壬基酚异构体NP42对小鼠RAW264.7巨噬细胞的损伤作用

刘晓珍，卢培泉，李福香，祝兆亮，苏梓烁，黄丹菲，谢明勇*

（1 东莞理工学院化学工程与能源技术学院 食品营养健康与智能化加工研究中心 广东东莞 523808 2 南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌 330047）

壬基酚（Nonylphenol，NP）是壬基酚聚氧乙烯醚 （Nonylphenol polyoxyethylene ethers，NPEs）的生物降解产物，是带有1 个苯环和9 碳侧链化合物的总称，存在多种同分异构体。由于其结构和β-雌二醇具有一定的相似性，能够模拟β-雌二醇的功能与活性，从而表现出雌激素效应，因此NP被认为是一种环境内分泌干扰素（Environmental endocrine disruptors，EEDs）。研究证实，NP 能够对啮齿类[1]、鱼类[2]、蛙类[3]、水生甲壳类动物[4]等生物产生内分泌干扰效应，严重干扰生殖系统和神经系统。

大量研究指出壬基酚在各种食品，例如瓜果蔬菜、鸡鸭鱼肉当中有较高浓度的暴露，且人类可能因食用被壬基酚污染的食物，使得壬基酚进入人体并在体内蓄积，影响生殖、神经、免疫等系统，对人类健康产生潜在影响[5-6]。目前，已经认可高剂量的特定环境内分泌干扰物会导致内分泌、生殖或者神经学的问题，然而关于低剂量NPs 暴露的健康问题鲜有报道，对壬基酚进行低剂量暴露下生物毒性研究、风险评估，以及对其建立限制标准显得尤为重要。

研究表明NP 的生物效应高度依赖于其侧链结构，不同的NP 异构体由于侧链结构不同，导致其对生物体的毒害效应存在显著差异[7]。然而目前的研究多以工业壬基酚为研究对象，而工业壬基酚是由多种NP 异构体组成的混合物，由于不同工业壬基酚各异构体的组成及比例不同，因此导致研究结果不一致[8]。选用纯度较高的NP 单体来进行活性研究十分必要。9 碳侧链位于羟基对位的壬基酚，被称为对壬基酚或4-壬基酚（4-NP），是最常见的壬基酚形式，也是研究报道最多的壬基酚形式。

近年来，关于壬基酚生物毒性的研究报道越来越多，然而，对于壬基酚可产生免疫毒性促进肿瘤发生的相关分子机制尚不清楚，现阶段还未发现利用壬基酚异构体单体进行免疫系统损伤效应的研究。巨噬细胞在宿主免疫应答过程中扮演重要角色，当它们被激活时，能够抑制各种肿瘤细胞的生长[9]。本研究评估低剂量的NP42暴露对小鼠RAW264.7 巨噬细胞的毒性效应。利用高纯度的壬基酚异构体NP42作用于RAW264.7 巨噬细胞，通过检测细胞TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表达、cAMP/cGMP-PKC-p38MAPK 信号通路等免疫相关参数，探讨NP42对小鼠巨噬细胞的免疫毒性作用及相关分子机制，从而深入认识壬基酚异构体NP42的免疫损伤效应。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

小鼠巨噬细胞RAW264.7 细胞系，上海细胞生物研究所。

NP42单体（结构见图1），德国Guenther 教授实验室 （Institute for Chemistry and Dynamics of the Geosphere，Research Centre Juelich，Germany）惠赠；胎牛血清、RPMI 1640 培养基，美国Hyclone公司；噻唑蓝（3-（4，5-dimethyl-2-thiazolyl）-2，5-diphenyl-2-Htetrazolium bromide，MTT），美国Sigma 公司；cAMP Elisa 试剂盒、cGMP Elisa 试剂盒，南京建成生物工程研究所；Western 及IP 细胞裂解液、BCA 蛋白质量浓度测定试剂盒，碧云天生物技术研究所；PKC 蛋白抗体，博士德生物技术有限公司；p38、p-p38 蛋白抗体，美国Cell Signaling Technology 公司。

图1 壬基酚异构体NP42 的结构式Fig.1 The structure of NP42

1.2 仪器与设备

Milli-Q50 超纯水净化系统，美国Millipore 公司；倒置相差显微镜，日本Olympus 公司；超净工作台，上海一恒科技有限公司；高速冷冻离心机，美国Sigma 公司；Varioskan Flash E33 全波长多功能酶标仪、细胞培养箱3110 Series II，美国Thermo Electron 公司；电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；超低温冰箱，青岛海尔电冰箱股份有限公司；立式压力蒸汽灭菌器，上海申安医疗器械厂；垂直电泳-转膜装置、ChemDoc XRS+化学发光成像系统，美国BIO-RAD 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 小鼠RAW264.7 巨噬细胞的培养 用含10%胎牛血清的RPMI 1640 培养基，在37 ℃、5%CO2细胞培养箱中，培养小鼠RAW264.7 巨噬细胞，选用对数生长期良好的细胞用于后续实验。

1.3.2 细胞存活率测定 采用MTT 法检测细胞存活率。将RAW264.7 细胞以1×104个/孔接种至96 孔板，置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养6 h。加入不同浓度NP42（0，0.1，1.0，10，100 μmol/L）处理24 h 后，每孔加入20 μL MTT 溶液（5 mg/mL），37℃继续孵育4 h，终止培养。小心吸弃孔内培养上清液，每孔加入150 μL 二甲基亚砜（Diphenylamine，DMSO），振荡10 min，使结晶物充分溶解，选择570 nm 波长，在多功能酶标仪上测定各孔光吸收值，根据OD样品/ODControl×100%计算细胞存活率[10]。

1.3.3 ELISA 检测cAMP 和cGMP 含量 将细胞以2×105个/孔接种于6 孔板，经不同浓度NP42（0，0.1，1.0，10 μmol/L） 处理24 h 后，收集，PBS 洗2次，利用液氮/37 ℃反复冻融3 次，4 ℃，12 000 r/min 离心10 min，收集上清液。用Elisa 法检测cAMP 和cGMP 的活力，操作方法按Elisa 试剂盒说明进行。

1.3.4 Western blot 检测蛋白表达 将细胞以2×105个/孔接种至6 孔培养板中，经不同浓度NP42（0，0.1，1.0，10 μmol/L）处理24 h 后，预冷PBS 洗涤3 次，收集细胞，按照Western 及IP 细胞裂解液说明书要求提取细胞蛋白，再根据BCA 蛋白质量浓度测定试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后等量蛋白上样，进行SDS-PAGE 凝胶电泳（50 V 电压，30 min；100 V 电压，55 min），湿法转印至NC 膜。转印完毕后，NC 膜经0.1%牛血清白蛋白封闭2 h，TBST 洗3 遍后，用稀释后的PKC、p38、p-p38一抗4 ℃孵育过夜。孵育过夜后，小心把NC 膜转移至装有TBST 溶液的平皿中，振荡洗膜3 遍，每遍10～15 min。再用辣根过氧化物酶（Horse radish peroxidase，HRP）标记二抗（1∶5 000）孵育2 h，TBST 溶液振荡洗膜3 遍，每遍10～15 min。采用ECL 化学发光显色反应，应用全能型凝胶成像分析系统成像、Quantity One 软件分析[10]。

1.3.5 反转录PCR 将RAW264.7 细胞以2×105个/孔接种至6 孔培养板中，置于37 ℃，5%CO2培养箱中培养6 h。NP42处理24 h 后，用预冷PBS 洗涤3 次，收集细胞，按照Trizol 试剂法提取细胞的总RNA。用反转录试剂盒在20 μL RNA 反转录反应体系中反转录得到cDNA，以此为模板进行PCR 扩增，引物系列见表1。PCR 反应条件：94 ℃3 min，94 ℃30 s，60 ℃30 s，72 ℃2 min，72 ℃10 min，循环次数均为30 次，取扩增产物6 μL 进行电泳[10]。

表1 反转录PCR 引物序列Table 1 Oligonucleotide primer sequences for quantitative RT-PCR

1.4 数据统计分析

2 结果与分析

2.1 NP42 对小鼠RAW264.7 巨噬细胞存活率的影响

巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，有多种功能，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象。有研究报道NP 通过减弱小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，从而抑制小鼠的免疫功能，然而其分子机制还不明确[11-12]。本研究中探讨了NP42对小鼠RAW264.7 巨噬细胞的毒性效应及其相关的分子机制。

不同浓度NP42对RAW264.7 细胞存活率的影响如图1所示，与对照组相比，低浓度NP42（0.1，1.0，10 μmol/L） 处理24 h 能够降低RAW264.7 细胞的存活率，然而无显著性影响。当NP42浓度上升到100 μmol/L 时，能显著引起细胞的死亡（P ＜0.01），并且在显微镜下可以明显观察到细胞损伤状态。该结果与本实验室前期报道的NP42对小鼠Sertoli TM4 细胞的细胞毒性结果相一致[13]。因此，在后续相关分子机制研究中选用NP42浓度为0.1，1.0，10 μmol/L。

2.2 NP42 对RAW264.7 细胞内TNF-α mRNA及iNOS mRNA 表达的影响

TNF-α 主要由活化的巨噬细胞产生，通过细胞膜上的特异性受体向细胞核传递信息，从而促进细胞增殖分化，产生免疫调节、炎症介导、抗肿瘤等复杂的生物学活性[14]。NO 被证实参与了宿主的非特异性免疫、巨噬细胞介导的杀伤、抑制肿瘤细胞的增殖等过程[15-16]。在哺乳动物中，已鉴定有3 类一氧化氮合酶 （Nitric oxide synthase，NOS），分别为内皮型一氧化氮合酶eNOS，神经元型一氧化氮合酶nNOS，诱导型一氧化氮合酶（iNOS），其中iNOS 是NO 合成的主要酶，iNOS 的表达决定了NO 的合成。

图2 不同浓度NP42 对RAW264.7 巨噬细胞存活率的影响Fig.2 Effect of different concentrations of NP42 on cell survival rate in RAW264.7 cells

本实验中，采用RT-PCR 检测了NP42对RAW264.7 细胞内TNF-α mRNA 及iNOS mRNA表达的影响，结果如图3和图4所示。结果显示，10 μmol/L NP42显著降低TNF-α mRNA 的表达（P ＜0.01，图3）。由图4可知，与空白对照组相比，NP42处理能够显著抑制细胞内iNOS mRNA 的表达（P ＜0.05），其中浓度为10 μmol/L 时，表现为极显著（P ＜0.01）。这表明NP42可对RAW264.7 细胞造成损伤，导致TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 表达降低，可能进一步导致TNF-α 和NO 合成下降。You 等[17]研究发现4-NP 能够在小鼠原代腹膜巨噬细胞和RAW264.7 细胞内抑制脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）诱导的TNF-α 和NO 的生成，并且能够抑制TNF-α mRNA 及iNOS mRNA 的表达，与本实验研究结果一致。Lee 等[18]同样发现，NP 能够抑制B 淋巴细胞和巨噬细胞内NO的分泌和TNF-α mRNA 及iNOS mRNA 的表达，影响细胞的免疫应答，从而抑制了机体抵抗肿瘤发生的能力。综上，研究推测NP42可能通过抑制TNF-α 和NO 的生成以及抑制TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表达从而影响机体的免疫功能。

图3 不同浓度NP42 对巨噬细胞TNF-α mRNA 的表达的影响Fig.3 Effect of different concentrations of NP42 on the mRNA expression of TNF-α

图4 不同浓度NP42 对巨噬细胞iNOS mRNA 表达的影响Fig.4 Effect of different concentrations of NP42 on the mRNA expression of iNOS

2.3 NP42 对RAW264.7 细胞内cAMP、cGMP含量的影响

环境内分泌干扰物能够影响非甾醇类激素信号通路发挥作用，例如腺苷酸环化酶（Cyclic adenosine mono-phos-phase，cAMP）[19]、磷酸肌醇[20]以及Ca2+信号通路[21]。其中，cAMP 和cGMP 在许多器官调节细胞功能中起着非常重要的作用 （如增殖、分化、细胞凋亡、基因转录）[22-23]。正常情况下，cAMP 与cGMP 含量相对稳定并维持一定的比例，若二者比例发生改变就会引起机体功能失调而导致疾病[24]。本研究检测了NP42对RAW264.7细胞内cAMP、cGMP 含量的影响。结果如图5所示，与对照组相比，在0.1，1.0，10 μmol/L NP42处理24 h 后，RAW264.7 细胞内cAMP 的含量显著降低 （P ＜0.01）（图5a）。巨噬细胞内存在1 个cAMP-PKA 途径调节免疫应答，cAMP 活性的降低，可引起PKA 等下游信号的激活，这可能是NP42造成细胞损伤的原因之一。另一方面，NP42处理能够显著上调RAW264.7 细胞内cGMP 的含量（浓度为0.1 μmol/L 时，P ＜0.05；浓度为1.0，10 μmol/L 时，P ＜0.01，图5b）。这与曹凤华[25]报道小鼠经不同浓度气态甲酵染毒后，各器官组织中cGMP 含量随染毒浓度升高而上升相一致，表明NP42可能通过调控cGMP 的表达来发挥损伤效应。

图5 NP42 对细胞内cAMP 活性和cGMP 含量的影响Fig.5 Effects of NP42 on the content of cAMP and cGMP

2.4 NP42 对RAW264.7 细胞内PKC 蛋白表达的影响

蛋白激酶（Protein kinases，PK）能够催化蛋白质的磷酸化过程，主要包括以cAMP 依赖的蛋白激酶PKA，cGMP 依赖的蛋白激酶PKG 及钙和磷脂依赖的蛋白激酶PKC，通过检测效应物（如PKC蛋白）和第二信使（如cAMP、cGMP），可以很好地说明被检测物发挥作用时经由的信号通路[26]。如图6所示，实验结果发现，细胞经不同浓度NP42处理后，NP42在0.1，1.0 μmol/L 时，显著下调了PKC 蛋白的表达（P ＜0.05），在浓度为10 μmol/L时，极其显著地下调了PKC 蛋白的表达（P ＜0.01），说明NP42会通过干扰钙和PKC 信号通路来对巨噬细胞产生免疫毒害作用。

图6 NP42 对细胞PKC 蛋白表达的影响Fig.6 Effect of NP42 on the protein expression of PKC

2.5 NP42 对p38-MAPK 信号通路的影响

目前认为，环境内分泌干扰物等外源性雌激素主要通过两种方式发挥毒性或者内分泌干扰作用[27]，其中之一依赖于雌激素受体的激活，另一种是触发细胞内各种信号级联，主要包括cAMP 途径、PKC、钙离子通路（Ca2+）、磷脂酰肌醇3 激酶（Phosphoinositide 3 kinase，PI3K） 信号通路、MAPK 信号通路等。其中MAPK 信号通路在细胞的增殖、分化、凋亡以及对环境刺激的反应等方面起重要作用。在哺乳动物细胞中鉴定了3 个MAPKs 家族成员：ERK、JNK、p38 激酶。JNK 和p38 通路被认为起诱导细胞死亡作用，而ERK1/2通路则被认为促进细胞生长繁殖。JNK、p38 和ERK 的动态平衡决定了细胞的存活或凋亡。

采用Western blot 法检测不同浓度NP42对细胞内p38-MAPK 信号通路的影响。结果如图7所示，与对照组相比，在NP42浓度为0.1 μmol/L 时，p38 蛋白的磷酸化水平无显著变化，当NP42浓度增加至1.0 μmol/L 和10 μmol/L 时，p38 蛋白的磷酸化水平显著降低，此结果说明NP42抑制RAW264.7 巨噬细胞的p38 蛋白磷酸化且表现出剂量依赖性。MAPKs 主要由PKC 和PKA 等激酶刺激活化，本研究结果说明NP42可能通过抑制PKC 的表达，进而抑制p38-MAPK 信号的表达，从而诱导细胞损伤。本课题组之前的研究发现，正壬基酚可通过激活p38、ERK1/2、JNK 信号通路对Sertoli TM4 细胞诱导损伤[28]。Han 等[29]研究发现NP 可能通过激活PI3-Akt/MAPK/CRE 信号通路诱导COX-2 表达参与对RAW264.7 巨噬细胞的免疫炎症反应调节。壬基酚异构体的生物效应高度依赖于其侧链结构，这可能是导致不同的壬基酚异构体，在不同甚至相同的细胞中，表现出对MAPK 信号通路不一致的结果，在未来的研究中将进一步探讨壬基酚异构体的构效关系。

图7 NP42 对p38-MAPK 信号通路的影响Fig.7 NP42 inhibited p38-MAPK signaling pathway in RAW264.7 cells

3 结论

利用不同浓度的壬基酚单体NP42处理小鼠RAW264.7 巨噬细胞，探究NP42对RAW264.7 巨噬细胞的损伤作用和对细胞免疫功能的影响。结果发现NP42能够抑制cAMP 的活性，下调TNF-α mRNA 和iNOS mRNA 的表达，同时抑制PKC 蛋白的表达和p38-MAPK 蛋白的磷酸化。这表明NP42可能通过PKC-cAMP 信号通路和p38-MAPK 信号通路对小鼠RAW264.7 巨噬细胞产生损伤效应，从而影响RAW264.7 巨噬细胞的功能，这可能是壬基酚异构体NP42诱导生物体免疫损伤的一个重要分子机制。