黑藻（Hydrilla verticillat）在铅、锌胁迫下的代谢组学研究

陈卓，胡芯，唐洪玉

西南大学水产学院，重庆 400000

水体中的铅锌常为相伴重金属，其主要来源为铅锌矿开采、冶炼、电池加工等工业活动。铅作为“重金属五毒”之一，其在植物体内聚集过量会抑制植物的生长以及影响植物的生理代谢过程，严重时还可导致植物的死亡[1]。过量的铅进入人体会影响人体的神经、消化和造血系统，如果进入孕妇体内还会影响胎儿的智力。而锌作为铅的伴生金属，其本身是生物体的必需元素之一，但当其含量超过机体所需的微量需求时，同样会对机体造成一定程度的伤害[2]。黑藻（Hydrillaverticillat）又常被称为轮叶黑藻，分类上属于水鳖科（Hydrocharitaceae），黑藻属（HydrillaRich），是我国水产养殖中常见的敏感性植物。其对重金属的吸附作用一直受到研究者的关注[3-10]，可作为重金属污染环境修复植物和水体污染的指示植物[11-12]。

代谢组学（metabonomics/metabolomics）是继基因组学、转录组学及蛋白质组学之后发展起来的一门新兴学科，其概念是由Nicholson于1999年提出，指通过对细胞、组织或生物体内所有低分子量代谢物的定性和定量分析研究，阐明各代谢物变化规律，探讨各种刺激因素对机体产生的影响，从小分子代谢物视角揭示生命活动的本质和过程[13-14]，通过研究它们能更灵敏更准确地获知机体状态及动态变化过程[15-16]。代谢组学、基因组学、转录组学及蛋白质组学均属于系统生物学组成部分，其研究思想类似，且彼此之间有着密切联系，但同时又有着明显的区别[17]。在外界环境刺激下，生物体内会发生一系列代谢，但不是每次刺激都会对其基因和蛋白造成显著影响，而研究机体代谢产物的代谢组学能真正反映出机体已经发生的事件[18]。因此借助代谢组学的技术来评价环境污染物暴露带来的毒性效应优势明显，特别是在低剂量或环境剂量污染物的毒性效应评价方面[19]。目前关于藻类在重金属胁迫等方面的研究主要是在高浓度、单一胁迫下的吸附效果及生理生化指标研究，对多种重金属胁迫下黑藻的生理响应研究较少，尤其是铅锌胁迫下初生代谢产物研究更是未见报道。本试验通过对铅、锌单一胁迫与铅锌复合胁迫下黑藻的初级代谢产物研究，从多个层面分析其在不同胁迫情况下的代谢差异，探究黑藻在面对铅锌胁迫后的响应及作用机制，填补相关研究的空白并以期为铅锌胁迫对黑藻代谢物影响的后续研究提供基础数据，为铅锌污染检测提供理论依据。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 试验材料及处理

试验材料取自西南大学水产学院实验教学中心实习实训基地。将采集到的黑藻清洗干净后移入室内水池，用改良后的10% Hoagland营养液[20]进行培养驯化，温度为（25±0.4） ℃，pH 6.5±0.2，光照周期为12 h∶12 h（L∶D），每2天更换一次培养液，每天用HNO3或NaOH调节pH值。培养1个月后，选取新长茎叶且长势一致的黑藻进行正式试验。

1.2 黑藻培养及试验条件

正式试验容器为透明整理箱（400 mm×300 mm×200 mm），底部采用固植板将黑藻固定住，试验条件管理同驯化期一致。培养一周后进行铅、锌（分别以Pb（NO3）2和ZnSO4·7H2O形式加入水体中）胁迫，试验采用二因素设计，铅、锌各浓度设置参照《地表水环境质量标准》（GB 3838—2002）中的Ⅴ类和超Ⅴ类标准浓度值，具体处理设置如表1所示，共7个处理，每个处理3个平行。在处理28 d后采集对照组S1（CK）和处理组S4（Pb0.10）、S5（Pb0.20）、S16（Zn2.00）、S21（Zn4.00）、S19（Pb0.10+Zn2.00）、S25（Pb0.20+Zn4.00）的黑藻茎叶，液氮处理后放置于-80 ℃冰箱保存。其中每个处理组3个生物学重复。

1.3 代谢物提取

（1）选取生长状况相似的黑藻茎叶，液氮处理后置于-80 ℃冰箱保存；（2）将保存样品放置于冻干机中真空冷冻干燥；（3）冷冻干燥后的样品利用研磨仪在30 Hz下研磨1.5 min至粉末状；（4）研磨后称取100 mg粉末状样品，置于0.6 mL 70%甲醇提取液中溶解；（5）将溶解后的样品置于4 ℃冰箱过夜提取，期间涡旋6次，以提高提取率；（6）处理后的样品在10 000g下离心10 min，吸取上清，用微孔滤膜（0.22 μm）过滤样品，并保存于进样瓶中，并采用超高效液相色谱串联质谱（UPLC-MS/MS）检测分析。

1.4 色谱质谱条件

1.4.1 液相色谱条件

色谱柱为Waters ACQUITY UPLC HSS T3 C18 1.8 μm，2.1 mm×100 mm；流动相：A相为超纯水（加入0.04%的乙酸），B相为乙腈（加入0.04%的乙酸）；洗脱梯度：0.00 min B相比例为5%，10.00 min内B相比例线性增加到95%，并维持在95% 1 min，11.00～11.10 min，B相比例降为5%，并以5%平衡至14 min；流速0.35 mL·min-1；柱温40℃；进样量4 μL。

1.4.2 质谱条件

电喷雾离子源（ESI）温度设置为550 ℃，质谱电压设置为5 500 V，帘气（CUR）206 850 Pa，碰撞诱导电离（CAD）参数设置为高。在三重四级杆（QQQ）中，每个离子对根据优化的去簇电压（DP）和碰撞能（CE）进行扫描检测。

1.5 数据处理与分析

采用UPLC-MS/MS检测技术，利用构建的植物初生代谢物数据库，智能二级谱匹配方法对物质定性，采用三重四级杆质谱的多反应监测模式（MRM）检测物质相对含量，随后利用软件Analyst1.6.3处理质谱数据。通过三重四级杆筛选出每个物质的特征离子，在检测器中获得特征离子的信号强度（CPS），用MultiaQuant软件进行色谱峰的积分和校正工作。本试验采用单变量、主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）多元统计分析方法，对代谢物进行定性定量分析。

单变量统计分析方法包括参数检验和非参数检验。多元统计方法PCA用R软件（www.r-project.org/）内置统计prcomp函数，设置prcomp函数参数scale=True，对数据进行归一化。OPLS-DA在原始数据进行log2转换后，再进行中心化处理，利用R软件中的Metabo AnalystR包OPLSR.Anal函数对数据进行分析。评价OPLS-DA模型时，Q2表示模型的预测能力，Q2>0.5时可认为是有效的模型，Q2>0.9时为出色的模型。

表1 试验处理组设置Table 1 The settings of treatment group

本研究差异代谢物筛选标准。（1）选取差异倍数值fold change≥2和fold change≤0.5代谢物，即代谢物在对照组和实验组中差异为2倍以上（显著上调）或0.5倍以下（显著下调）认为差异显著。（2）在上述的基础上，选取VIP≥1的代谢物。VIP值表示对应代谢物的组间差异在模型中各组样本分类判别中的影响强度，一般认为VIP≥1的代谢物为差异显著。

2 结果分析（Results）

2.1 黑藻初生代谢物定性分析结果

本研究基于UPLC-MS/MS检测平台和相应的数据库共检测出342个代谢物，其中有机酸126种，脂类80种，氨基酸及其衍生物71种，核苷酸及其衍生物39种，糖和醇类20种，维生素6种。

2.2 单一铅、锌胁迫黑藻代谢物差异分析

通过对照组（S1）与Pb0.10单一处理组（S4）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为40.84%，第二主成分（PC2）值为19.86%（图1（a））；通过对照组（S1）与Pb0.20单一处理组（S5）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为36.97%，第二主成分（PC2）值为25.01%（图2（a）），且各图中的2组数据分别在X轴两侧，表明对照组和单一铅处理组之间存在明显差异。对数据进行OPLS-DA分析，经200次排列实验验证，模型的有效性验证图如图1（b）、图2（b）所示，Q2分别为0.808、0.846，表明所建模型可靠。横线对应原始模型的R2Y和Q2，红点和蓝点分别代表Y置换后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相应点都不超过相应的线，说明该模型有意义。

根据代谢物差异筛选标准（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），与对照组相比，Pb0.10单一处理组有32个显著差异代谢物，Pb0.20单一处理组有19个显著差异代谢物。在这些差异代谢物中，共有11个相同的差异代谢物，其中，5个代谢物出现了显著上调（fold change≥2），分别为N-苯乙酰基-L-谷氨酰胺、芥子酸吡喃葡萄糖酯、香草酸葡萄糖苷、异水杨酸-O-葡萄糖、海藻糖-6-磷酸等酚酸类和糖类物质；6个代谢物出现显著下调（fold change≤0.5），分别为酪胺、对香豆酰咖啡酰酒石酸、没食子鞣质、溶血磷脂酰乙醇胺18:0（2n异构）、十七烷酸和顺-10-十七碳烯酸等脂类物质。

通过对照组（S1）与Zn2.00单一处理组（S16）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为60.48%，第二主成分（PC2）值为14.56%（图3（a））；通过对照组（S1）与Zn4.00单一处理组（S21）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为55.64%，第二主成分（PC2）值为18.81%（图4（a）），且2组数据分别在X轴两侧，表明对照组和单一锌处理组之间存在明显差异。对数据进行OPLS-DA分析，经200次排列实验验证（模型的有效性验证图如图3（b）、图4（b）所示），Q2分别为0.979、0.974，表明所建模型极好，且该模型有意义。

图2 对照组（S1）与Pb0.20单一处理组（S5）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 2 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Pb0.20 single treatment group （S5）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

图3 对照组（S1）与Zn2.00单一处理组（S16）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 3 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn2.00 single treatment group （S16）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根据代谢物差异筛选标准（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），与对照组相比，Zn2.00单一处理组有108个显著差异代谢物，Zn4.00单一处理组有85个显著差异代谢物。在这108个和85个差异代谢物中，共有65个相同的差异代谢物，其中有46个代谢物出现了显著上调（fold change≥2），包括1-甲基组氨酸、5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、谷胱甘肽、黄嘌呤、D-葡萄糖-6-磷酸、海藻糖-6-磷酸、γ-氨基丁酸、奎尼酸和柠檬酸等氨基酸、核苷酸、糖和有机酸物质；有19个代谢物出现显著下调（fold change≤0.5），包括1’-O香草酰-β-D-葡糖苷、5’-葡糖基氧代茉莉酸、芥子酸吡喃葡萄糖酯、岩白菜素、花生四烯酸和棕榈油酸等酚酸类和脂类物质。

2.3 单一铅、锌处理组与铅、锌复合处理组之间黑藻代谢物差异比较

通过Pb0.10单一处理组（S4）与Pb0.10+Zn2.00复合处理组（S19）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为45.73%，第二主成分（PC2）值为28.57%（图5（a））；通过Pb0.20单一处理组（S5）与Pb0.20+Zn4.00复合处理组（S25）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为55.82%，第二主成分（PC2）值为17.68%（图6（a）），且2组数据分别在X轴两侧，表明单一铅处理组和对应浓度的铅、锌复合处理组之间存在明显差异。对数据进行OPLS-DA分析，经200次排列实验验证（模型的有效性验证图如图5（b）、图6（b）所示），Q2分别为0.925、0.953，表明所建模型极好。横线对应原始模型的R2Y和Q2，红点和蓝点分别代表Y置换后模型的R2Y’和Q2’。R2Y’和Q2’均小于原始模型的R2Y和Q2，即相应点都不超过相应的线，说明该模型有意义。

图4 对照组（S1）与Zn4.00单一处理组（S21）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 4 Difference analysis of metabolites between control group （S1） and Zn4.00 single treatment group （S21）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

图5 Pb0.10单一处理组（S4）与Pb0.10+Zn2.00复合处理组（S19）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 5 Difference analysis of metabolites between Pb0.10 single treatment group （S4） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

根据代谢物差异筛选标准（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），与Pb0.10单一处理组相比，Pb0.10+Zn2.00复合处理组有75个显著差异代谢物；而相比Pb0.20单一处理组，Pb0.20+Zn4.00复合处理组有87个显著差异代谢物。在这75个和87个差异代谢物中，共有45个相同的差异代谢物，其中有31个代谢物出现了显著上调（fold change≥2），包括5-氨基戊酸、5-氧化脯氨酸、D-葡萄糖-6-磷酸、奎尼酸、柠檬酸和溶血磷脂酰甘油（16:0）等氨基酸、糖类、有机酸和脂质；有14个代谢物出现显著下调（fold change≤0.5），包括岩白菜素、烟酰胺和棕榈油酸等酚酸类、维生素和脂质。

图6 Pb0.20单一处理组（S5）与Pb0.20+Zn4.00复合处理组（S25）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 6 Difference analysis of metabolites between Pb0.20 single treatment group （S5） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25） Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

2.4 锌单一处理组与铅、锌复合处理组之间黑藻代谢物差异比较

通过Zn2.00单一处理组（S16）与Pb0.10+Zn2.00复合处理组（S19）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为45.54%，第二主成分（PC2）值为20.13%（图7（a））；通过Zn4.00单一处理组（S21）与Pb0.20+Zn4.00复合处理组（S25）的PCA分析，发现其第一主成分（PC1）值为38.46%，第二主成分（PC2）值为21.20%（图8（a））。且2组数据分别在X轴两侧，表明Zn2.00单一锌处理组和对应浓度的铅、锌复合处理组之间存在明显差异。对数据进行OPLS-DA分析，经200次排列实验验证（模型的有效性验证图如图7（b）、图8（b）所示），Q2分别为0.603、0.755，表明所建模型可靠，且该模型有意义。

根据代谢物差异筛选标准（fold change≥2或fold change≤0.5，且VIP≥1），与Zn2.00单一处理组相比，Pb0.10+Zn2.00复合处理组有29个显著差异代谢物，其中有25个代谢物出现了显著上调（fold change≥2），包括对羟基苯甲酸、次黄嘌呤、鸟苷、葵二酸和石榴酸等酚酸类、核苷酸、有机酸和脂质；有4个代谢物出现显著下调（fold change≤0.5），分别为L-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（顺-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）。与Zn4.00单一处理组相比，Pb0.20+Zn4.00复合处理组有17个显著差异代谢物，其中只有2个代谢物出现了显著上调（fold change≥2），分别为酚酸类的去鼠李糖异洋丁香酚苷B和对苯二甲酸；而有15个代谢物出现显著下调（fold change≤0.5），包括谷胱甘肽还原型、顺式-4-羟基-D-脯氨酸、2-脱氧腺苷、5-甲基胞嘧啶、鸟嘌呤、胸腺嘧啶、烟酰胺和延胡索酸（富马酸、反丁烯二酸）等氨基酸和核苷酸类物质。

试验结果表明黑藻在单一Pb2+胁迫后会使酚类、糖类物质含量增加，脂类物质含量减少。在引入Zn2+复合胁迫后进一步促进了黑藻的糖类物质含量增加，可见铅锌复合在促进黑藻糖类物质增加方面存在协同作用。其原因可能是植物体在受到重金属胁迫后，体内产生一系列抗逆性反应，这些反应的维持均需要糖类化合物提供大量能量。另外，在维持机体渗透压稳定方面也需要可溶性糖类起作用。

图7 Zn2.00单一处理组（S16）与Pb0.10+Zn2.00复合处理组（S19）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 7 Difference analysis of metabolites between Zn2.00 single treatment group （S16） and Pb0.10+Zn2.00 composite treatment group （S19）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

图8 Zn4.00单一处理组（S21）与Pb0.20+Zn4.00复合处理组（S25）代谢物差异分析注：（a）PCA分析得分图；（b）OPLS-DA有效性验证图。Fig. 8 Difference analysis of metabolites between Zn4.00 single treatment group （S21） and Pb0.20+Zn4.00 composite treatment group （S25）Note: （a） PCA score plots; （b） Permutation test of OPLS-DA score plots.

而黑藻在单一Zn2+胁迫后会导致氨基酸、核苷酸、糖和有机酸等物质含量增加，酚酸类和脂类物质含量减少。在高浓度胁迫下（Pb0.10+Zn2.00），铅锌复合可进一步促进Zn2+使黑藻的核苷酸、有机酸物质含量增加，抑制Zn2+使黑藻的酚酸类和脂类物质含量减少的作用，可见铅锌复合在促进黑藻核苷酸、有机酸物质增加等方面存在协同作用，在使黑藻的酚酸类和脂类物质含量减少方面存在拮抗作用；在超高浓度胁迫下（Pb0.20+Zn4.00），铅锌复合会抑制Zn2+使黑藻的氨基酸和核苷酸物质含量增加、酚酸类物质含量减少的作用，可见超高浓度的铅锌复合在使黑藻的氨基酸和核苷酸物质含量增加、酚酸类物质含量减少方面存在拮抗作用。不同浓度下产生不同结果的主要原因是植物体对于重金属胁迫的响应并不是一直持续升高的，当某种重金属浓度逐渐升高并超过某个特定阈值后，机体代谢程度往往是逐渐升高后降低并最终保持稳定的。

3 讨论（Discussion）

目前，有关代谢组学在环境领域中的应用所涉及的物种主要包括微生物、植物和动物等。在环境科学领域中，代谢组学主要研究生物机体在受到外界环境因素刺激后的代谢变化情况。与基因组学和蛋白质组学不同的是，代谢组学可以捕捉生物机体生理代谢的瞬间变化，其灵敏的变化可以用来指示或评价该环境因素对生物机体或组织器官的毒理效应[21-23]，尤其是某些代谢物的上下调可能标记着该代谢通路上的某信号缺陷或被激活[19]。由此可见，代谢组学在环境领域中的应用是可行的。

生物机体中游离的氨基酸及其衍生物，不仅能合成机体生命活动所需的各种蛋白质，还能帮助维持各种膜和蛋白质结构的稳定性，是细胞渗透调节的重要有机溶剂，具有保护膜系统、减少体内蛋白质降解和维持机体各类酶结构正常等作用，能直接或间接对机体受到的胁迫做出响应，因此氨基酸在研究机体生理机制中占有重要作用。Ruiz等[24]的研究表明缺硼状态下可抑制机体蛋白质合成，并降低硝酸还原酶活性以及硝酸盐的同化能力，从而降低植物固氮能力。酚酸类物质是一类含有酚环的有机酸，其具有杀菌的功效，广泛存在于植物体内，参与机体的各种代谢。核苷酸及其衍生物是一类由嘧啶碱基、核糖或脱氧核糖以及磷酸3种物质组成的化合物，其主要参与机体核酸的构成，同时还具有参与机体三磷酸腺苷（ATP）、脱氢辅酶等能量代谢相关的生物学功能。糖是植物进行光合作用后的产物，同时也是机体进行呼吸作用时的底物，并能为机体生长发育提供能量，因此其在植物生长发育过程中起着重要作用，且有研究表明植物在应激条件下所累积的可溶性糖可作渗透压调节剂，对机体的细胞膜和蛋白质起到保护作用[25]。维生素是维持机体健康的一类有机化合物，其不是构成机体的基础物质，也不是能量的来源，但是却能参与机体的代谢调节，在生物机体生长发育与抗性中起到重要作用。有机酸作为重要的小分子渗透调节物质，个别物质具有抗氧化功能，在抗性生理过程中同样起到至关重要的作用。Liu等[26]通过研究发现有机酸对镉有一定活化作用，且超富集生态型东南景天可通过调节其根系内有机酸的合成来适应镉的胁迫。脂质是机体中生物膜的重要组成部分，个别脂类含量的减少会直接破坏机体细胞膜结构，从而引发一系列生理问题。

基于本试验的初生代谢组学分析可知，与对照组相比，在0.10 mg·L-1和0.20 mg·L-1Pb2+单一胁迫中，共有11种相同代谢物发生同样的显著变化，出现显著上调的主要为酚酸类和糖类物质，出现显著下调的主要为脂类物质，其中涉及到苯丙氨酸代谢、糖类代谢和次生代谢产物的生物合成等生理过程，说明铅胁迫下，黑藻酚酸类物质和糖类物质起到了主要的抗性作用，同时黑藻在铅胁迫下，其机体的脂类物质减少，导致细胞膜可能受到了一定的损害。糖类的合成和分解会影响细胞的渗透性，而渗透能力的变化可以影响机体的抗逆能力，因此细胞内糖类的累积对细胞具有一定保护作用，可以增强植物的抗逆能力[27]。罗庆[28]在研究不同铅浓度下东南景天内糖类代谢物的变化中发现，随着铅浓度的升高，东南景天根系分泌物中的半乳糖、葡萄糖和麦芽糖等糖类代谢物就表现出先上调后下调的变化趋势。赵丽娟[17]的研究同样证实了这一点，在低浓度镉胁迫下，菠菜和玉米幼苗内与能量代谢相关的葡萄糖、蔗糖和半乳糖等糖类化合物含量显著上调。在铅（1 000 mg·L-1）胁迫下，萝卜根内果糖、葡萄糖和半乳糖含量升高，但镉胁迫下（400 mg·L-1）3种糖类代谢物的含量却呈现出降低的趋势。其原因推测可能是由于在面对不同浓度重金属胁迫下的反应机制存在些微差距，即在低浓度下植物体分泌糖类等物质用于富集吸收金属离子，当金属离子浓度高于机体耐受阈值便停止吸收以防止对机体产生损害[17,28]。在2.00 mg·L-1和4.00 mg·L-1Zn2+单一胁迫中，共有65种相同代谢物发生同样的显著变化，其中氨基酸及其衍生物、核苷酸及其衍生物、糖及醇类和有机酸含量均显著上调，而酚酸类和脂质含量均有部分上调，部分下调，涉及到柠檬酸盐循环（TCA循环）、精氨酸和脯氨酸代谢、糖代谢、次生代谢产物的生物合成（其他抗生素）、碳代谢和ABC转运子代谢等生理过程，说明单一锌胁迫下，促进了黑藻机体氨基酸、核苷酸和糖类等物质的合成，机体为抗击逆境进行了许多代谢调节。有研究表明，脯氨酸等氨基酸类物质会和金属离子螯合，形成稳定的螯合物从而达到解毒的作用[29]。此外Zn2+单一胁迫中谷胱甘肽与对照组（CK）相比出现显著上调，这与本研究所测定到的谷胱甘肽（GSH）含量变化一致，因此进一步验证了锌胁迫对黑藻GSH的影响。王珊珊[30]在栅藻对重金属离子的富集及其机理的研究中也发现GSH、谷胱甘肽硫转移酶（GST）与金属离子浓度呈正相关，与本实验结果相一致。由此可见，黑藻在重金属耐受过程中会合成谷胱甘肽及其相关抗氧化酶等物质以保护细胞免受伤害。本研究还发现，N苯乙酰基-L-谷氨酰胺、酪胺、对香豆酰咖啡酰酒石酸、没食子鞣质和异水杨酸-O-葡萄糖只在单一铅胁迫组中发生了显著变化，因此这几种代谢物或许可以作为铅胁迫的代谢标志物，而5-氨基戊酸、L-（+）-精氨酸、L-冬胺基乙酸-L-苯丙胺基乙酸和L-焦谷氨酸等多个代谢物只在单一锌胁迫组中发生了显著变化，因此这些代谢物或许可以作为锌胁迫的代谢标志物。另外，本研究还发现芥子酸吡喃葡萄糖酯和香草酸葡萄糖苷这2种代谢物在单一铅胁迫中表现为显著上调，而在单一锌胁迫中表现为显著下调，说明这2种代谢物的含量或许可以作为区分铅、锌胁迫的指示代谢物。

在复合胁迫中，Pb0.10+Zn2.00和Pb0.20+Zn4.00处理组与相应的单一铅处理组相比，共有45种相同代谢物发生同样的显著变化，出现显著上调的主要为氨基酸、糖类、有机酸和脂质，出现显著下调的主要为酚酸类、维生素和脂质，其中涉及到柠檬酸盐循环（TCA循环）、精氨酸和脯氨酸代谢、谷胱甘肽代谢、糖代谢、次生代谢产物的生物合成和碳代谢等生理过程，说明相比单一铅胁迫，铅锌复合胁迫后黑藻机体内的机体受到的刺激增大，体内产生大量的氨基酸、糖类等物质来对抗不良环境。高慧兵[31]在研究中也提到，在铅锌复合胁迫时，蓖麻叶片中脯氨酸含量随胁迫浓度的增加而增加，可能是高浓度胁迫时锌、铅发生协同作用，毒性增强，导致作为清氧剂的脯氨酸积累量增加，以调节细胞渗透压，缓解高浓度重金属的迫害。郭晓音等[32]的研究也证实了这一点，在高浓度锌（或镉）的加入与土壤中的镉（或锌）发生协同作用，导致秋茄中的渗透调节物质脯氨酸、有机酸的积累量增加，以缓解高浓度重金属的胁迫；另外，在复合胁迫下有多种脂质代谢物显著上调，其原因可能是铅锌胁迫后，对黑藻细胞膜的伤害增大，此时机体通过不断地合成脂质来修补重金属对细胞的伤害；铅锌复合可进一步促进Pb2+使黑藻的糖类物质含量增加的作用，说明黑藻体内的糖类物质很有可能与超氧化物歧化酶（SOD）活性、脯氨酸（Pro）合成以及其他抗氧化酶或物质成正相关。Pb0.10+Zn2.00处理组与Zn2.00单一胁迫相比有29个代谢差异物，其中有25种代谢物含量显著上调，主要为酚酸类、核苷酸、有机酸和脂质，有L-茶氨酸、谷胱甘肽、PE（18:3/18:3+O3）和二十碳五烯酸（顺-5,8,11,14,17）/EPA（C20:5）4个代谢物出现下调。Pb0.20+Zn4.00处理组与Zn4.00单一胁迫相比有17个代谢差异物，其中15种代谢物含量显著下降，主要为氨基酸类和核苷酸类；2种代谢物含量上升，均为酚酸类，说明超高浓度Pb2+、Zn2+复合胁迫与单一Zn2+胁迫相比抑制了黑藻氨基酸、核苷酸的合成，导致黑藻机体抗性能力的下降，说明黑藻中氨基酸和核苷酸是机体抗氧化代谢途径中重要的组成部分。从本研究结果中可发现，2组铅锌复合胁迫处理与相应的单一铅处理组之间有共同的差异代谢物，而与相应的单一锌处理组之间没有共同的差异代谢物，因此初生代谢物一定程度上可以协助统一探讨铅锌复合胁迫与单一铅胁迫之间生理代谢的区别，但在探讨铅锌复合胁迫与单一锌胁迫之间生理代谢区别时可能需要根据不同情况具体去分析。

综上所述，铅单一胁迫主要可促进黑藻机体酚酸类和糖类物质的生成，抑制脂类的生成。锌单一胁迫对机体代谢物的影响较多，其中可主要促进氨基酸、核苷酸、糖类和有机酸等代谢物的生成，抑制部分酚酸类和脂质代谢物的生成。相比单一铅胁迫，铅锌复合胁迫可主要促进黑藻氨基酸、糖类、有机酸和脂质等代谢物的合成，抑制酚酸类、维生素和脂质等代谢物的合成。相比单一锌胁迫，高浓度铅锌复合胁迫（Pb0.10+Zn2.00）可主要促进酚酸类、核苷酸、有机酸和脂质等代谢物的合成，抑制以谷胱甘肽为代表的氨基酸等代谢物的合成；超高浓度铅锌复合胁迫（Pb0.20+Zn4.00）可主要促进对苯二甲酸和去鼠李糖异洋丁香酚苷B 2种酚酸类代谢物的合成，抑制氨基酸、核苷酸、维生素和有机酸等代谢物的合成。