赣江南昌段丰、枯水期氨氧化微生物群落结构分析*

宋凯伦 汪丽娜 林益寰 周春火 谭泽彬 高阳慧 王亚丽 尹 鑫#

(1.江西农业大学国土资源与环境学院,江西 南昌 330045;2.九江市永修县生态环境局,江西 九江 330300)

随着江西地区工业的迅速发展,生产过程中产生的工业废水和居民生活污水的产生量及排放量与日俱增,其中含有大量的氮磷、有机物及重金属等污染物[1]。赣江作为江西省最大的河流,接收了全省大部分的污染废水,使得水体中大量的氮磷淤积在河道底泥中,造成的水体污染问题将直接影响周边群众的用水安全[2-3]。河流底泥微生物群落结构长时间受到河流环境影响,其群落结构特征反映了河流在一段时间内的环境变化[4],当水体碳、氮、磷污染较重时,往往伴随着丰度更高的微生物群落[5]。研究人员发现,在不同时期,河流水文特征，理化性质，河流浮游植物、鱼类群落结构及微生物群落结构都会受到较大影响[6-7]。之前有学者研究过赣江下游水体中微生物群落特征[8],但对赣江南昌段枯、丰水期底泥中的氨氧化微生物群落结构变化的研究相对缺乏。

在河流底泥的氮素污染降解过程中,氨氧化作为整个硝化作用的第一部分,其速率至关重要,氨氧化速率又取决于氨氧化古菌(AOA)和氨氧化细菌(AOB)的丰度及活性等因素[9]。其中氨氧化作用主要由变形菌纲中的AOB和奇古菌门中的AOA完成[10]。目前,有大量学者报道了河流底泥中AOA和AOB在硝化过程中的重要地位[11]。氨氧化功能微生物是水体富营养化的重要指示生物,也是水体自净能力的标志性微生物。赣江南昌段是南昌的主要饮用水源地,研究赣江南昌段丰、枯水期时空变化对底泥氨氧化微生物的影响,可作为水质检测的重要辅助手段[12],对南昌居民饮用水水质安全及赣江南昌段水环境保护具有重要意义。本研究为探索赣江水体富营养化和氮素循环过程提供了理论依据和数据支撑。

本研究在赣江南昌段枯、丰水期采取样品,基于氨氧化微生物16S rDNA基因及功能基因的高通量测序技术,探究了枯、丰水期赣江底泥中氨氧化微生物的丰度及群落结构,以及氨氧化微生物群落结构特征变化及与环境因子间的响应关系。

1 实验部分

1.1 采样点分布及样品采集

赣江流经赣抚平原后贯穿南昌市,南昌市地形以鄱阳湖平原为主,东南区域平坦,西北部为丘陵地段,赣江把南昌市划分为“一江两岸”的格局,流经南昌市城区后分北支、中支、南支注入鄱阳湖,北支流经部分新城区和城郊农业区,南支环绕老城区及高新技术开发区,中支主要流经城郊农业区[13]。流域内气温变化大,为亚热带湿润季风气候,降水丰富但分布不均,丰、枯水期的区分较明显。目前关于赣江南昌段水环境的研究主要基于野外采样、统计年鉴或水质模型分析水体污染程度。现有研究表明,赣江南昌段水质总体较好,南支污染相对较重[14]。在阅读相关文献及实地调研[15-16]的基础上,确定了赣江南昌段样品的采集范围,并沿途设置了5个采样点(见图1),于2019年12月(枯水期)和2020年7月(丰水期)采集,并将丰、枯水期样品分别标记为W1～W5、J1～J5。在采样区0～20 cm取底泥,装在经过灭菌的自封袋中,带回实验室在-20 ℃中保存供分子生物学分析,部分样品保存于4 ℃以供后续理化性质分析。

图1 采样区域地理位置及采样点示意图Fig.1 Geographic location of sampling area and sampling points diagram

1.2 材料与方法

1.2.1 理化性质测定方法

每个底泥样品环境指标测定设置3个重复[17]。pH采用玻璃电极法测定,氨氮采用纳氏试剂光度法测定,硝态氮采用离子色谱法测定,总氮采用半微量凯氏定氮法测定。以上的样品采集、保存、运输和分析均按照文献[18]的方法进行。

1.2.2 脱氧核糖核酸(DNA)提取与高通量测序

采用NovaSeq PE250平台对赣江底泥样品进行高通量测序,目标基因及主要引物见表1,实验流程：DNA提取与检测、聚合酶链式反应(PCR)扩增、产物纯化、文库制备与质检和上机测序。由杭州联川生物技术股份有限公司对基因进行测序。扩增子文库大小由生物分析仪(AGJlent 2100)测定。

表1 赣江底泥氨氧化微生物的主要引物Table 1 The main primers involved in the experiment

1.3 统计与分析

所有数据利用SPSS软件进行单因素ANOVA分析和显著性分析,微生物丰度及沉积物环境因子采用R语言进行冗余分析,使用Origin 2019软件进行相关图表的绘制。

2 结果与分析

2.1 赣江南昌段底泥化学环境

由表2可见,赣江枯水期底泥pH为6.51～7.94,总氮为0.59～1.43 g/kg,硝态氮为1.43～2.15 mg/kg,氨氮12.47～30.20 mg/kg;丰水期的pH为6.51～7.81,总氮为1.00～2.60 g/kg,硝态氮为2.72～35.29 mg/kg,氨氮为7.41～82.05 mg/kg。枯水期,J5的氨氮、硝态氮最高,J4的总氮最高;丰水期,W5的硝态氮、总氮最高,W2的氨氮含量最高。环境因子的变化规律表明,赣江水体和底泥理化性质有明显变化,这主要是受人类活动的影响。

2.2 氨氧化微生物群落结构

2.2.1 氨氧化微生物群落多样性和丰度分析

针对一个特定区域内的生物群落多样性,通常对其样本中物种数量、丰度和均匀度,采用Alpha多样性进行分析,主要通过Observed OTUs、Chao1指数、样本覆盖率、香农指数和辛普森指数等来反映物种丰富度、均匀性及测序深度。群落中丰度大于0的物种数之和,一般用Observed OTUs表示。Chao1指数主要反映样本的物种丰富度信息。样本覆盖率越高,则样本中新物种没有被测出的概率越低,反映测序结果是否代表样本的真实情况。辛普森和香农指数主要综合体现物种的丰富度和均匀度。香农指数越大,表示不确定性越大,即这个群落中未知的因素越多,也就是多样性越高。辛普森指数范围为0～1,当群里只有一种物种时,辛普森指数最小为0,即多样性最小;当物种种类无限多,并且每个物种数目都一致(均匀度最高)时,辛普森指数最大为1。基于功能基因扩增子高通量测序OTUs水平的AOA、AOB及Anammox群落多样性见表3,其中J4样品在Anammox群落结构的Alpha多样性质检不合格,不参与分析,因此在冗余分析中仅针对氨氮、总氮及pH进行讨论。枯、丰水期中样本覆盖率均为1.00,且辛普森指数接近于1,说明能代表真实情况,且物种均匀度良好。

丰水期,AOA的Chao1、香农指数均值分别为600.91、4.64;AOB的Chao1、香农指数均值分别为788.21、4.35;Anammox的Chao1、香农指数均值分别为408.26、4.25。枯水期,AOA的Chao1、香农指数均值分别为871.64、5.11;AOB的Chao1、香农指数均值分别为611.70、4.83;Anammox的Chao1、香农指数均值分别为382.87、4.52。进一步分析得到,丰水期时物种丰富度最大的为AOB,在枯水期时AOA更大,而物种多样性在枯、丰水期时均为AOA大于AOB,而Anammox在枯、丰水期物种丰富度及多样性都最小。

由表4可知,丰水期AOA共有2个菌属,相对丰度均大于1%,其中亚硝化球菌属相对丰度达98.18%,为优势菌属;枯水期共有3个菌属,其中亚硝化球菌属相对丰度达98.33%,为优势菌属。丰水期AOB共有5个菌属,其中2个菌属相对丰度大于1%,即亚硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属;枯水期AOB群落均为变形菌门,共有2个菌属,且相对丰度均大于1%,即亚硝化单胞菌属和亚硝化螺菌属。丰水期Anammox有4个菌属,即Candidatusbrocadia、Candidatusjettenia、Candidatuskuenenia和Candidatusscalindua;枯水期有2个菌属,即Candidatusbrocadia和Candidatusjettenia。

表2 枯、丰水期底泥的性质1)Table 2 Properties of sediment samples in dry and wet seasons

表3 基于功能基因扩增子高通量测序OTUs水平的AOA、AOB及Anammox群落多样性Table 3 Community diversity of AOA,AOB and Anammox based on high-throughput sequencing of functional gene amplicons at OTUs level

表4 枯、丰水期AOA、AOB、Anammox的样品相对丰度(属水平)Table 4 Relative abundance of AOA,AOB and Anammox in dry and wet seasons (genus level)

2.2.2 氨氧化微生物群落与环境因子的相关性分析

枯、丰水期AOA、AOB、Anammox的冗余分析见图2,其中第一冗余分析组分(RDA1)和第二冗余分析组分(RDA2)分别解释了赣江南昌段在枯、丰水期氨氧化微生物群落组成的总变异量。

丰水期,AOA中RDA1和RDA2分别为99.40%和0.60%,结果可在一定程度上解释细菌群落结构与环境因子之间的联系。5个采样点分布在4个象限中,说明5个采样点的理化性质变化较明显。亚硝化球菌属与pH、硝态氮、总氮呈正相关,与氨氮呈负相关;Candidatusnitrosocosmicus与总氮、pH、硝态氮呈负相关,与氨氮呈正相关。进一步分析可知,总氮与丰水期底泥的AOA群落结构的相关性较大,是丰水期AOA群落结构的关键影响因子。枯水期,RDA1和RDA2的贡献值分别为52.24%和39.62%,可在一定程度上解释细菌群落结构与环境因子之间的联系。5个采样点在3个象限中,说明5个采样点的理化性质存在一定的变化。亚硝化球菌属与氨氮、pH、硝态氮呈正相关，与总氮呈负相关；而Candidatusnitrosocaldus与氨氮呈正相关，与其他环境因子呈负相关。总氮在4个环境因子中与枯水期底泥AOA群落结构的相关性较大,是枯水期AOA群落结构的关键影响因子。

图2 枯、丰水期AOA、AOB、Anammox的冗余分析Fig.2 Redundancy analysis of AOA,AOB and Anammox in dry and wet seasons

丰水期,AOB中RDA1和RDA2贡献值分别为96.63%和3.37%,结果可较好解释细菌群落结构与环境因子之间的联系。5个采样点分布在3个象限中,其中亚硝化螺菌属与4个环境因子呈正相关，亚硝化单胞菌属与4个环境因子呈负相关。其优势属为亚硝化单胞菌属,总氮与氨氧化微生物群落结构相关性较大,是丰水期AOB群落结构关键影响因子。枯水期,RDA1和RDA2的贡献值分别为60.95%和39.05%,结果可在一定程度上解释细菌群落结构与环境因子之间的联系。5个采样点分布在3个象限中。亚硝化单胞菌属与硝态氮呈正相关,与总氮、氨氮、pH呈负相关;亚硝化螺菌属与氨氮、pH呈正相关,与总氮、硝态氮呈负相关。优势属为亚硝化单胞菌属,总氮是枯水期AOB群落结构的关键影响因子。

丰水期,Anammox中RDA1和RDA2的贡献值分别为69.28%和30.72%。其中氨氮、pH在4个环境因子中与Anammox群落结构的相关性较大,是丰水期的关键影响因子。Candidatusbrocadia与氨氮呈负相关,与pH、硝态氮、总氮呈正相关;Candidatuskuenenia与氨氮、硝态氮、总氮呈正相关,与pH呈负相关。Candidatusbrocadia为优势属。枯水期,RDA1和RDA2的贡献值分别为99.88%和0.12%。总氮与枯水期Anammox群落结构的相关性较大,是Anammox群落结构的关键影响因子。Candidatusbrocadia与pH呈正相关,与氨氮、总氮呈负相关,而Candidatusjettenia则相反。Candidatusbrocadia为优势属。

3 讨 论

(1) 受人类活动的影响,赣江北支与南支污染程度较严重,赣江分支口以及中支相对较好,底泥丰水期中各物质浓度高于枯水期。针对底泥重金属含量进行分析,结果表明,含量未超过江西省背景值,枯、丰水期差异较小,与李凤果[23]研究一致,且发现低浓度重金属含量对氨氧化微生物群落结构影响较小[24],因此在本研究中未展开讨论。

(2) 丰、枯水期微生物群落结构会发生一定变化,底泥微生物群落结构受到河流污染的影响。赣江底泥枯水期的Chao1指数显示的物种丰富度顺序为AOA>AOB>Anammox,而丰水期为AOB>AOA>Anammox。本研究枯水期各物种丰度与CAO等[25]对珠江流域、邹雨璇等[26]对黄河故道等一些淡水生态系统中底泥的研究结果一致;此外,在红树林[27]、镇江[28]、青海湖[29]底泥中也证实丰水期时,AOB的丰度大于AOA。根据香农指数,枯、丰水期的物种多样性排序均为AOA>AOB>Anammox。这表明不同时期赣江底泥中氨氧化微生物的主要类群不同。

(3) AOB群落在丰、枯水期时其优势属都为亚硝化单胞菌属,这与研究者们在淡水湿地环境研究中得到的结果相同[30],且有研究表明,枯水期时,亚硝化单胞菌属偏向于低氨氮环境,而亚硝化螺菌属更适应高氨氮的污染环境[31]。研究结果显示,亚硝化单胞菌属含量更多,这表明赣江底泥环境中为低氨氮环境。丰水期时,AOA有亚硝化球菌属和Candidatusnitrosocosmicus,其主要类群为亚硝化球菌属。BOLLMANN等[32]研究表明,高营养湖泊沉积物中的AOA群落以亚硝化球菌属为主。这表明,赣江底泥中营养物质浓度较高。AOA群落在枯水期有3个属(亚硝化球菌属、Candidatusnitrosocosmicus和Candidatusnitrosocaldus)。Anammox群落在枯水期有2个属群(Candidatusbrocadia和Candidatusjettenia);丰水期有4个属,其主要类群为Candidatusbrocadia,研究表明,该菌属具有高生长速率和低底物亲和力,在黄河水体、土壤中均存在。

(4) 不同时期AOA、AOB、Anammox群落结构不相同且关键影响因子不相同,枯、丰水期AOB群落结构的关键影响因子都为总氮,与其关键属亚硝化单胞菌属均呈负相关。有研究表明,AOB群落结构易受到底泥环境的影响[33]。AOA群落结构的关键影响因子均为总氮,其关键属亚硝化球菌属与总氮在枯、丰水期分别呈负、正相关。SIMS等[34]研究同样表明AOA群落结构与总氮等浓度密切相关。枯水期Anammox群落结构的关键影响因子为总氮,其关键属Candidatusbrocadia与总氮呈负相关;丰水期的关键影响因子为pH和氨氮,其关键属Candidatusbrocadia与pH正相关,与氨氮呈负相关。研究表明,Anammox群落结构和活性会受到pH的影响[35],与本研究结果一致,也表明了脱氮功能微生物对氮循环作用的贡献与环境因子是密切相关的。

4 结 论

(1) 丰、枯水期微生物群落结构会发生一定变化,底泥微生物群落结构受到河流污染的影响。脱氮功能微生物在枯、丰水期的群落多样性排序为AOA>AOB>Anammox,物种丰富度枯水期为AOA>AOB>Anammox、丰水期为AOB>AOA>Anammox。不同时期赣江底泥中氨氧化微生物的主要类群不同。

(2) 不同时期,AOA、AOB、Anammox的优势属都分别为亚硝化球菌属、亚硝化单胞菌属、Candidatusbrocadia。

(3) 总氮是丰、枯水期AOA、AOB群落结构及枯水期Anammox群落结构的关键影响因子;pH和氨氮为丰水期Anammox群落结构的关键影响因子。