火针对坐骨神经损伤大鼠脂肪酸合酶基因启动子区H3K27乙酰化水平的影响

王玲姝,张宇,李冠男,李孟

(1.黑龙江中医药大学附属第一医院,哈尔滨 150040;2.黑龙江中医药大学,哈尔滨 150040;3.黑龙江中医药大学药学院,哈尔滨 150040)

坐骨神经损伤是指坐骨神经或其分支在外力作用下出现损伤,是一种常见的周围神经损伤(peripheral nerve injury, PNI)病变[1]。因其分布表浅,缺乏骨性结构的保护,在外伤、手术等因素的影响下容易导致神经纤维或轴突挤压、断裂,引起运动、感觉或自主神经功能障碍,甚至出现神经支配的相应肌肉发生萎缩,严重影响患者的日常生活质量[2]。与中枢神经损伤不同的是,PNI在一定条件下具有较强的再生能力。但是这种再生能力受到内在或外周各种因素的制约,其功能恢复不尽如人意[3]。火针作为针灸九针之一,对PNI后功能恢复效果确切[4-5]。有研究[6]表明脂肪酸合酶(fatty acid synthase, FASN)可参与PNI修复过程。近年随着表观遗传研究的不断深入,越来越多的研究证实组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)与带负电荷的DNA紧密结合,可抑制基因的转录[7]。表观遗传修饰在 PNI修复过程中起到了重要作用[8]。本实验选用坐骨神经压榨损伤大鼠模型,深入研究火针对组蛋白乙酰化修饰的影响,以期为火针治疗坐骨神经损伤提供有效的理论和实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级成年雄性SD大鼠72只,6～8周龄,体质量(200±20)g,由黑龙江中医药大学动物实验中心提供。实验过程中对动物的处置均符合 2006年国家科技部发布的《关于善待实验动物的指导性意见》的相关规定。动物饲养的环境温度为(22±3)℃,湿度为(50±10)%,自然光照,自由进食及进水(实验过程中必要的禁食禁水要求除外),于黑龙江中医药大学实验室适应性饲养1周。

1.2 主要仪器及试剂

贺氏钨钢火针(0.35 mm×40 mm),精密电子秤(亚津公司,T410I型),电子天平(上海横平公司),台式冷冻离心机(上海菲恰尔分析仪器有限公司),小型Western电泳仪系统(美国Bio-Rad公司),凝胶扫描成像系统(Thermo Fisher公司),细胞超声破碎机(新芝生物),Donatello型脱水机(DIAPATH),JB-P5型包埋机(武汉俊杰电子有限公司),RM2016型组织摊片机(浙江省金华市科迪仪器设备有限公司),TSY-B型脱色摇床(Servicebio公司);免疫组化试剂盒、DAB显色剂(Servicebio公司),抗FASN抗体(bsm-51155M)、抗HDAC1抗体(bs-24447R)、抗H3K27ac抗体(bs-7451R)(北京博奥森生物科技有限公司),DNA纯化试剂盒、RNA逆转录试剂盒(北京索莱宝科技有限公司),微量RNA提取试剂盒(Thermo Fisher公司)。

1.3 动物分组及造模

采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、模型组和火针组,每组24只。造模前24 h对大鼠进行禁食处理。大鼠称重后腹腔注射麻醉,右侧后肢备皮,碘伏消毒,沿臀股交界至膝关节连线处剪开1.5 cm皮肤,眼科直剪钝性分离股二头肌后暴露坐骨神经,采用止血钳(20 cm)进行钳夹损伤,钳夹时止血钳卡在第3个卡扣上造成2～3 mm损伤。每次钳夹10 s,休息10 s后再次进行钳夹操作,重复进行3次。钳夹完成后肉眼可见损伤处神经呈透明状,仅有神经外膜连接。4-0缝合线逐层缝合肌肉、皮肤,并肌肉注射青霉素钠以抗感染,术后24 h禁食。模型组与火针组采取相同方法造模,假手术组仅暴露坐骨神经,不作钳夹处理。形态学以大鼠损伤侧下肢出现无力、拖拽、足趾挛缩、重心转移等为造模成功标志[9]。全部模型均由同一人制备,采用同样制备方法,保持损伤程度一致。

1.4 干预方法

造模成功24 h后开始进行火针治疗。参照《实验针灸学》[10]中对大鼠的穴位定位,穴位取右侧患肢环跳和委中。环跳定位于后肢髋关节后上缘,委中定位于后肢腘横纹中线。大鼠采取俯卧位,用鼠套固定四肢及头部。剪去穴位处被毛,充分暴露患侧后肢以便取穴,同时在穴位上涂一层薄层万花油。采用0.35 mm×40 mm钨钢火针进行针刺,手持针柄在乙醇灯内火焰将针尖烧至变红,稍离退火,然后将针尖至外火焰再次加热后立即刺入大鼠右侧患肢环跳、委中,刺入深度4～6 mm,留针 30 s后拔针,拔除火针即刻用干棉球按压针孔2～3 s,间隔60 s后再重复针刺1次,隔日1次,2周为1个疗程,共治疗7次,共14 d。假手术组、模型组于相同时间内给予抓取固定,但不进行火针干预。

1.5 样本处理

3组分别于治疗前、治疗后取材,各取材12只大鼠,取坐骨神经损伤处上下各约0.5 cm,共1 cm的损伤段坐骨神经进行检测。

1.6 观察指标

1.6.1 坐骨神经功能指数(sciatic functional index, SFI)检测[11]

治疗后进行行为学检测。自制大鼠足印行走箱(长宽高为50 cm×10 cm×15 cm),一侧为鼠笼,另一侧封闭,在箱底部铺放白纸。将大鼠后足蘸满墨水后,由封闭端走向鼠笼,每侧足迹以7～8个为宜。标记大鼠右侧患侧足为 E,左侧正常侧足为 N。计算足印长度(print length, PL)、足趾宽度(toe spread, TS)、中间足趾距离(inter-toes distance, IT),反复测量3次,取平均值。使用Bain公式将以上3个实验变量进行计算,计算出SFI值。坐骨神经指数以SFI＝0为正常,SFI＝-100为神经完全损伤。Bain公式为SFI＝-38.3(PLE-PLN)/PLN＋109.5(TSE-TSN)/TSN＋13.3(ITE-ITN)/ITN-8.8。

1.6.2 免疫组化检测FASN蛋白表达

取材后制备石蜡切片,放入二甲苯、梯度乙醇溶液脱蜡至水,PBS溶液洗3次,每次5 min,枸橼酸钠缓冲液进行抗原修复,血清封闭后,按1:500比例加入一抗、1:10 000加入二抗,DAB显色、苏木素复染细胞核后脱水封片,显微镜下观察。成像完成后使用 Image-Pro Plus 6.0分析软件,分别测量每张切片中3个视野阳性累积光密度值(IOD)及对应组织面积(Area);并计算出平均光密度＝IOD/Area。

1.6.3 Western blot法检测HDAC1蛋白表达

取材后细胞裂解法提取细胞蛋白,BCA法测定蛋白浓度,以β-actin作为内参,配置SDS-PAGE后进行电泳,转膜,封闭后按 1:1 000比例加一抗在 TBST中 3次清洗膜10 min,孵育一抗过夜,在室内下按1:10 000比例二抗孵育,然后显影。胶片晾干后进行扫描,以Image J图像分析软件进行光密度分析。

1.6.4 染色质免疫共沉淀法检测 FASN启动子区H3K27乙酰化水平

组织室温状态下用1%的多聚甲醛固定10 min,冰上进行超声裂解和染色质提取,时间设置为20 min,将交联的 DNA片段剪切为 200～1 000 bp长度。利用H3K27ac特异性抗体与该蛋白结合并免疫沉淀该蛋白及DNA复合物,加入30 µL ProteinA/G Sepharose回收复合物,加入不含DNase的RNase和蛋白酶K,65 ℃保温6 h以上,使交联逆转。交联逆转后用QIAquick DNA纯化回收DNA,利用PCR扩增技术检测沉淀的DNA样本。

1.7 统计学方法

采用SPSS22.0统计软件进行数据处理。符合正态分布的计量资料用均数±标准差表示,比较采用单因素方差分析,不符合正态分布采用秩和检验,运用Kruskal-Wallis法进行两两比较。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 3组大鼠不同时间点SFI评分比较

造模成功后,与假手术组比较,模型组、火针组SFI评分明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01),提示造模成功;治疗后,与治疗前比较,模型组 SFI评分升高(P＜0.01),说明坐骨神经损伤后,周围神经存在一定的自我修复的能力;与模型组比较,火针组SFI评分明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),说明火针能明显改善损伤大鼠的神经功能指数,促进其运动功能的恢复。详见表1。

表1 3组大鼠不同时间点SFI评分比较 (±s,分)

表1 3组大鼠不同时间点SFI评分比较 (±s,分)

注:与假手术组比较 1)P＜0.01;与模型组比较 2)P＜0.01;与同组治疗前较3)P＜0.01。

组别 n 治疗前 治疗后假手术组 12 -5.75±3.05 -4.25±2.51模型组 12 -88.56±3.121) -66.78±3.201)3)火针组 12 -87.65±3.911) -35.77±4.721)2)3)

2.2 3组大鼠不同时间点FASN蛋白表达比较

治疗前,与假手术组比较,模型组、火针组 FASN蛋白表达明显降低,差异有统计学意义(P＜0.01);治疗后,与模型组比较,火针组FASN蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01),提示火针能明显上调大鼠坐骨神经损伤处FASN蛋白表达。详见表2和图1。

表2 3组大鼠不同时间点FASN蛋白表达比较 (±s)

表2 3组大鼠不同时间点FASN蛋白表达比较 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01。

组别 n 治疗前 治疗后假手术组 8 0.0142±0.0017 0.0138±0.0019模型组 8 0.0047±0.00111) 0.0035±0.00081)火针组 8 0.0041±0.00211) 0.0091±0.00131)2)

图1 各组大鼠不同时间点FASN蛋白的表达比较

2.3 3组大鼠不同时间点HDAC1蛋白表达比较

治疗前,与假手术组比较,模型组、火针组 HDAC1蛋白表达明显升高,差异有统计学意义(P＜0.01);治疗后,与模型组比较,火针组HDAC1蛋白表达明显下降,差异有统计学意义(P＜0.01),说明火针能抑制大鼠坐骨神经损伤处HDAC1蛋白表达。详见表3和图2。

表3 3组坐骨神经损伤点HDAC1的蛋白表达 (±s)

表3 3组坐骨神经损伤点HDAC1的蛋白表达 (±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01。

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图2 治疗后各组坐骨神经组织中HDAC1蛋白条带图

2.4 3组大鼠不同时间点FASN基因启动子区H3K27乙酰化水平比较

治疗前,与假手术组比较,模型组、火针组 FASN基因启动子区 H3K27ac丰度值升高,差异有统计学意义(P＜0.01);治疗后,与模型组比较,火针组 FASN基因启动子区 H3K27ac丰度值明显上升,差异有统计学意义(P＜0.01),说明火针能提高大鼠坐骨神经损伤处FASN基因启动子区H3K27ac水平。详见表4。

表4 3组大鼠不同时间点FASN基因启动子区H3K27ac水平(±s)

表4 3组大鼠不同时间点FASN基因启动子区H3K27ac水平(±s)

注:与假手术组比较1)P＜0.01;与模型组比较2)P＜0.01。

组别 n 治疗前 治疗后假手术组 4 201.6±36.7 203.5±35.2模型组 4 260.6±27.51) 217.6±33.11)火针组 4 246.1±26.31) 253.6±23.71)2)

3 讨论

坐骨神经损伤(SNI)后其受损神经所支配区域会出现肢体疼痛、肌肉萎缩、感觉消失等症状。中医学将此类病症称为“冷痹”“风湿痹痛”,因此,SNI以疏通经络、散寒祛湿、调和阴阳为主要治疗原则[12]。火针结合了传统的针灸和温热疗法,兼具“针”和“灸”之力,既有针刺的刺激作用,又具备火的温热作用,其能“以火之力、焠通经络、爆动气血”,从而达到温热通经、畅通气血、散寒止痛、平衡阴阳的作用[13]。本课题组的临床应用及对已有文献的回顾均发现火针对神经系统损伤后运动功能的恢复有显著作用[14-15]。在各种穴位的选择中,环跳和委中是临床常用的穴位[16-17]。环跳位于足少阳胆经,是足少阳经与足太阳经交会穴,古人认为环跳阳气旺盛,针刺可激发穴位之经气,驱散寒湿之阴邪;委中为足太阳膀胱经之合穴,足太阳经少气多血,又有“血郄”之称,久病必瘀,瘀血不去则新血不生,针刺之则疏调经气,去瘀生新,通而不痛[18-19]。二者均位于坐骨神经走行区域,根据中医学理论,既是局部取穴又是循经取穴,达到活血行气、疏通经络的作用。本研究结果显示,火针干预14 d后可以明显改善坐骨神经功能指数,且与模型组比较差异有统计学意义,说明火针能促进神经功能恢复。

在 PNI后神经再生的修复过程中,髓鞘和雪旺细胞(schwann cells, SCs)均起到了重要的作用[20-23]。大量SCs包裹形成髓鞘,组成周围神经轴突。髓鞘具有保护神经元、维护神经系统功能稳定、增强轴突传导的作用[24-25]。PNI后,损伤部位再生的轴突被SCs重新包裹形成新的髓鞘,髓鞘的形成及其维持结构稳定性需要大量的脂肪酸[26-27],脂肪酸合成途径中的关键酶即为FASN,因此FASN是脂肪酸形成髓鞘的一个潜在的关键过程,也是维持 SCs内在活性必不可少的关键酶[26]。组蛋白乙酰化修饰在SCs的生长发育、维持神经系统的完整性以及损伤后的髓鞘再形成过程中发挥关键作用[28-29],HDAC1属于去乙酰化转移酶家族中的I类去乙酰化转移酶,主要作用之一是使组蛋白去乙酰化,同时组蛋白 H3K27为组蛋白乙酰化中最著名的表观遗传学标记之一,其富集在活化基因启动子区域,与基因表达具有强烈相关性[30-32],二者均在组蛋白乙酰化修饰的过程中发生变化。

本研究结果证实坐骨神经损伤大鼠火针治疗后FASN蛋白表达升高,而HDAC1蛋白表达降低使FASN基因启动子区H3K27ac水平升高,说明在火针的干预下,坐骨神经损伤大鼠 HDAC1蛋白表达下降,促进了坐骨神经损伤大鼠FASN基因启动子区H3K27乙酰化修饰,使FASN基因处于转录激活状态,相应FASN蛋白表达水平升高;因此,可以认为火针抑制了坐骨神经损伤大鼠HDAC1的表达,乙酰化作用于 FASN基因启动子区的H3K27,进而促进了组蛋白的乙酰化程度,增加了 FASN的转录,从而影响神经功能重塑。