蓝莓汁是一种新兴饮料，在改善蓝莓风味的同时，还大大提高了其利用率。但目前对于乳酸菌发酵蓝莓汁的技术要求尚不明确，且在发酵过程中，乳酸菌的生长易受环境影响，优化发酵工艺是蓝莓汁发挥益生作用的重要前提。目前，乳酸菌发酵对蓝莓汁抗氧化酶活、花青素单体组分与含量的影响鲜见报道。

作者选用具有自主知识产权的乳酸菌为发酵菌种制备蓝莓汁，以超氧化物歧化酶(SOD)活力为响应值，采用响应面对发酵工艺进行优化。比较分析蓝莓汁发酵过程中总酚、花青素、总糖含量、SOD酶活及活菌数的变化，研究蓝莓汁发酵前后抗氧化活性，对花青素单体组分进行结构鉴定，为蓝莓的资源开发及利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

蓝莓鲜果：句容市蓝莓种植基地；苯酚、水杨酸、硫酸亚铁、过硫酸钾、福林酚、没食子酸：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2,2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二铵盐(ABTS)、SOD酶活力检测试剂盒：上海源叶生物科技有限公司；SH-470乳酸菌：江苏省农业科学院农产品加工研究所401实验室保藏；L(+)- 抗坏血酸(VC)：西陇科学股份有限公司；果胶酶：上海蓝季科技发展有限公司。

1.2 仪器与设备

UV-1600PC紫外-可见分光光度计：上海美普达仪器有限公司；DK-8D电热恒温水浴锅：金坛市恒丰仪器制造有限公司；FE-20 pH计：梅特勒托利多(上海)有限公司；L18-Y22多功能榨汁机：九阳股份有限公司；XFS-280高压蒸汽灭菌锅：浙江新丰医疗器械有限公司；SW-CJ-1D单人净化工作台：苏州净化设备有限公司；LRH-150AE生化培养箱：上海坤权生物科技有限公司；1260高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 蓝莓汁制备与菌种活化

蓝莓汁的酶解[11]：取新鲜蓝莓果、清洗、打浆后添加0.1%果胶酶，置于50 ℃水浴锅中酶解1 h，5 000 r/min离心15 min，并用NaHCO3调节pH值为4.50，85 ℃杀菌15 min，冷却至室温后备用。乳酸菌活化[12]：将乳酸菌冻干粉接种于10%灭菌脱脂乳，37 ℃活化一定时间备用。

1.3.2 单因素试验

将蓝莓汁接入活化的乳酸菌，考察发酵时间、发酵温度、接种量、蔗糖添加量对SOD酶活性和乳酸菌活菌数的影响。

1.3.3 响应面试验设计

在单因素试验的基础上，考虑到发酵时间间隔较短，活菌数计数误差大、准确度低，最终以SOD酶活性为响应值，以发酵时间、发酵温度、乳酸菌接种量和蔗糖添加量为影响因素，进行响应面试验设计。

1.3.4 总糖含量测定

参考潘葳等[13]的方法并稍做修改，吸取1 mL稀释后的发酵蓝莓汁于试管中，依次加入1 mL 5%的苯酚溶液和5 mL浓硫酸后摇匀，70 ℃水浴15 min，冷却至室温，在490 nm处测定吸光度，计算样品中总糖含量。

1.3.5 总酚含量测定

采用Folin-Ciocalteu比色法测定总酚含量[14]。

1.3.6 花青素含量测定

参考Wrolstad等[15]的方法使用pH示差法测量蓝莓汁中总花青素含量。

式中：花青素含量以矢车菊素-3-O-葡萄糖苷计；D=D1-D2(D1=D2=D(520)-D(700)，D1为pH 1.0条件下测得，D2为pH 4.5条件下测得)；Mr为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的相对分子质量，449.2；DF为稀释倍数；V为测定溶液体系体积，mL；ε为矢车菊素-3-O-葡萄糖苷的摩尔消光系数，26 900 L/(mol·cm)；L为光程(1 cm)。

1.3.7 乳酸菌活菌数测定

参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准 食品微生物学检验 乳酸菌检验》测定乳酸菌活菌数。

1.3.8 SOD酶活性测定

SOD酶活性根据试剂盒的说明进行测定。SOD酶活性是指在反应体系中SOD抑制率达50%时所对应的酶量为1个SOD活力单位(U)。将稀释后的样品于37 ℃水浴40 min，提前预热以便后续检测。在反应体系中加入10 μL预热至37 ℃的样品，再加入10 μL显色剂，以蒸馏水为空白对照，混匀后于37 ℃孵育20 min，于波长450 nm处测定吸光值。

SOD酶活力(U/mL)=

式中：A、B、C分别为对照、测定、空白样品的吸光度。

1.3.9 抗氧化指标测定

1.3.9.1 DPPH清除率测定

参考文献[16-17]的方法并稍做修改。以VC为对照标样，测定体系中包含2 mL样品溶液和2 mL 0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液并记为A1。空白体系中用蒸馏水代替样品记为A0。对照组不加显色剂，记为A2。

1.3.9.2 ·OH清除率测定

参考文献 [18]的方法并稍做修改。以VC为对照标样，测定体系中包含3 mL不同浓度样品溶液、0.5 mL 0.9 mmol/L FeSO4、0.5 mL 0.9 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、0.5 mL 0.88 mmol/L H2O2溶液并记为A1。空白体系中以蒸馏水代替样品并记为A0。对照组不加显色剂，记为A2。

1.3.9.3 ABTS+清除率测定

参考Amoussa等[16]的方法并稍做修改。以VC为对照标样，测定体系中包含2 mL ABTS工作液和2 mL不同浓度样品溶液并记为A1。空白体系中以蒸馏水代替样品并记为A0。对照组不加ABTS工作液，记为A2。

1.3.10 高效液相色谱(HPLC)检测花青素含量

参照Zhang等[19]的方法，经HPLC检测制得标准曲线y=9.628 5x+69.654(R2=0.997 6)，y表示峰面积，x表示矢车菊素-3-O-葡萄糖苷标准品浓度。蓝莓汁样品经5 000 r/min离心15 min，取上清液，过0.45 μm膜进样检测。样品检测结果均表示为每毫升蓝莓汁中的当量矢车菊素-3-O-葡萄糖苷微克数(μg/mL)。

1.3.11 高效液相色谱-质谱(HPLC-MS)鉴定花青素组分

参照Chai等[20-21]的方法鉴定花青素组分。

1.4 数据处理与分析

采用 Excel 2010 和SPSS 23.0 进行数据处理和方差分析，并用Origin 2018 软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 发酵时间对蓝莓汁SOD酶活力和活菌数的影响

由图1可知，随着发酵时间的延长，乳酸菌活菌数呈现先增加后降低的趋势，发酵36 h达到最大值，为2.69×1010CFU/mL，发酵48 h时，乳酸菌活菌数为1.19×1010CFU/mL。SOD酶活力呈现先增加后显著降低趋势，发酵24 h时SOD酶活力达到最大值，为258.82 U/mL，随后迅速下降。发酵48 h时，SOD酶活仅为158.04 U/mL。综合考虑，选择24 h作为最佳发酵时间。

注：不同小写字母表示活菌数差异显著(P < 0.05)；不同大写字母表示SOD酶活差异显著(P < 0.05)。图2—图4同。图1 发酵时间对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响Fig.1 Effect of fermentation time on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.2 发酵温度对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响

由图2可知，随着发酵温度的升高，活菌数不断增加，超过39 ℃时，活菌数呈下降趋势。这是因为当温度超过乳酸菌的最适生长温度，加速了菌种衰老，导致活菌数下降。发酵温度为37 ℃时，SOD酶活力达到最高，为255.63 U/mL。温度为41 ℃时，SOD酶活力仅为177.21 U/mL。由此可见，发酵温度偏高或者偏低，都会对乳酸菌的生长产生不利的影响，最终导致活菌数下降以及SOD酶活降低，这与白琳等[22]的研究结果基本一致。综合考虑，选择37 ℃作为最佳发酵温度。

图2 发酵温度对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响Fig.2 Effect of lactic acid bacteria fermentation temperature on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.3 发酵接种量对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响

由图3可知，随着乳酸菌接种量增加，活菌数呈略微增加趋势。当乳酸菌接种量过多时，蓝莓汁中的营养物质不能满足过量乳酸菌生长需求[23]，反而导致活菌数降低。当乳酸菌接种量由0.02%增加到0.10%时，SOD酶活力迅速增加，并达到最大(260.49 U/mL)。当菌种接种量高于0.10%时，随着接种量增加，菌种密度过于饱和从而快速发酵，发酵液中的营养物质消耗过多，且有机酸含量增加[24]，致使发酵液中SOD酶活力下降。综合考虑，选择0.1%作为最佳乳酸菌接种量。

图3 乳酸菌接种量对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响Fig.3 Effect of inoculation amount on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.1.4 蔗糖添加量对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响

由图4可知，随着蔗糖添加量的不断增加，乳酸菌活菌数和SOD酶活性均呈先上升后下降趋势。当蔗糖添加量为6%时，发酵液中的活菌数显著增加，SOD酶活力也显著增加，乳酸菌处于适宜的发酵环境条件下，发酵效果明显增强。此时，活菌数最高，SOD酶活最高(260.24 U/mL)。当蔗糖添加量高于6%时，由于果汁的渗透压增加，超过乳酸菌对渗透压的抵抗能力，过高的糖含量抑制了菌种生长和代谢，不利于乳酸菌的生长[25]。综合考虑，选择蔗糖的最佳添加量为6%。

图4 蔗糖添加量对蓝莓汁SOD酶活性和活菌数的影响Fig.4 Effect of sucrose addition on SOD enzyme activity and viable bacteria number of blueberry juice

2.2 响应面试验

在单因素基础上，以SOD酶活力(Y)为指标，A发酵时间、B发酵温度、C乳酸菌接种量和D蔗糖添加量为影响因素进行响应面试验，试验设计及结果见表1，方差分析见表2。

表1 Box-Behnken 试验结果与分析Table 1 Results and analysis of Box-Behnken test

利用 Design-expert 8.0.5 Trial 数据处理软件中 ANOVA 程序对表2进行二次回归分析，可得回归方程(模型)：

Y=261.47-1.60A+5.95B-5.50C-1.48D-27.79AB-37.96AC+3.49AD+1.16BC+0.48BD-7.00CD-25.67A2-32.04B2-25.97C2-30.27D2。

由表2可知，模型极显著(P<0.000 1)，且R2>0.9，失拟项F检验不显著(P>0.05)，回归方程拟合度好。二次项A2、B2、C2、D2和交互项AB、AC、CD对结果影响极显著(P<0.01)，其他交互项均不显著(P>0.05)。表明各因素对抗氧化酶活力的影响呈二次关系，且4个因素之间存在交互作用。

表2 方差分析Table 2 Analysis of variance of response surface test results

2.3 验证试验

对所得回归方程进行逐步回归，确定最佳发酵工艺参数为发酵时间23.38 h、发酵温度37.21 ℃、接种量0.1%、蔗糖添加量5.97%，此时发酵蓝莓汁的SOD酶活力预测值为262.04 U/mL，为了便于实际操作，将发酵工艺参数修改为发酵时间24 h、发酵温度37 ℃、接种量0.1%、蔗糖添加量6%，在此最优发酵工艺条件下，发酵蓝莓汁的SOD酶活力为261.63 U/mL，活菌数为2.18×1011CFU/mL，与模型预测值较一致，验证模型可靠，回归方程可用于实践中。

2.4 乳酸菌发酵对蓝莓汁营养功能的影响

由表3可知，蓝莓汁经发酵后含糖量显著降低，总酚和花青素含量显著增加。这可能是发酵过程中大分子酚类物质在乳酸菌释放的水解酶类作用下被分解为小分子的酚类物质。同时，一些与蛋白质和多糖结合的酚类物质也被释放出来[26]。发酵后的蓝莓汁抗氧化活性高于鲜榨果汁，其DPPH自由基清除率达到99.40%，高于VC。发酵后蓝莓汁对ABTS+和·OH自由基清除率显著增加(P< 0.05)，这可能是与发酵蓝莓汁的总酚和总花青素含量增加有关[27]。包怡红等[28]对蓝靛果米糠酵素中总酚和抗氧化活性进行了相关性分析，结果显示总酚含量越高，其清除自由基能力也越强，与本研究结果一致。

表3 乳酸菌发酵对蓝莓汁营养功能的影响Table 3 Effect of lactic acid bacteria fermentation on nutritional function of blueberry juice

2.5 乳酸菌发酵对蓝莓汁花青素单体的影响

采用HPLC-MS检测发酵蓝莓汁花青素单体的含量及成分，结果见表4。由表4可知，蓝莓汁中主要含有13种花青素单体。主要成分峰10(tR=28.74 min)在m/z493.1和331出现片段离子，由此推断为锦葵色素衍生物，中性碎片162的丢失与己糖分子量符合。据文献[29]报道，推测峰10为锦葵色素-3-O-半乳糖苷。峰3(tR=23.394 min)的分子离子峰为m/z449.2，碎片离子为m/z287，是由m/z449失去一个质量数为162的中性碎片而形成。132正是五碳糖(150)和花青素成苷时失去1分子水时的质量数，和峰1的花色苷一样，只有1个糖时，成苷位置在3位，据此推测峰3为矢车菊素-3-O-半乳糖苷。

表4 蓝莓汁发酵过程中花青素单体成分和含量分布Table 4 Composition and content distribution of anthocyanin monomer during blueberry juice fermentation

将这些花色苷的分子离子峰及碎片离子与花青素标准样品及文献数据对照，鉴定出峰10、峰3和峰13分别为锦葵色素-3-O-半乳糖苷、矢车菊素-3-O-半乳糖苷和锦葵色素-3-O-葡萄糖苷。以此类推，峰1—2、峰4—9，峰11—12依次被鉴定，如表4所示。3种含量相对较高的花青素单体成分为锦葵色素-3-O-半乳糖苷(50.99 μg/mL)、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷(22.69 μg/mL)和矢车菊素-3-O-半乳糖苷(11.94 μg/mL)。

由表4可知，乳酸菌发酵蓝莓汁过程中，单体花青素组分种类未发生变化，但单体花青素含量显著变化。其中，有6种单体花青素组分含量随发酵时间的延长呈现先增加后降低的趋势，有4种单体花青素组分含量随发酵时间的延长而降低，有3种单体花青素组分含量呈现随发酵时间延长而显著增加趋势。含量相对最高的花青素单体成分锦葵色素-3-O-半乳糖苷(tR=28.740 min)含量显著增加，发酵前含量为50.99 μg/mL，发酵24 h时含量达最大值(59.59 μg/mL)，与发酵前相比增加16.87%，发酵28 h后呈下降趋势。其他两种主要成分锦葵色素-3-O-葡萄糖苷(tR=31.006 min)和矢车菊素-3-O-半乳糖苷(tR=23.394 min)，随发酵时间延长含量显著降低，发酵前含量分别22.69、11.94 μg/mL，发酵48 h时仅为17.00、8.14 μg/mL，分别为发酵前的74.92%、68.17%。Nie等[30]用干酪乳杆菌、鼠李乳杆菌和植物乳杆菌混合发酵蓝莓浆，并探究了发酵蓝莓中花青素含量和结构变化，发酵后的蓝莓中花青素含量降低，蓝莓中的酰化和糖基化程度相对较低(均为3-O-单糖苷)，花青素的丢失也可能是由于这种轻微的酰化和糖基化。

相反，矢车菊素-3-O-葡萄糖苷(tR=24.797 min)和矮牵牛素-3-O-葡萄糖苷(tR=26.370 min)的含量随发酵延长呈现增加趋势，发酵28 h时分别为2.29、9.22 μg/mL。Zhang等[31]利用植物乳杆菌J26对蓝莓汁发酵，发现发酵后蓝莓汁中花青素含量增加，推测花青素含量增加是由植物乳杆菌J26的生物转化引起的，乳酸菌产生的酶能将复杂的类黄酮物质分解成更简单的化合物。在发酵桑葚汁中也有相似的结果，发酵后的桑葚汁中花青素含量增加[32]。有研究表明，花青素的增加也可能与发酵动力学有关，Versari等[33]研究了发酵过程中浸渍时间对花青素浓度的影响，位于葡萄皮中的花青素随浸渍时间的延长逐渐被提取，且花青素含量随时间增加而增加，直至稳定期后迅速下降。由此可见，选择合适的发酵工艺能够有效提高蓝莓汁花青素含量。

3 结论

乳酸菌SH-470适合制备发酵型蓝莓汁，接种量、发酵温度与时间均影响蓝莓汁抗氧化酶活力与活菌数。响应面结果表明回归模型具有显著性，发酵温度、乳酸菌接种量以及接种量和发酵时间、发酵时间和温度、乳酸菌接种量和蔗糖添加量的交互作用对抗氧化酶活力有显著影响。乳酸菌发酵蓝莓汁的最优条件：发酵时间24 h、发酵温度37 ℃、接种量0.1%、蔗糖添加量6%，该条件下SOD酶活力为 261.63 U/mL，总酚含量为413.40 mg/L，总花青素含量为206.40 mg/L，活菌数为2.18×1011CFU/mL。与发酵前相比，发酵后蓝莓汁抗氧化活性显著增强，DPPH清除率达到了99.40%。

经分析，蓝莓汁中单体花青素组分为13 种，含量相对较高的花青素单体成分为锦葵色素-3-O-半乳糖苷、锦葵色素-3-O-葡萄糖苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷。乳酸菌发酵蓝莓汁过程中，单体花青素组分种类未发生变化，含量变化显著。其中，锦葵色素-3-O-半乳糖苷含量显著增加，发酵24 h时为59.59 μg/mL，与发酵前相比增加16.87%。研究结果可为蓝莓资源综合利用提供理论依据。本研究探讨了发酵对蓝莓汁活性物质和抗氧化活性的影响，然而产品的外观和口感也直接影响消费者对产品的选择，因此后续研究可对发酵蓝莓汁口感等感官指标进一步调配和改善。