异菌脲在油菜植株、土壤和水中的代谢途径及代谢物3,5-DCA的毒性研究

汪震，华修德，施海燕，王鸣华

南京农业大学植物保护学院，南京 210095

异菌脲（iprodione）是二甲酰亚胺类高效广谱保护性杀菌剂。其作用机理是抑制蛋白激酶，控制许多细胞功能的细胞内信号，包括与碳水化合物结合进入真菌细胞组分，起到干扰作用，既可抑制真菌孢子萌发和产生，也可抑制菌丝生长，主要防治由灰葡萄孢属[1]、丛梗孢属[2]、核盘菌属[3]、小菌核菌属和交链孢属[4]等引起的多种蔬菜、果树和果实贮藏期病害[5]。据中国农药信息网统计，目前我国登记的含有异菌脲的产品有161个，其中登记在油菜上防治油菜菌核病的产品有9个。

化学农药的代谢产物和代谢途径受环境因素影响其转化过程复杂多样[6]。研究证明，有些农药代谢物的毒性比母体化合物更大。例如，Zhang等[7]通过细胞毒性试验发现丙硫菌唑的主要代谢物脱硫丙硫菌唑的细胞毒性高于母体；Gao等[8]研究发现乙虫腈的代谢产物乙虫腈亚砜对斑马鱼的毒性是母体的6倍；Liu等[9]报道了吡丙醚在5种土壤中的主要降解产物4-羟基-吡丙醚对蚯蚓的毒性远高于母体吡丙醚。因此，研究和评估农药代谢产物的环境风险对食品安全和生态安全具有重要的意义[10-12]。研究表明，异菌脲在植物表面主要通过脱卤反应发生代谢[13]。此外，研究发现3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）是二甲酰胺类杀菌剂（异菌脲、腐霉利和乙烯菌核利）在植物和环境中的代谢产物之一。Ambrus等[14]报道了二甲酰亚胺类杀菌剂在大豆、黄瓜和花生等植物上的主要代谢物之一为3,5-DCA。Rifai等[15]发现3,5-DCA是腐霉利的光解产物。美国环境保护局（U.S. Environmental Protection Agency, US EPA）报道了3,5-DCA比母体化合物具有更强的毒性和持久性[16]。Dom等[17]研究发现，3,5-DCA对羊角月牙藻的72 h-EC50值为14.5 mg·L-1，对大型溞的48 h-EC50值为0.60 mg·L-1。Lai等[18]研究发现异菌脲代谢产物3,5-DCA对斑马鱼成鱼的毒性高于母体异菌脲。因此，联合国粮食与农业组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations, FAO）规定乙烯菌核利的残留定义为乙烯菌核利及其所有含3,5-DCA部分的代谢产物之和[19]。异菌脲在我国主要用于防治油菜菌核病，其在发挥药效作用的同时，也会对环境造成污染，还会降解产生代谢产物。因此，开展异菌脲在油菜上的代谢研究至关重要，有助于明确其代谢途径。同时研究异菌脲代谢产物3,5-DCA的生态毒性对于异菌脲的风险评估具有重要的意义，可为异菌脲的残留物定义提供参考信息。本文通过室内模拟试验，采用UPLC-TOF-MS/MS研究异菌脲在油菜植株、土壤和水中的代谢产物，推测异菌脲可能的代谢途径，并研究了代谢产物3,5-DCA对Hep G2细胞和蚯蚓的毒性。

1 材料与方法（Materials and methods）

1.1 供试材料

供试土壤：选用江苏省南京市0～20 cm未被污染的耕作层土壤，实验前先将土壤活化一周，将活化后的土壤室内阴干，过2.0 mm筛，置于常温下备用。供试油菜：采用甘蓝型油菜品种（扬油1号），油菜籽购于江苏金土地种业有限公司。细胞株：选用肝癌Hep G2细胞系为体外实验模型，由中国科学院细胞库提供。供试蚯蚓：赤子爱胜蚓（Eiseniafoetida），由江苏省镇江市句容蚯蚓养殖场提供，并在实验室条件下饲养14 d后，选择体质量在0.30～0.60 g的具有生殖环带的蚯蚓进行实验。

1.2 试剂与仪器

异菌脲标准品（99.5%，上海安谱实验科技股份有限公司）；3,5-DCA标准品（98%，上海迈瑞尔化学技术有限公司）；色谱纯正己烷、乙腈、甲醇（美国TEDIA公司）；CCK-8试剂盒（北京Solarbio生物有限公司），其他化学试剂均为分析纯。岛津LC 20ADXR液相色谱（Shimadzu，日本）串联AB SCIEX Triple TOF 5600质谱仪（AB SCIEX，美国）；Forma Series II二氧化碳培养箱（美国Thermo Electron）；M5多功能酶标仪（美国Molecular Dexices）。

1.3 水解

用pH 7的Clark-Lubs缓冲溶液配制5 mg·L-1异菌脲标准溶液，超声混匀，分装于棕色容量瓶中，置于25 ℃的恒温培养箱中避光密闭培养，于0、3、6、12、24和48 h采集水样分析，设3个重复。

1.4 土壤降解

参照《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270—2014），准确称取50.0 g土壤，加入5 mL浓度为200 mg·L-1的异菌脲丙酮溶液，搅拌均匀，置于避光通风处，待有机溶剂挥发后，再与200 g土壤充分混合，使土壤中的终浓度为4 mg·kg-1，分装在50 mL离心管中（每管10.0 g），含水量保持在饱和持水量的60%，置于（25±1） ℃黑暗的恒温恒湿培养箱中培养，分别在0、3、7、14、21、35和63 d取样分析。记录所有离心管的原始质量，培养过程中每2 d添加水分使质量保持初始水平，保持土壤原有的持水量。另设不加异菌脲的土壤作为空白对照和溶剂对照，设3个重复。

1.5 植物代谢

按照文献方法[20-22]，对油菜种子进行消毒和萌发。萌发后选取5～7叶期的健康幼苗，将其移至含Hogland营养液培养瓶中，待其稳定生长后，用小型手持式喷雾在油菜叶表面均匀喷施50 mL 10 mg·L-1的异菌脲水溶液（含0.1% Triton X-100），置于恒温培养箱内（光周期14 h·d-1，温度（25±1） ℃，相对湿度75%）培养。在处理后的3 h、6 h、1 d、3 d、6 d、9 d和16 d采集植株样品检测，每次随机取3株。另设不施药的空白对照和溶剂对照。

1.6 样品分析方法

1.6.1 样品提取

土壤：称取土壤样品10.0 g于50 mL离心管中，添加5 mL水和30 mL乙腈，涡旋10 min后再超声15 min，加入2.0 g无水MgSO4和3.0 g NaCl，涡旋5 min，随后以4 000 r·min-1离心5 min，取一半上清液过无水Na2SO4后减压浓缩，2 mL色谱乙腈溶解定容，过0.22 μm滤膜，待测。

油菜植株：称取剪碎后的油菜植株样品10.0 g于250 mL三角瓶中，加入10 mL水和30 mL乙腈，振荡1 h，抽滤后置于含有3.0 g NaCl的具塞量筒中，充分振荡1 min，静置30 min，取一半上清液，减压浓缩，用2 mL色谱乙腈定容，过0.22 μm滤膜，待测。

水样：取2 mL水样直接进样分析。

1.6.2 LC-MS仪器检测条件

LC-MS的分析采用岛津LC 20ADXR液相色谱串联AB SCIEX Triple TOF 5600质谱仪，色谱柱Poroshell 120 EC-C18（2.1 mm×50 mm，2.7 μm；Aglient），流速0.3 mL·min-1，进样体积5 μL，流动相由0.1%甲酸水（A）和甲醇（B）组成，采用梯度洗脱：0～0.5 min，90% A；0.5～2.5 min，90%～40% A；2.5～9.0 min，40% A；9.0～10.0 min，40%～5% A；10.0～14.0 min，5% A；14.0～14.2 min，5%～90% A；14.2～16.0 min，90% A。分析时间16 min。

质谱参数：多反应监测模式下，Q-TOF-MS电离模式采用电喷雾离子化正离子源（ESI+），m/z扫描范围50～500，离子喷雾电压5 500 V，源温度550 ℃，雾化气4.48×106Pa，加热气4.48×106Pa，帘气2.41×106Pa去簇电压80 V，碰撞能量40 V，碰撞能量扩散20 eV，离子释放延迟67 ms，离子释放宽度25 ms。

1.7 细胞毒性

细胞毒性测定选用细胞检测试剂盒（CCK-8）检测细胞增殖活性。将生长至对数期的Hep G2细胞以1×105～4×105个·mL-1的初始密度接种于96孔板中，每孔100 μL，将培养板放在培养箱中预培养24 h（37 ℃、5% CO2）；吸出培养液换为不同浓度的含药培养液（异菌脲浓度为50、100、200、250和300 mg·L-1；3,5-DCA浓度为25、50、100、150和200 mg·L-1），染毒24 h；向每孔加入10 μL的CCK-8溶液，将培养板在培养箱内孵育4 h；用酶标仪测定450 nm处的吸光度值。按式（1）计算细胞抑制率。

细胞抑制率=[（Ac-As）/（Ac-Ab）]×100%

（1）

式中：As为试验孔吸光度（含有细胞和待测物的培养基）；Ac为对照组吸光度（含有细胞的培养基，无待测物）；Ab为空白孔吸光度（含有培养基，不含细胞和待测物）。

1.8 蚯蚓毒性

按照《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270—2014）中蚯蚓急性毒性人工土壤法进行3,5-DCA对蚯蚓的急性毒性实验，设7个浓度组（10、20、30、40、50、60和70 mg·kg-1），并设空白对照组和溶剂对照组。每个浓度设3个重复，每个重复10条蚯蚓。观察并记录蚯蚓的中毒症状和死亡数（用针轻触蚯蚓尾部，蚯蚓无反应则为死亡），及时清除死蚯蚓。统计第7天和第14天的死亡率，计算LC50。同时使用氯乙酰胺作为参比物质中测定蚯蚓对化合物的敏感性。

2 结果与讨论（Results and discussion）

2.1 异菌脲在水中代谢产物的鉴定及代谢途径分析

异菌脲及其代谢产物在水中的提取离子图如图1（a）所示。在保留时间为11.81、7.98、8.00、6.91、11.46、11.76和6.53 min分别发现了代谢产物M1（C13H15Cl2N3O4）、M2（C12H15Cl2N3O2）、M4（C8H8Cl2N2O）、M5（C13H14ClN3O3）、M7（C9H6Cl2N2O2）、M8（C9H8Cl2N2O3）和M9（C6H5Cl2N）。根据各代谢产物的分子离子峰、质荷比、典型碎片、二级质谱信息及文献，确定了代谢物的结构，如表1所示。

图1 异菌脲（IPR）及其代谢产物在水（a）、油菜植株（b）和土壤（c）样品中的提取离子图Fig. 1 Extracted ion chromatograms of iprodione （IPR） and its metabolites from UPLC-TOF-MS/MS analysis in water （a）, rape plant （b） and soil （c） samples

根据代谢产物推断异菌脲在水中可能的代谢途径，如图2所示。因为异菌脲是二甲酰亚胺类杀菌剂，结构式中二氧代咪唑烷的酰胺键不稳定，易发生水解反应。此外，还发生了C—N键断裂，N-脱烷基化反应。异菌脲（M0）二氧代咪唑烷4号位酰胺键发生水解形成一级代谢产物M1；2号位的羰基水解形成M2，M2的脲酰胺键断裂产生代谢物M4。异菌脲苯环上脱去Cl原子形成M5；还可以通过水解作用形成M7，M7的咪唑烷继续水解形成代谢物M8，最终水解形成代谢物3,5-DCA（M9）。

2.2 异菌脲在油菜植株中代谢产物的鉴定及代谢途径分析

异菌脲及其代谢产物在油菜植株上的提取离子图如图1（b）所示。保留时间11.81、12.30、11.54和11.46 min分别为M1、M3（C11H13Cl2N3O2）、M6（C10H7Cl2N3O3）和M7这4种代谢物。M3和M6结构式如表1所示。

植物对外源化合物的解毒代谢主要分为3个阶段，其中Ⅰ相代谢是由植物酶介导的催化反应和非生物降解过程，包括氧化、水解和还原等[23]。参与Ⅰ相代谢的酶主要包括植物细胞色素P450、漆酶、含铜多酚的氧化酶、羧酸酯酶和硝基还原酶等[24]。同时农药在植物角质层还会发生光解和非酶介导的水解[25]。Ⅰ相代谢是植物代谢最重要的一步，起到解毒作用。Liu等[26]研究报道了玉米体内P450酶参与了烟嘧磺隆的降解过程；Huang等[27]鉴定表达了水稻2个水稻漆酶基因（LOC_Os01g63180和LOC_Os12g15680），发现能降解莠去津和异丙隆，并检测到相应代谢物羟基脱氢莠去津（HDHA）和2-OH-异丙基-异丙隆。异菌脲在油菜植株中可能的代谢途径如图2所示。进入油菜植株的异菌脲首先进行Ⅰ相代谢，通过水解作用产生M1、M3、M6和M7共4种代谢物，后3种与Ambrus等[14]的研究结果一致，而M1首次在油菜中发现。代谢物M1也在水解试验中发现，因此可能是M1由植物表面非酶介导的水解过程中产生。综合分析异菌脲在油菜上产生的代谢产物，推测异菌脲在油菜上的代谢是由于多种植物酶介导的体内代谢与非酶介导的化学降解共同作用的。

2.3 异菌脲在土壤中代谢产物的鉴定及代谢途径分析

异菌脲在土壤中代谢产物的提取离子图如图1（c）所示，发现了5种代谢物（M1、M3、M6、M7和M8）。由图2可知，异菌脲在土壤中的降解途径主要是通过非生物降解为代谢物M1和M3，通过生物降解为代谢物M6、M7和M8。Athiel等[28]和Mercadier等[29]提出了土壤微生物降解异菌脲的代谢途径，微生物可将异菌脲水解为N-（3,5-二氯苯基）-咪唑啉-2,4-二氧咪唑烷（M7）和3,5-二氯苯基脲-乙酸（M8）。Campos等[30]从土壤中分离出菌株C1通过水解可产生代谢物M7和M8。可见，异菌脲在土壤中的降解包括水解酶参与的微生物降解，通过水解反应形成代谢产物M7和M8。此外，本文还检测出代谢产物M6，推测M6是降解过程中的中间产物。Athiel等[28]研究发现，异菌脲可通过非生物转化形成N-（（3,5-二氯苯基）氨甲酰基）-N-（异丙基氨甲酰基）甘氨酸，与本文M1的分子质量和结构式一致，因此推测代谢物M1和M3是通过化学水解形成，是非生物降解途径。

表1 异菌脲及其代谢产物的质谱信息汇总Table 1 Summary of all MS and MS2 data for metabolites of iprodione

图2 异菌脲在水、油菜植株和土壤中可能的代谢途径Fig. 2 Proposed pathways of iprodione in water, rape plants and soil

通过对异菌脲在土壤、水和油菜植株中的代谢产物及代谢途径研究发现，异菌脲在土壤中的代谢主要是微生物参与的水解反应，在水相中的代谢主要为化学水解，在油菜植株中主要为降解酶参与的N-脱烷基化和水解反应。因此，推测异菌脲的水解作用是其在环境和植株中代谢的主要机制。

2.4 异菌脲及其代谢产物3,5-DCA的细胞毒性

如表2所示，异菌脲对Hep G2的IC50为304.8 mg·L-1，代谢物3,5-DCA的IC50为99.7 mg·L-1，3,5-DCA对Hep G2细胞毒性是异菌脲的3.1倍，表明异菌脲的代谢属于增毒代谢。3,5-DCA也是乙烯菌核利的代谢产物，Lee等[31]等研究发现3,5-DCA对Hep G2细胞株的存活率有显著影响，IC50为70.48 mg·L-1，而经228.89 mg·L-1乙烯菌核利暴露的Hep G2细胞的存活率没有显著下降，表明其对细胞的毒性也显著高于母体。

2.5 3,5-DCA对赤子爱胜蚓的急性毒性

参比试验结果显示14 d-LC50为28.15 mg a.i.·kg-1（干质量），达到国标中规定的20～80 mg a.i.·kg-1（干质量）范围，证明实验蚯蚓对化合物敏感，可用于后续试验。

人工土壤法测定3,5-DCA对赤子爱胜蚓急性毒性结果如表3所示。结果显示，3,5-DCA对赤子爱胜蚓7 d、14 d-LC50分别为53.29 mg·kg-1和31.56 mg·kg-1。根据《化学农药环境安全评价试验准则》（GB/T 31270—2014）中农药对蚯蚓的毒性等级划分，3,5-DCA对赤子爱胜蚓为低毒（>10 mg·kg-1）。根据国际纯粹与应用化学联合会（International Union of Pure and Applied Chemistry, IUPAC），人工土壤法下异菌脲对赤子爱胜蚓急性毒性的LC50>500 mg·kg-1，3,5-DCA对赤子爱胜蚓急性毒性约为其母体的15倍以上。由此可知，异菌脲在代谢过程中增加了对土壤生物蚯蚓的毒性效应。

本文通过高分辨质谱，鉴定了异菌脲在水中的7种代谢产物（M1、M2、M4、M5、M7、M8和M9）、土壤中的5种代谢物（M1、M3、M6、M7和M8）和油菜植株中的4种代谢产物（M1、M3、M6和M7），推测了异菌脲的代谢途径。其中，代谢产物M4和M5为首次在水中发现，M1是油菜植株中新发现的代谢产物，完善了异菌脲的代谢途径。异菌脲在油菜上的代谢途径与其在大豆、黄瓜和花生中的代谢途径相同，主要是通过酰胺键的裂解（水解作用）和C—N键断裂（N-脱烷基化）。细胞毒性和蚯蚓毒性试验结果表明异菌脲的代谢属于增毒代谢。本文探究了异菌脲在水、土壤和油菜中的代谢产物和代谢途径，明确了异菌脲在作物和环境中的代谢途径，并为异菌脲及其代谢物3,5-DCA的生态风险评估提供了相关理论依据。

表2 异菌脲和3,5-二氯苯胺（3,5-DCA）的细胞毒性Table 2 Cytotoxicity of iprodione and 3,5-dichloroaniline （3,5-DCA）

表3 3,5-DCA对赤子爱胜蚓LC50Table 3 The LC50 of 3,5-DCA to Eisenia foetida