益气温阳汤治疗慢性免疫性血小板减少症免疫细胞调控机制及GATA-3通路对血小板计数预测价值研究❋

全日城，王子卿，许勇钢，杨晓红，胡晓梅，麻 柔，张姗姗

(中国中医科学院西苑医院，北京 100091)

转录因子GATA结合蛋白3(GATA binding protein 3，GATA-3)发现于1993年，被认为是辅助性T细胞(helper T cell, Th)2特异性的转录因子，在Th2淋巴细胞的分化以及Th2类细胞因子的基因转录中发挥着十分重要的作用。有研究表明，通过降低GATA-3的表达，可以抑制Th2细胞因子生成[1]。T细胞特异性转录因子(transcription factor T-bet, T-bet)作为T-box家族的一员，可以在一定程度上提高γ干扰素的分泌，作用于CD4+T细胞向Th1型细胞分化的过程[2]。Th2型细胞的分化也可以被T-bet所抑制，有研究将Th2型细胞中导入T-bet基因，发现即使是Th2型的培养环境中，其仍可逆转为Th1型细胞[3]。Olsson B等[4]在活动期免疫性血小板减少症(immune thrombocytopenia，ITP)患者中发现，某些T细胞表达水平上调，其中与Th1优势有关的细胞因子表达显著升高，提示活动期ITP可存在Th1细胞因子活化，在疾病缓解时，细胞因子更倾向于Th2优势模式。

叉头/翼状螺旋转录因子Foxp3(forkhead/winged helix transcription factor Foxp3)可调控CD4+CD25+调节性T细胞(regulatory T cell, Treg)的分化发育[5]。自身反应性T细胞、B细胞的活化与增殖以及免疫球蛋白的生成均可被该类细胞所抑制[6，7]。因此Foxp3在自身免疫性疾病的调控方面有重要作用。Foxp3基因可以提高慢性免疫性血小板减少症(chronic ITP, CITP)患者外周血中CD4+CD25+Treg细胞的数量，维持患者机体平衡的免疫状态。前期研究证实，益气温阳法可降低总T细胞、CD3DR+活化T细胞、自然杀伤T细胞(natural killer T cell, NKT)比值，升高CD19+CD5+/CD19+比值、CD4+CD25+Treg细胞和Th2细胞，参与机体免疫调节和免疫耐受，在改善外周血小板水平方面起到一定的作用[8]。本研究以此为基础，利用实时荧光定量PCR技术检测GATA-3、Foxp3、T-bet表达水平，进一步探讨益气温阳汤基于转录因子通路的效应机制及CITP可能的治疗靶点。本研究通过中国中医科学院西苑医院伦理委员会批准(批号2015XLA108-2)。

1 资料

1.1 一般资料

选择2014年6月至2017年10月间中国中医科学院西苑医院门诊符合入组条件的28例病例作为治疗组，其中男性12例，女性16例，平均年龄(35.82±17.70)岁，年龄区间15～75岁。另选择20名健康医务工作者作为健康对照组，其中男：女=1∶1，年龄分布25～70岁，平均年龄(34.45±15.42)岁。

1.2 诊断标准

参照《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[9]。

1.3 纳入标准

符合CITP的诊断标准且病程>12个月；间隔1周左右连续2次平均血小板计数<50×109/L，且泼尼松服用量≤10 mg；符合中医脾肾两虚证辨证分型；年龄在10～75岁之间；未参加其他临床研究，患者知情同意。

1.4 排除标准

继发性血小板减少性紫癜，如骨髓增生异常综合征，药物性、各种自身免疫性疾病及脾亢等所致血小板减少；合并心、脑、肝、肾严重性疾病或精神病患者；妊娠及哺乳期妇女。

2 方法

2.1 治疗方法

治疗组给予益气温阳汤。益气温阳汤组成：太子参30 g，炒白术10 g，茯苓20 g，炙甘草10 g，白芍10 g，桂枝10 g，淫羊藿15 g，锁阳20 g，川萆薢20 g，补骨脂15 g，巴戟天15 g，生姜10 g，大枣30 g，具有健脾益气、温肾助阳功效。治疗组每日1剂，早晚2次分服，连续服用4个月。健康对照组不给予药物治疗。

2.2 观察项目及方法

2.2.1 临床疗效观察 治疗组第1、2、4个月分别记录血小板计数。后期跟踪观察6个月监测病情，评价药物长期效果疗效。依据《成人原发免疫性血小板减少症诊断与治疗中国专家共识(2016年版)》[9]制定ITP的疗效标准。完全反应：治疗后血小板≥100×109/L且未出血；有效：治疗后血小板≥30×109/L并且至少比基础血小板计数增加2倍且未出血；无效：治疗后血小板<30×109/L或者血小板计数增加不到基础值的2倍或者有出血；复发：治疗有效后血小板计数降至30×109/L以下或者不到基础值的2倍或者出现出血症状[7]。

2.2.2 外周血T、B淋巴细胞亚群及Th1、Th2检测 清晨空腹状态下，用EDTA-K2/K3真空采血管采集静脉血2 mL，新鲜样本6 h内进行处理，分别加入相应的单克隆抗体10 μL和抗凝血100 μL，加入Optilyse溶血素，低速涡流混匀，离心弃上清，残留在管底的液体约50 μL；取200 μl样本，加入CD4+单抗3uL，离心、固定、透膜，加入10 μl Anti-Hu-IFN-γ-FITC/Anti-Hu-IL-4-PE/CD4-PC5，室温暗处孵育30 min，采用美国BECKMAN COULTER公司EPICS ELITE型流式细胞仪上机检测。检测指标为CD3+总T细胞、细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)、自然杀伤T细胞(natural killer T cell, NKT)、CD3+DR+活化T细胞、CD5+B淋巴细胞比值、Treg细胞、Th1细胞、Th2细胞。

2.2.3 外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表达 使用Rotor-Gene3000荧光定量PCR系统检测治疗组及对照组治疗前后GATA-3、T-bet和Foxp3 mRNA的表达水平，评价3个转录因子间相关性及与外周血PLT之间的关系。引物及探针设计：所检测基因的序列均获取于美国生物技术信息中心(网址：http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Genbank数据库，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。GATA-3上游引物：5′-AGGGAGTGTGTG-AACTGTGGG-3′，下游引物：5′-CTTCGCTTGGG-CTTAATGAGG-3′，137 bp；T-bet上游引物：5′-GCTGGAGAAAAGAAGACAAGAAAG-3′，下游引物：5′-AAGAAAAAACACACACCCACACAC-3′，249 bp；Foxp3 上游引物：5′-TCCCAGAGTTCCTCCACAAC-3′，下游引物：5′-ATTGACTGTCCGCTGCTTCT-3′；β-actin上游引物：5′-GAACGGTGAAGGTGACAGCAGT-3′，下游引物: 5′-TCTCAAGTTGGGGGACAAAAAG-3′，262 bp。扩增后得到的产物采用溶解曲线和Relative Quantification Software 1.0软件进行分析，相对表达量由转录因子和β-actin的基因拷贝数比值来表示。

2.3 统计学方法

采用SPSS 21.0软件进行统计分析，计量资料采用t检验，组间差异先用Levene’s test行方差齐性检验，再行独立样本或配对样本t检验；双变量相关分析对转录因子间相关性进行分析，Logistic多元逐步回归分析法对血小板相关预测因素进行分析。脱落病例不计入统计数据中，P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 临床疗效

临床疗效的观察共纳入32例患者，其中3例中途停用中药，1例因妊娠停用中药，脱落病例共4例，实际完成28例。脱落患者因资料不全未计入统计分析。治疗组患者服用益气温阳方，疗程为4个月，后期跟踪随访6个月。治疗组总28例中，完全反应者有4例(14.29%)，有效8例(28.57%)，无效16例(57.14%)，总有效率42.86%。与治疗前平均血小板计数(23.02±13.69)比较，治疗组治疗后平均血小板计数(46.18±50.47)明显升高(t=-2.585，P=0.015)。后期观察6个月，完全反应病例中有1例在4个月后血小板降至80×109/L，余病例病情稳定。全部病例在观察期间未出现明显不适及不良反应。

3.2 2组外周血T、B淋巴细胞亚群表达水平

对28例入组患者进行T、B细胞亚群检测，其中3例治疗后数据脱落，数据完整可供分析病例25例。与健康对照组比较，治疗组治疗前CD3+总T细胞、CTL细胞、NKT细胞、CD3+DR+活化T细胞显著增高，但CD5+B淋巴细胞比值、Treg细胞显著降低(P<0.05，P<0.01)。治疗组与治疗前比较，治疗后CD3+总T细胞、CTL细胞、NKT细胞显著性下降(P<0.05)，CD5+淋巴细胞比值、Treg、Th2细胞水平升高(P<0.05，P<0.01)，CD3+DR+活化T细胞、Th1细胞水平差异无统计学意义(P>0.05)(见表1图1、2)。

注：A.治疗前，CD5+B淋巴细胞：E2+E4；B.治疗后，CD5+B淋巴细胞：B2+B4

注：A.治疗前，Treg细胞：E4；B.治疗后，Treg细胞：D4

3.3 2组外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表达水平比较

与健康对照组比较，治疗组治疗前GATA-3 mRNA表达水平显著升高(P<0.01)，T-bet及Foxp3mRNA表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。治疗组与治疗前比较，治疗后GATA-3 mRNA表达水平显著降低(P<0.01)。治疗组治疗后Foxp3 mRNA表达水平显著低于健康对照组(P<0.05)(见表2)。

表2 2组外周血T-bet、GATA-3、Foxp3 mRNA表达水平比较

3.4 CITP患者T-bet、GATA-3、Foxp3水平相关性分析

治疗组治疗前T-bet与GATA-3呈负相关(P<0.05)，但相关性不甚密切(相关系数<0.5)，与Foxp3呈明显负相关(P<0.01，相关系数>0.5)，治疗后Foxp3与GATA-3之间呈现正相关关系(P<0.05)，相关系数为0.427(见表3)。

表3 慢性免疫性血小板减少症患者T-bet、GATA-3、Foxp3水平相关性比较

3.5 血小板计数预测因素的Logistic分析

将CITP患者治疗前后各项T、B淋巴细胞亚群数值与T-bet、GATA-3、Foxp3表达水平纳入血小板计数的Logistic回归模型，结果显示仅治疗后GATA-3的表达量与血小板水平呈负相关(P=0.032)，得出方程式：血小板=90.299-64.086×(GATA-3)(见表4图3)。

表4 血小板计数预测因素的Logistic回归模型

图3 治疗后GATA-3与血小板水平方程式图

4 讨论

多种免疫分子参与Th0向Th1/Th2分化以及白细胞介素(interleukin,IL)-4/γ-干扰素(interferon γ, IFN-γ)的分泌，其中，GATA-3和T-bet可以促进Th2和Th1型细胞因子的分泌，分别诱导Th0细胞向Th2和Th1细胞分化，是这一过程的关键分子。GATA-3能够诱导不成熟的CD4+T细胞向Th2类分化，其机制主要为IL-5启动子对GATA-3较敏感，可以被GATA-3强烈刺激而激活，但GATA-3对IL-4启动子的刺激较弱，将这一启动子的结构转染Th1类细胞和非淋巴细胞后，能够直接上调Th2类细胞因子的表达；Th2型基因位点的染色质结构可以被GATA-3更改，异位表达GATA-3可以诱导IL-4及IL-5的表达，并能以信号传导及转录激活蛋白(signal transducer and activator of transcription, STAT)6、IL-4非依赖性的形式诱导内源性GATA-3的生成，以此成为Th2定向分化的正反馈途径；GATA-3可以激活IL-4周围几个区域的增强子[10]。

前期研究证明，益气温阳方治疗CITP临床疗效确切，显著提升患者外周血小板计数，远期疗效稳定可靠，明显提高患者生活质量[11]。笔者认为，ITP急性期以“火盛”为特点，慢性期以“气伤”为特点[12]。慢性期所谓气伤即气虚之意，气虚则气血生化不足、统摄无权，致使血溢脉外。脾、肾分别为先后天之本，后天气血、元阴、元阳均由此化生。麻柔[8]认为，CITP“气伤”具体表现为脾肾两虚和肺脾气虚。益气温阳汤方中有太子参、茯苓、炒白术、炙甘草、白芍、桂枝、淫羊藿、锁阳、川萆薢、生姜、大枣，具有健脾益气、益火补土功效。方中太子参、茯苓、炒白术、炙甘草取自四君子汤，意在健脾益气、固气虚之本；锁阳、淫羊藿益火补土，益肾助阳；桂枝汤既调和营卫又顾护肺卫，有助于抵御外感邪热。

此次淋巴细胞亚群研究提示，CITP患者机体中存在免疫紊乱，表现为Treg细胞和CD19+CD5+B淋巴细胞比例下调及功能缺陷，以及总T细胞、CTL细胞、NKT细胞、CD3+DR+活化T细胞功能亢进是其致病机制中的重要环节。研究提示，益气温阳汤通过显著降低总T细胞、CTL细胞、NKT细胞水平，升高CD5+淋巴细胞比值、Treg细胞和Th2细胞水平，起到免疫调节和免疫耐受作用，有助于改善外周血小板水平。

治疗前T-bet与Foxp3呈明显负相关，相关系数为0.577；治疗后Foxp3与GATA-3之间呈正相关关系，相关系数为0.427，提示在CITP慢性期，Foxp3的高水平转录抑制T-bet的表达，GATA-3反馈性高表达也会使T-bet转录受抑，这一结果符合CITP中各转录因子的功能。经过益气温阳汤治疗后有效的患者，缓解期Foxp3和GATA-3表达均降低，表明Treg细胞功能得到恢复和增强，可以通过负反馈机制降低Foxp3和GATA-3表达水平。

本研究治疗前GATA-3 mRNA表达水平显著高于健康对照组，说明GATA-3高表达是ITP致病机制中的重要一环。经过益气温阳汤治疗后的GATA-3 mRNA显著下降也证明这一点。其理论依据笔者假设，随着PLT上升及Treg调节细胞功能增强，机体通过Th2优势来调整免疫耐受的需求下降，GATA-3 mRNA表达量也随之下降。此次通过益气温阳汤治疗CITP研究，证明益气温阳汤通过GATA-3和Foxp3通路的调控发挥了提升血小板的作用。

综上所述，复杂的ITP免疫调控网络中GATA-3通路具有重要作用。以往研究表明，活化的Treg调节细胞可以抑制Th1和Th2细胞的活化与增殖，提示Treg处于Th1/Th2网络调控的上游[13]。本研究提出假说，ITP疾病进展期机体处于免疫过激状态，此时Foxp3转录未能有效启动或未能及时上调是ITP发病机制的关键环节。随着血小板数量持续低水平，机体设法通过另外的免疫耐受通路，即通过高表达GATA-3表达水平，能够使Th平衡向Th2优势漂移，从而实现免疫耐受，促进病情缓解。