骨关节炎中软骨-骨相互作用的研究进展

迪力夏提·吐尔洪， 范永前

复旦大学附属华东医院骨科，上海200040

近年来随着对骨关节炎（Osteoarthritis，OA）的研究不断深入，人们不再将骨关节炎看作以关节软骨退变、关节间歇狭窄为主的疾病，而是影响关节软骨、软骨下骨、滑膜、韧带、半月板、关节周围肌肉的全关节疾病。自软骨下骨病变可引发骨关节炎的发现已过去近40年。早期出现的软骨下骨病变若不予干预，可发展为骨关节炎［1］。OA 中软骨损伤晚于软骨下骨病变出现，OA 软骨下骨骨重塑的异常及软骨下骨与软骨间相互作用的存在，揭示了软骨下骨在OA 发病机制中的重要作用。因此软骨下骨及关节软骨的关系又逐渐成为骨关节炎研究的热点。

1 OA 中的骨重塑

关节软骨与钙化软骨的清晰边界被称为潮线，潮线深处的软骨下骨通过钙化软骨与关节软骨连接。骨关节炎中，深层的关节软骨钙化增强，导致潮线上移，关节软骨随之变薄［2］关节软骨依靠高度血管化的滑膜分泌的滑液滋养，而深层的软骨细胞的营养支持来自软骨下骨［3］。软骨下骨板是位于钙化软骨下方的皮质骨，其深处即由骨小梁排列而成的松质骨，富含血管、神经和骨髓。

随着OA 进展，除软骨丢失外，另一标志性改变即软骨下骨硬化。在软骨下骨微结构上，表现为骨小梁数量减少，厚度增加，排列更分散，骨体积分数（Bone volume／Tissue volume，BV／TV）增加［4］。晚期OA 中，在软骨缺损严重区域下方，软骨下骨硬化更明显。软骨下骨板显著增厚，且软骨下骨病变与软骨缺损程度呈正相关［5-7］。动物实验表明［8-9］在早期OA 中，软骨下骨呈现出一过性软骨下骨骨吸收增强，骨体积分数减少。

由破骨细胞主导的骨吸收和成骨细胞主导的骨形成共同影响软骨下骨的重塑，二者相对平衡是正常骨代谢的基础。骨重塑启动后，破骨细胞被激活导致骨吸收，间充质干细胞、骨祖细胞的募集促使成骨细胞分化成熟并合成类骨质，类骨质矿化，骨重塑完成［10］。

正常软骨下骨可以起到较好的分散应力作用，Fell 等［11］通过动态机械分析法证明了牛健康关节软骨的黏弹性呈现应力频率依懒性。应力作用频率越高，由关节软骨分散至软骨下骨的能量越多，学者认为这种骨软骨组织根据外界应力而改变自身生物力学性质的现象是一种适应性反应。早期OA 中，骨重塑增强，可能由于骨重塑过程的加速导致类骨质的矿化来不及完成，使骨吸收过程占优势。在人体中，使用抑制骨吸收药物可引起尿液中软骨退变的标志物CTX-Ⅱ排出减少［12］，印证了软骨下骨重塑与软骨病变的相关性。OA 中异常的骨重塑导致软骨下骨传导应力能力减弱，加之其生物力学结构改变，导致应力作用下软骨变形不均匀而承受剪切力，产生裂缝等软骨损害［1］。

晚期OA 中，骨重塑过程中骨转换减弱，但骨形成超过骨吸收。骨形成标志物骨钙素在OA 患者中升高，而由破骨细胞表达的骨钙素受体在OA 患者中无升高。但OA 不同时期的骨重塑过程失衡的机制尚不清楚。

2 软骨-骨相互作用（Cartilage-Bone Crosstalk）

传统观念认为钙化软骨是无法渗透的屏障，软骨内物质无法进入软骨下骨。2009年的研究用荧光染料和特殊图像技术显示了骨髓和软骨基质之间的物质交换［13］，直接证明骨软骨组织之间存在物质交流。有体外实验表明，软骨细胞单独移植到牛软骨上存活率较低；软骨细胞和软骨下骨碎片一起移植到牛软骨上生存能力提高［14］；软骨细胞和成骨细胞的共同培养实验中，试验组健康软骨细胞+OA 患者硬化骨的成骨细胞，较之对照组健康软骨细胞+非硬化骨的成骨细胞，试验组软骨细胞ACAN （编码蛋白聚糖）、COL2A1 （编码Ⅱ型胶原α1）和SOX9 表达降低，MMP3 和MMP13 表达增加［15］。

有动物实验模型［16］从骨细胞中消除MMP13，使骨细胞重塑周围骨基质的过程受到抑制，结果却导致软骨基质蛋白多糖含量降低，软骨细胞的Ⅱ型胶原蛋白、蛋白聚糖和MMP13 产生降低，软骨病变发生率增加。骨细胞产生的MMP13 影响软骨稳态，证明了骨软骨相互作用的存在。

除物质交流外，有组织学研究显示了软骨和骨组织的直接接触。正常人内侧胫骨平台的骨软骨连接处，可见潮线上方未钙化软骨部分地浸入下方的钙化软骨，并在某些部位紧贴软骨下骨和骨髓［17］。

随着OA 进展，异常的软骨下骨重塑导致软骨下骨板的血管生成和孔隙率增加，为软骨-骨通过分子信号进一步相互作用提供了条件。常见信号通路包括：Wnt／β-catenin、RANK／RANKL／OPG 和ROS 信号通路。

2.1 Wnt／β-连环蛋白信号通路

Wnt 信号通路在动物界是高度保守的、控制生长发育过程的信号转导过程。Wnts 蛋白家族由至少19中分泌蛋白组成，功能上作为生长因子，驱动多种组织干细胞的分化［18］。Wnt 蛋白结合卷曲（FZD） 受体，阻止β-连环蛋白的磷酸化和降解，导致其积累并迁移到细胞核中，激活不同靶基因的转录［19］Wnt 信号通路在骨关节炎发病中起重要作用，该信号通路的精确调控决定关节软骨的健康状态。在关节软骨浅层软骨细胞中特异性敲除β-连环蛋白基因，导致软骨细胞产生的润滑素减少，软骨退变明显［20］。灭活软骨细胞中β-连环蛋白，阻断Wnt 信号通路，可引起软骨细胞死亡，从而导致软骨破坏。经典Wnt 通路的过度激活则促使关节软骨肥大，产生出钙化的细胞外基质（ECM），导致软骨生物力学特性变差［21］。OA 软骨细胞模型中，Wnt5a 表达上调并激活软骨基质中Ⅱ型胶原蛋白（COL2）的降解，沉默Wnt5a 的mRNA 可防止COL2 的降解［22］。此外，有动物实验表明wnt 信号通路的激活可促进软骨细胞衰老［23］。

Wnt 信号通路通过影响软骨下骨重塑导致软骨下骨结构改变。小鼠模型中Wnt 信号通路拮抗剂DDK-1过度表达时，软骨下松质骨骨量减少，小鼠模型OA 较野生型对照组程度更轻［24］。β-catnin 受体LRP5 的缺失亦会导致软骨下骨的骨质减少［25］。从骨关节炎患者胫骨平台获得的软骨下骨成骨细胞培养物中，Wnt5a 的表达显著增加，而抑制Wnt5a 表达则部分纠正了OA 成骨细胞的异常矿化、硬化蛋白的分泌和碱性磷酸酶活性［26］。Wnt 过度表达亦可引起OA 样改变。沉默DDK-1，会增加成骨细胞的数量和活性［27］。成骨细胞中Wnt16 过度表达的小鼠模型表现为软骨下骨骨板增厚、软骨下骨体积占比（BV／TV）增大，但OA 严重程度和对照组无异［28］。

2.2 骨保护蛋白（OPG）-核因子κB 受体活化因子配体（RANKL）-核因子κB 受体活化因子（RANK）系统

RANKL 是一种由成骨细胞以及免疫细胞和肿瘤细胞分泌的同三聚体跨膜蛋白，可刺激骨中破骨细胞的分化，RANK 受体是一种广泛表达的同源三聚体分子，骨保护素（OPG）充当诱饵受体，阻断RANKL 与破骨细胞表面RANK 的结合，从而暂停骨吸收细胞的分化和激活。在成骨细胞中，OPG 的表达受Wnt／βcatenin 调节系统的调节［29］。至少有7 条RANK 下游信号通路已被描述；其中，三个触发破骨细胞生成（活化B 细胞的核因子κ-轻链增强子-NFκB、c-Jun 氨基末端激酶／激活蛋白-1、活化T 细胞的核因子-NFAT-1），其他通路介导破骨细胞活化（Src 和MKK6／p38／MITF）［19］

OA 中存在不同的成骨细胞类型：所谓的“低骨关节炎成骨细胞”，它们具有低水平的PGE2、IL-6 和OPG 以及高水平的RANKL，以及“高骨关节炎成骨细胞”，它们具有增加的PGE2 表达， IL-6 和OPG，以及RANKL 水平降低。低骨关节炎成骨细胞可能参与诱导骨吸收，而高骨关节炎成骨细胞可能参与促进骨形成［30］。OPG／RANK／RANKL 调节系统的功能障碍与软骨下骨的组织学改变之间存在密切相关性。早期诱导间充质细胞分化为成骨细胞分化的关键作用是由Osterix （Osx） 和Runt 相关转录因子2 （Runx-2）发挥的。OA 中成骨细胞的高Runt 相关转录因子2（RunX2） 和osterix 水平导致其具有更高的OPG 表达和更低的RANKL 表达。而实验动物中，使RunX2 过表达，导致β-catenin 的消耗、 抑制了经典Wnt 通路的功能，导致骨量减少。而导致RunX2 过表达的同时抑制β-catenin 降解酶GSK-3β，则骨形成和骨小梁体积得到恢复，并且RANKL／OPG 比率降低。表明了Runx-2在OPG-RANKL-RANK 和Wnt／β-Catenin 系统均有调节作用［31］。

异常机械应力也会影响OPG-RANKL-RANK 系统。Sanchez 等［32］从接受全膝关节置换术的OA 患者软骨下骨硬化区和非硬化区中分离并培养成骨细胞。在培养28 d 后，施加1 Hz 频率的机械冲击4 h 来模拟机械负荷。结果是，硬化和非硬化成骨细胞的炎性细胞因子IL-6 和IL-8、Cox-2、降解金属蛋白酶MMP-3、-9、-13 和RANKL 的量均增加，同时OPG 产生显著降低。其中非硬化成骨细胞对机械负荷的反应比硬化成骨细胞更敏感，但大多数差异在压缩停止后消失。

OPG-RANKL-RANK 系统可能存在反向信号传导。最近有动物实验展示了成熟破骨细胞分泌含有RANK14 的细胞外囊泡，结合成骨细胞的RANKL 来触发RANKL 反向信号，促进骨形成。为软骨下骨重塑过程中破骨细胞活性增强导致的骨吸收提供了新的药理学目标［33］。

OPG／RANKL 不仅在软骨下骨组织中发挥作用，在OA 软骨细胞中也有表达。OA 滑液和软骨细胞中，RANKL／OPG 比增加，OPG 基因敲除小鼠软骨层变薄，表明OPG 对软骨也有保护作用［34］。在IL-1β 诱导的软骨肉瘤细胞中，RANKL／OPG 比增加与MMP-13 合成增加呈正相关，证明RANKL 增加确实导致软骨基质降解［35］。10 ng／mL 浓度的IL-1β 导致软骨中MMP-3，MMP-13 ADAMTS-4、ADAMTS-5 和RANKL 的产生增加，而100 μg／mL 的透明质酸可逆转这一结果［36］。

2.3 ROS 信号通路

活性氧自由基（Reactive oxygen species，ROS）包括氢氧根（OH-）、过氧化氢（H2O2）、超氧阴离子（O2-）、一氧化氮（NO） 和次氯酸根（OCl-），正常情况下通过改变细胞内氧化还原状态及对蛋白质的氧化修饰来实现细胞信号传导。当ROS 的产生与抗氧化剂之间平衡紊乱，可导致大分子的损伤和正常氧化还原信号的破坏，称为氧化应激，在OA 发展中起重要作用。

机械应力和炎症介质（IL-1β、TNF-α、IFNγ、ox-LDL、LPS、IL-17）使软骨细胞通过NADPH 氧化酶产生异常水平的ROS，主要是NO 和O2-，可直接损伤关节软骨中的脂质，蛋白质及DNA。过量ROS 亦可充当第二信使，抑制软骨基质合成，软骨细胞迁移，激活MMP降解基质成分。ROS 通过激活ERK MAPK 来抑制IRS-1-PI3K／Akt 信号通路的激活，从而抑制软骨细胞蛋白聚糖、COLⅡ和Sox-9 的表达［37］。在兔关节软骨细胞中，ROS 通过PI3K／Akt、p38 和JNK 信号通路降低COLⅡ表达［38］。ROS 亦可直接攻击ECM 中的蛋白多糖和胶原蛋白分子并阻止胶原纤维的形成［39］。需要注意的是，ROS 减少亦可对骨代谢产不利影响。小鼠模型中，精氨琥珀酸裂解酶（ASL）缺失导致NO合成前体缺失，NO 减少引起NO 介导的糖酵解途径失活，导致成骨细胞分化和功能降低［40］。

ROS 在OA 发病中的重要作用还体现在诱导软骨细胞凋亡，炎症介质可上调软骨细胞中iNOS （产生NO 的酶，inducible nitric oxide synthase） 表达。NO 导致脂质过氧化的产物4-羟基壬烯醛（HNE）通过激活caspase-3、-8 和-9，下调Bcl-2，上调Bax 和抑制促存活Akt 激酶活性，导致软骨细胞凋亡［41］。ROS 可反作用于缺乏组蛋白保护的线粒体DNA，使其损伤并逐渐累积导致呼吸链功能障碍，产生更多ROS，形成恶性循环。软骨下骨成骨细胞中，HNE 通过增加p38 MAPK、JNK2 的磷酸化，诱导COX-2 表达和PGE2 释放［42］。氧化应激状态中ROS 通过直接或间接的方式影响软骨和软骨下骨，是OA 发病机制的重要组成部分。

NF-κB 信号通路作为RANKL-RANK 的下游通路，活化后可增强促破骨细胞生成细胞因子的表达，如IL-1β、IL-6 和PGE2，导致骨吸收［43］。NF-κB 是一种对氧化还原敏感转录因子，ROS 可增强或抑制其活性。ROS 水平升高时，NF-κB 信号的上调，诱导更多iNOS、IL-8 和COX-2 的产生，导致OA 组织的促炎症的表型改变，导致软骨基质降解［44］。在小鼠软骨细胞中，Nrf2 抑制NF-kB 的激活，从而减少软骨分解代谢因子的表达，如PGE2 和MMPs［49］NF-κB 通路对于ROS 的易感性及对软骨基质降解作用，使通过改变相关分子的氧化还原态来调节其活性成为治疗OA 的可能靶点。

3 老年OA 患者中软骨-骨特性的研究意义

OA 在老年患者中更为常见，故老年患者软骨-骨的特性在OA 研究中占重要地位。

一项针对韩国老年OA 患者的横断面研究［45］表明，膝关节间隙狭窄的产生和患者腰椎+股骨颈BMD呈负相关，提示OA 与全身骨密度情况的相关性，因而治疗老年性疏松患者时，不应忽视OA 存在的可能性。针对老年OA 患者的MRI 随访，提示了OA 进展在膝关节内外间室的差异。针对轻到中度OA （K-L 评分0～3分）老年患者研究［46］提示，在为期2年的随访中，外侧间室的软骨缺损面积平均增加0. 18 cm2（SD=0.60），内侧间室则为0.49 cm2（SD =0.09）。表明老年患者中内侧间室OA 进展更为迅速。内侧间室软骨缺损在体重较重、膝内翻患者中进展更快，外侧间室软骨缺损则在缺损位于胫骨侧、膝外翻患者中进展更快。随着OA 不断进展，膝关节置换成为老年患者唯一治疗选项。针对老年OA 患者膝关节软骨下骨骨密度的研究［47］表明，胫骨平台软骨下骨密度与患者接受膝关节置换手术的风险呈正相关，为老年OA患者预后评估提供了新的可能。

OA 导致的慢性疼痛可显著影响老年患者生活质量。由于目前尚无改善OA 病情的药物，治疗上以NSAIDs （Nonsteroidal Anti-Inflammatory Drugs，非甾体抗炎药）口服，HA （Hexadecenoic Acid，透明质酸）膝关节腔注射等对症治疗为主。而Pelletier 等［48］发现老年患者相比年轻人从关节HA 注射中获益更少。有限的治疗方式使得OA 早期诊治显得尤为重要。通过对老年OA 患者软骨下骨特性的进一步研究，有助于为OA 早期诊断提供新的线索、为OA 预后评估提供新的工具，从而做到老年OA 患者的早诊早治。

4 软骨-骨相互作用相关的治疗进展

OA 中软骨-骨相互作用的研究为改善OA 病情药物的研发提供了线索。针对OA 存在的软骨下骨异常骨重塑，采用双磷酸盐抑制骨吸收的治疗策略的在临床试验中收效甚微。对有症状的膝OA 患者每年使用一次唑来膦酸静脉注射，较之安慰剂组，在24月内没有观察到明显的软骨缺损的减少或疼痛评分的降低［49］。另一个新兴的治疗靶点为组织蛋白酶K，在OA 破骨细胞和滑膜中表达，通过降解Ⅰ型胶原蛋白、降解骨基质来参与骨吸收过程，并可以切割软骨中的Ⅱ型胶原蛋白。在一项针对有症状膝OA 患者的ⅡA期临床试验中，组织蛋白酶K 的抑制剂MIV-711，较之安慰剂组在26 周内可使软骨缺损减少，骨重塑的标志物降低，但疼痛评分没有显著差异［50］。侵袭性软骨下H 型血管是软骨-骨相互作用的重要渠道，在OA 动物模型中［51］，VEGF-A 抗体贝伐珠单抗可通过阻断VEGF （Vascular endothelial growth factor，血管内皮生长因子）减少H 型血管生成，从而抑制软骨细胞肥大改变并延缓OA 进展，具有明确的软骨保护作用，在OA 治疗中有巨大潜力。

针对OA 软骨-骨信号通路的治疗方案亦催生出潜在OA 治疗药物。Wnt 信号通路在OA 发展中对软骨、软骨下骨的表型、代谢均造成影响，因而该信号通路的抑制成为OA 治疗的潜在靶点。Deshmukh 等［29］的研究表明，小分子Wnt 抑制剂lorecivivint （SM04690）抑制细胞内激酶CLK2 和DYRK1A，来达到诱导软骨形成和增强成熟软骨细胞功能的作用。针对该药物ⅡB 期临床试验的分析表明，相比安慰剂，该药物0.07mg 关节腔内注射在缓解疼痛、改善功能方面显示出了更好的患者报告结局指标［52］，目前该药已进入Ⅲ期临床试验。最近有研究表明，青蒿素通过阻止了Wnt 信号（β-连环蛋白、Wnt5a 和GSK-3β）参与者的上调和FRZB 的下调，在IL-1β 诱导的大鼠OA 软骨细胞模型中表现出了抗炎和软骨保护作用［22］。

地诺单抗（一种人IgG2 单克隆抗体）可与RANKL高亲和力特异性结合，并且不与蛋白质、肿瘤坏死因子（TNF） 配体家族的相同家族成员相互作用，可以有效且强烈地抑制骨吸收，是一种安全的抗骨质疏松药物［53］。地诺单抗对骨重塑的抑制是否可以影响OA病变尚无报道，但最近有研究证明破骨细胞可分泌netrin-1 以诱导软骨下骨中的感觉神经轴突生长，而敲除骨细胞RANKL 的受体激活剂来减少破骨细胞的形成，抑制了感觉神经向软骨下骨、背根神经节神经元过度兴奋和OA 小鼠的疼痛超敏反应行为［54］。

老年OA 患者中，衰老导致的线粒体功能障碍导致氧化应激，诱导软骨细胞损伤，使软骨细胞老化。骨髓中增加的ROS 可抑制间充质干细胞向成骨细胞分化，同时增加骨髓中的脂肪生成以及软骨下破骨细胞生成，而锻炼可直接降低软骨-骨组织中的ROS 水平，从而降低软骨下骨破骨活动水平，减轻软骨损害［55］。另一种策略是使用抗衰老药物从OA 软骨中直接清除衰老细胞，从而减轻其炎症介质和蛋白酶对软骨的损害，如Fisetin （非瑟酮）具有潜在的抗衰老和抗炎作用，可以减轻DMM 动物模型中的关节损害［56］，该药物已进入Ⅲ期临床试验。

OA 发病机制的复杂为改善OA 病情药物的研发带来巨大挑战，未来的研究将进一步揭示软骨-骨相互作用及其在不同表型OA 之间的差异，以及在OA不同阶段的差异，为研发长期治疗OA 的药物提供更多靶标。

5 结语

关于OA 发展过程中产生的软骨下骨改变是否影响以及如何影响其表面关节软骨的状态，存在相当大的争议。关节软骨具有材料和结构方面的特殊性，可在压应力下变形而不会发生受损，但其承受关节运动过程中出现的张力或剪切应力的能力较差。因此，在OA 演变过程中发生的关节轮廓的改变或软骨下骨密度或刚度的不均匀会产生局部剪切应力，从而增加软骨变形并使其易于分裂和纤维化［1］。骨-软骨相互作用包含多种信号通路，病理状态下通过损害软骨稳态及软骨下骨结构和骨密度造成各种OA 的典型病理改变，它们在时间和空间上的次序和因果关系如何将会在未来的研究中不断展开，为延缓OA 病情进展提供更多可能的治疗靶点。