荧光检测技术在水质检测中的应用

魏 钢

（河北省唐山生态环境监测中心，河北 唐山 063000）

改革开放以来，工业的快速发展促使城市中积累了越来越多的净化设备。工业用水不仅流入河流并威胁环境，而且还威胁人类的饮用水安全。快速、真实地监测水质的变化对于有效控制水污染事件和制定相应措施尤为重要。荧光检测技术早在几十年前便得以应用，并在长期发展中不断改进，形成了一种新型检测技术并逐渐成熟。荧光检测技术刚开始仅仅被用于生物领域和医学领域，之后逐渐应用于食品安全和水质检测等领域，为人们的生活提供安全保障。目前，我国环境监测部门大多采用传统的化学方法（如COD、BOD测量）来分析水质，但对水质以及水质监控的要求不断发生变化，在实际运用中仍存在许多缺点。传统的检测方法不仅在检测工艺上浪费更多的时间和资源，而且不能够有效地对水质进行实时监控，从而需要更加先进的检测技术来克服传统检测方式的不足，更加快速准确地检测出水中各类成分的含量，进而确保人们的用水安全。

1 水质检测的重要性

由于我国人口众多，水资源一直处于绝对短缺状态，南北水资源分布不均，行业水资源存在差距。对水的保护已成为政府的首要任务，尤其是我国西部地区，虽然水资充裕但水质较差，对我国经济建设和发展影响很大。可以通过水质检测，对水中的有害成分进行定期检查，更好地了解我国各地区的河流、地下水、自来水等水资源的详细状况，并结合不同地区的实际情况，对纯净水水质进行实时调控、净化和预防。此外，水质监测过程结束后，会收集到区域内水质的重要数据，将数据及时地传递给环保局，可以为水资源和环境的科学管理提供权威的数据支持，以帮助相关单位进一步解决水质问题。同时，通过水质检测可以对污染物的来源进行分析，以更好地找到污染源并遏制其发展，还可以及时地对水资源数据进行预测和评估，研究净化水资源的策略，保证人们的用水安全和对地方环境的有效保护。通过实验发现自来水和纯净水的荧光光谱没有明显差异，但城市污水和纯净水的荧光光谱差异很大，在不同波长的紫外线的激励下，城市污水和纯水样品的荧光光谱在直波长和峰值波长上基本稳定，符合荧光光谱的一般特性，只是绝对强度发生了变化。而城市污水利用波长约为270 nm的紫外线发出强烈的荧光，荧光峰是280～530 nm范围内的宽光谱峰，荧光峰的波长约为380 nm，荧光光谱的特点反映了水质的净化水平，城市污水中所含的有机污染物具有较高的绝对强度和较宽的光谱峰宽荧光光谱[1]。

水质检测的主要目标是通过合理的技术手段对水中的成分进行检测，为环境保护收集准确的数据信息，以更好地解决水质问题。水质检测与水资源后期的管理配置和管理方法有一定的联系，水质检测的结果必须要有一定的代表性，才能保证水资源保护策略更具有说服力和实际意义。人们常用的自来水中是含有很多有害细菌的，细菌的繁殖会产生很多浮游生物，一方面会影响水域的物理特性，水的颜色和气味发生一些特殊的改变，另一方面，人体在感染细菌后更容易诱发其他流行病，严重威胁人体的生命健康。生活中比较常见的就是“牙菌斑”，牙菌斑是水质中含有不符合标准的氟离子严重影响了牙齿的硬度而产生的。因此，国家要求通过水质检测对水资源进行安全保护，以符合国家安全标准，满足人们的生活用水和工业用水的不同要求。例如，锅炉水不能含有大量的硫酸钙或硫酸镁，避免锅内物质的凝结，不利于锅中物质的有效反应，会浪费更多的原材料，严重情况还会引发锅中的爆炸。因此水质检测可以更好地对水中悬浮物进行检测和排查，并找出相应的水质优化方法。根据研究表明，荧光检测技术可以细胞为单位，更加细致地检测出水中所含有的微生物，以达到水质检测的真正目的，为水质成分的实验研究提供准确数据。荧光检测技术所含有的技术种类很多，技术的检测灵敏度要更高一些，而且不容易破坏水质样品的结构，检测过程可以保证数据提取的稳定性[2]。

2 水质检测的一般标准

2.1 饮用水消毒

饮用水是与人们生活密切相关的，必须进行一定的净化消毒工作，杀死水中的有害微生物，以保证人们所用到水源是被充分消毒过的。在饮用水检测过程中，常常出现刺激性气味，这与其本身含有的水质消毒物质有关。比较常见的消毒方式有臭氧和紫外线消毒，消毒后会产生甲醛和氯仿，但只要消毒方法科学合理，严格符合消毒标准，就不会对人体造成伤害。

2.2 具有感官性

水质的判断有很多种方法，可以用专业的设备和仪器进行鉴别，也可以用人的感官来判断水资源的安全性。一般情况下，水质出现问题都会引起水质物理特征的一些变化，例如，水的味道改变、水的颜色变浑浊以及有刺激性气味等特点，其外观和味道直接决定了水质的感官特征。因此，可通过感官来进行基本的水质观测，初步确定水质是否安全，若产生异样，将直接拒绝使用。

2.3 符合流行病学控制要求

众所周知，水资源保护首要考虑到的就是去除微生物，避免人体遭到微生物的侵害而诱发疾病。水质检测过程要借助流行病学相关理论，控制人类活动和动物粪便对水源的污染，进而保证水中微生物的含量符合环境保护的要求，防止流行病和细菌通过饮用水传播。

3 荧光检测技术在水质检测中的应用技术原理

荧光所具有的基本特征就是荧光物质，荧光物质可以被固定波长的光激发，并在氧化后的一段时间内恢复，发挥其检测运用。常见的荧光检测方法种类很多，不同技术的使用感受也大不相同，常见的有荧光光谱检测和高效液相色谱法检测，这也是人们评价较高的检测方法。分子荧光检测具有应用于大型湖泊和河流等传统水质检测的潜力，国外已经对该技术进行了普及，允许各大地区进行应用，借助高效率和高质量的荧光检测技术，使得水质检测过程达到最佳[3]。

3.1 ATP生物荧光检测技术

三磷酸腺苷也就是检测中的ATP，在荧光的基础技术上可以更好地与荧光素和荧光素酶发生化学反应，也是被检测单位公认的最容易估算水质成分的方法之一。ATP生物荧光检测技术相比于菌落计数法可以更快地确认活菌的存在，但是该反应需要与ATP直接接触，其发射强度与ATP浓度呈正相关。此外，ATP为动物、微生物、细菌和真菌的生命活动提供能量，维持细胞生命周期的稳定，而水质检测中生物的负荷将反应水质成分。ATP生物荧光检测技术检测周期较短，对设备的消毒程度要求高，可以满足在移动模式下完成实时检测，这限制了仅适用于实验室模式的大型台式ATP荧光检测器。

3.2 流式细胞术

流式细胞术是后期逐渐兴起的一种先进的分析技术，主要是借助流式细胞来检测水中的悬浮物质和颗粒。流式细胞术融合了流体动力学技术、光电测量技术以及现代计算机信息技术等多类别的现代化技术，可以借助荧光探针在分子水平上获得一些数据以进一步纯化细胞。流式细胞技术在时代的发展中逐渐走向成熟，是一项跨学科、多类别的提高结晶的技术，在检测中取得了显著的成就。其技术检测的原理是通过流动池悬浮液在流动池内的聚集，容易形成单独的粒子流，在穿过激光束后发生许多的碰撞，进而恢复细胞水平上不一样的荧光信号和细胞参数。另外，该技术中粒子散射和荧光发射由一组特定波长的滤光片和设备决定的，信号在收集完成后会发送到计算机，进而获取更加全面的数据分布，完成水质中的物质检测[4]。

3.3 荧光共振能量转移

荧光共振能量转移主要是指荧光的发色团在接触到一定程度后，会接收到彼此特定频率的光子，从而激发出更高的电子能态进行实验。在粒子恢复基本状态的过程中，能量可以和偶极子相互作用从而传递给其他的受体。当两个荧光团产生能量转移时，一个作为供能个体，一个作为受能个体，并且不同的光谱重叠在一起，控制间距在1.0～10.0 nm。若采用供体激光发射，就会发现供体的能量转移给受体，并且转移的效率和发射光谱之间的堆叠水平有关。供体和受体之间的差异跃迁与偶极子的绝对方向、供体和受体之间的距离有关，荧光共振能量转移的水平与两个荧光分子之间的距离有关，如果非常粒子之间接近，能量转移的条件就会满足，若输出比传导传递弱，就难以实现能量传递。

4 荧光检测技术在水质检测中的应用

4.1 水中细菌数量的检测

水中细菌检测是水质检测中最基本的项目，主要是对一定单位内的水质进行细菌的定量检测，但检测过程对技术人员的专业度要求很高，不允许出现较大的误差，并且等待结果时间较长。通过流式细胞检测的原理可以了解到，被标记的细菌被单个激光柱激发并检测到发射的荧光信息。因此，水质检测最常见的用途是快速识别水中的细菌总数，借助流式细胞仪可以在15分钟内轻松快速地从样本中获得结果。在检测水中细菌含量时适当增加水样，方便对水中有毒物质进行直接检测，常用检测方法是ATP生物荧光检测技术。饮用水中的细菌浓度是非常小的，采用生物荧光检测技术会受到细菌浓度和数量的局限，准确度和灵敏度下降，不能实现特异性检测。在检测之前，应增加水中微生物浓度再进行免疫磁分离执行目标细胞的捕获，一定程度上可以提高靶细胞水平，减少其他实验目标外粒子的干扰，最终确保检测的特异性。ATP生物荧光检测技术可用于检测饮用水中的微生物含量，而稀释水中的微生物可以通过膜过滤和适当添加缓冲剂或荧光剂来检测[5]。

4.2 水中离子浓度的检测

水中离子的浓度直接影响到水的硬度，水的硬度过高会使水中金属元素在人体内累积，在人体内留下安全隐患。传统的实验室检测方法，如原子吸收光谱法、方差分析法、复杂滴定法等都存在检测时间长、过程复杂的缺点。而荧光共振能量转移技术，主要是通过测量水中钙和镁的浓度来检测水质硬度，在水溶液中加入纳米级黏土片状锂皂，可以进一步提高检测传感器的感受度，方便测量到水资源中的各类成分和离子，为实验提供更多的数据参考。

4.3 水中生物细胞分析

水中的微生物种类比较多，有时需要单独研究某种微生物，而水质检测的目标就是针对一类或者一种微生物进行检测。采用流式细胞仪可以对单个细胞的成分进行荧光强度分析，从而结合细胞的特性和反应特征来分离出微生物进一步进行检测。流式细胞仪与rRNA焦磷酸测序数据相结合，通过设备容易观察到水系中的微生物群落变化。焦磷酸测序是一种下一代测序技术，其主要特点就是观察水中生物群落的基本形态和物质构成的分子比例，还能测得水中粒子的浓度。在水质检测中，将细胞流式技术所测得的细胞数据和焦磷酸测序数据相结合，能够更好地检测水系中的细菌浓度和微生物的群落实时动态变化。在生活环境中存在细菌团体，容易诱发人体疾病，常见的军团菌大多生长在潮湿的地方，通过实验可以观测该种细菌的数量变化，更快速地测出其他菌种。

4.4 消毒效果深度分析

在饮用水消毒研究中，消毒剂的使用量对水中细菌的影响是不可忽视的。水质检测研究报告表明，消毒剂浓度与完整细胞的比例相关联，采用流式细胞仪可以得到消毒前后所有细胞浓度。细菌活力检测试剂盒中的两种染料和碘化丙啶可穿透所有细菌膜，进而将细胞染成绿色，最终达到水质检测和消毒的目的。检测中的染料和试剂材料熔化、混合和稀释，在室温下孵育20分钟，获得的结果可以通过激光扫描共聚焦显微镜来证实。另外，碘化丙啶不能穿透未受损细胞的细胞膜，但可以穿透受损细胞的细胞膜，两种染料的组合产生白色荧光细胞。

5 荧光检测技术在水质检测中的应用前景

荧光检测技术作为一种新型检测技术，可以克服传统检测技术的诸多不足。一方面可以节省技术操作的时间，为单位减少水质检测的资金投入，另一方面可以检测出活细胞浓度，这是众多检测技术所难以实现的。其中，ATP生物荧光检测技术因其检测速度更快、操作更加简便等特点，可以更容易检测出一定水样溶液中微生物的数量，但也容易受到检测条件中能量的限制和外界微生物含量的影响，在检测低浓度水质应注意避免使用该方法。其次，流式细胞技术和荧光共振能量转移具有操作方便、灵敏度高、效果好等特点，检测价值更高一些，广泛用于检测微生物、毒素、离子等，但使用这项技术需要满足相关条件[6]。

流式细胞检测技术的设备价格比较昂贵，其检测试剂也比较昂贵，不利于边远地区的普及和推广。最后，激光扫描共聚焦显微镜可以更加直观地检测水质中的成分，检测过程非常简单，不需要专业的细胞培育技术，但制样过程非常繁琐，对于研究类的实验员来说是一个非常方便的检测方法，在未来水质检测和环境保护研究中的潜力是很大的。荧光检测技术可以为水质检测单位提供更加符合时代发展的检测标准，并且通过结合荧光检测技术可以检测水中细菌、病毒等特定微生物的浓度以及微生物群落的替代状态，为后期水资源的保护和环境保护研究提供参考价值。荧光检测技术在饮用水检测、消毒剂评价等水质分析研究中得到了越来越广泛的应用，分析结果更加高效准确。

6 结语

从人们生活中排出的污水会引起许多流行病，如果不经过严格检测，就会影响人们的正常用水，并威胁到人体的健康。水质检测对人类的生活和环境的维持与发展起着非常重要的作用。鉴于我国水质实验室分布不均、采样设置不合理、检测技术设备陈旧等问题，应结合自身的工作经验提出针对性的合理化建议。采用荧光检测技术可以有效提高水质检测的效率，保障居民饮水安全，及时发现水质问题，促进社会和谐发展，进一步为环境管理和环境科学研究提供确切的数据和信息，从源头控制水质，合理规划和保护环境。