性别控制技术在家畜生产中的应用研究进展

谢晓刚，李 丹，薛增迪，张芮琪，史宏昭，薛 嘉，马乃祥，权富生

（1.杨凌职业技术学院 动物工程分院，陕西杨凌 712100；2.西北农林科技大学 动物医学院/农业部动物生物技术重点实验室，陕西杨凌 712100；3.陕西省动物疫病预防控制中心，陕西 西安 710000）

预计到21世纪中叶，世界总人口将达到96亿，人类对畜产品的需求将增加70%以上[1]。为了解决全球畜产品需求量增加的问题，利用现代生物技术促进畜牧业的可持续发展显得至关重要。哺乳动物性别控制（Sex control）技术是通过对动物正常生殖过程的人为干预，使雌性动物生产出符合人们期望性别后代的技术手段[2-6]。性别控制技术在畜牧生产中有着重要的意义。首先，通过控制后代的性别比例，可以充分发挥受性别限制的生产性状（如泌乳、产麝性能等）和受性别影响的生产性状（如生长速度、肉质等）的最大经济效益；其次，控制后代的性别比例可增加家畜选种强度，有效加快育种进程；此外，通过控制后代的性别还可克服某些家畜中出现的异性孪生不育现象，排除伴性有害基因的危害，以及解决阉割等动物福利等问题。自古以来，为了提高家畜的养殖效益，人们一直在试图对其后代性别进行控制。随着畜牧业智能化的快速发展，人类对特定性别的家畜需求量显著增加，因此，家畜性别控制技术具有重要的研究和应用价值。

1 性别控制理论研究

1923年，PAINTER等[7]研究发现，人类的X染色体和Y染色体，并且指出卵子与X精子结合时最终发育为雌性胎儿，与Y精子结合时最终发育为雄性胎儿。在发现X、Y精子可以决定动物性别之后，1925年，LUSH等[8]根据X精子和Y精子的密度差异，通过离心的方法将兔子的X精子和Y精子分离，但是并未生产出预想的后代性别比例，虽然实验并不成功，但是此研究方法对现代家畜性别控制带来了很大的影响，LUSH是通过X精子和Y精子分离进行动物性别控制的奠基者。目前，在动物生产中，通过X、Y精子分离进行后代性别控制仍然是主流方法。

1959年，WELSHONS等[9]提出了Y染色体决定雄性的理论。1989年，JOHNSON等[10]建立了早期的用于性别控制的流式细胞仪模型，并通过这种方法成功分离了兔子的X精子和Y精子，并采用分离后的精子进行人工授精产下了预期性别比例的后代，这标志着以分离X精子和Y精子为原理的性别控制技术取得了重大进展。

随后几年，哺乳动物的性别决定机制研究取得了很大的进展，科学工作者将性别决定基因定位在Y染色体上一个特定区域内，为家畜动物的性别控制开辟了新的研究思路，即通过对胚胎早期的性别鉴定来控制后代的性别。1990年，SINCLAIR等[11]首次在人体Y染色体上克隆到一个特异的性别决定基因，SRY基因。此后，SRY基因在很多动物中相继被克隆出来。SRY基因的发现是哺乳动物性别决定理论的重大突破，为性别控制技术奠定了理论基础。1991年，KOOPMAN等[12]将一段含有SRY基因的序列导入小鼠胚胎，发现在出生的小鼠中，部分染色体为XX型的雌性小鼠会出现性别反转，证明SRY基因是哺乳动物性别决定的主效基因。SRY基因又称为睾丸决定因子（Testis Determining Factor，TDF），是哺乳动物性别决定的总开关[13-14]。20世纪90年代，HERR等[15]利用SRY基因序列设计引物，通过PCR技术首次成功鉴定了牛、羊胚胎的性别，并从此开启了利用SRY基因进行胚胎性别鉴定的技术先河。目前，将性别控制技术与人工授精和胚胎移植技术相结合，达到人为控制性别的目的，在科学研究和动物生产中已经非常普及。

2 家畜性别控制技术

随着社会经济的快速发展，消费者对肉、蛋、奶的需求量与日俱增，采用性别控制技术快速生产特定性别的后代可以更好地满足社会对畜产品的需求。因此，性别控制在畜牧生产中的应用更加广泛，出现了很多不同的性别控制方法，如X、Y精子分离、胚胎性别鉴定、调节母畜生殖道环境、特定温度解冻冻精、分子生物学技术等。

2.1 X、Y精子分离技术

根据X精子和Y精子性别决定的基本理论，可以将精子分离为X精子和Y精子，根据对后代的性别需求，分别用X精子或Y精子进行人工授精，进行性别控制。由于X精子携带X染色体，Y精子携带Y染色体，而Y染色体要比X染色体小很多，根据2种精子的性状差异，可以使用一些特殊的方法将它们分离开[16-19]。目前，哺乳动物X、Y精子的分离方法主要有流式细胞仪分离法和免疫学分离法。

2.1.1 流式细胞仪分离法 流式细胞仪分离法是目前最常用也是最成熟的XY精子分离方法。该方法的主要理论依据是X精子和Y精子头部DNA含量存在差异。在家畜中，X精子的DNA含量要比Y精子高出3%~4%[20]，根据这一差异，采用DNA特异性染料对精子进行染色，染料的着色量与DNA的含量成正比[21]，当X精子通过流式细胞仪时会放射出更强的荧光信号，从而得以分离。目前，通过流式细胞仪分离动物精子的准确率已达95%以上，生产的商业化性控精子已广泛应用于畜牧业中，尤其是在奶牛、奶山羊的生产中应用较多。

2006年，覃能斌等[22]分别使用经过流式细胞仪分选的鲜精与冻精对荷斯坦青年母牛（14~17月龄，体质量为350~450 kg）和成年母牛（3～5周岁，头胎或经产）进行人工输精，发现后代雌性犊牛所占比例均达到90%以上。2009年，高庆华等[23]使用经流式细胞仪分选的西农萨能奶山羊Y精子进行人工授精结果发现，出生的羔羊均为雄性。2012年，曾有权等[24]通过流式细胞仪分离猪精子，并进行人工授精，发现母猪妊娠率和产仔率不受影响，输X精子母猪产生后代为雌性的比例可达91.67%，输Y精子母猪产生后代为雄性的比例可达100%。2021年，何琪富等[25]建立了一种可以定量计算奶山羊精液中X、Y精子数量的双重TaqMan荧光定量PCR方法，可检测经过分离的奶山羊精液X和Y精子的数量和比例。

目前，存在的问题是使用性控精子的受孕率仍然普遍低于鲜精。此外，流式细胞仪运行成本高，使得该技术在生产中的应用受到了一定的限制[26-27]。

2.1.2 免疫学分离法 免疫学分离法是利用HY抗体检测Y精子质膜上存在的H－Y型抗原，根据抗原抗体反应来分离家畜的X精子和Y精子[28]。20世纪八九十年代，ZAVOS[29]和JONES等[30]使用该方法分别分离出较高纯度的Y精子。然而，HENDRIKSEN[31]研究表明，X和Y精子会共享抗原，它们都能够结合抗H－Y的抗体。此外，此种方法虽然可以获得纯度较高的X精子和Y精子，但是处理时间较长，会显著降低精子活力，导致受胎率降低，使得该方法在生产中很难推广应用[32]。

2.2 胚胎性别鉴定技术

在胚胎移植前，通过对胚胎进行性别鉴定，可以人为选择所需性别的胚胎进行移植。对胚胎的性别进行鉴定有多种方法，如SRY-PCR法、免疫学法、核型分析法等。目前，最常用的是SRYPCR法，近年来，随着PCR技术的快速发展和普及，使得快速、准确地对早期胚胎性别进行鉴定成为可能[33]。2004年，MARA等[34]通过双重PCR技术扩增SRY基因，对绵羊的早期胚胎进行性别鉴定，准确率高达87.5%。2007年，刘俊平等[35]采用PCR技术对牛体内胚胎（分别采用普通精液和性控精液超数排卵后人工授精处理发情的奶牛）和体外胚胎（分别采用普通精液和性控精液对成熟的卵丘卵母细胞复合体进行体外受精）的性别进行鉴定，结果显示，2种胚胎移植受体母牛后妊娠率无显著影响，后代犊牛性别与鉴定结果符合率达100%。PCR鉴定胚胎性别的方法虽然操作简便，但仍需从胚胎中分离部分细胞，可能会对胚胎后期发育造成损伤。此外，由于该方法主要是用胚胎作为样品，导致起始样品量少，扩增量较大，容易污染造成假阳性的结果，影响试验结果的准确性[36]。

2.3 调节母畜生殖道环境技术

1984年，李方来等[37]研究发现，牛阴道的酸碱环境可能与后代性别比例有关，碱性环境有助于Y精子的受精，而酸性环境有助于X精子的受精。当阴道液的pH值大于7.6时，后代中公犊占比为66.7%；当阴道液的p H值小于6.8时，后代中公犊占比仅为37.5%。1985年，乌兰少布[38]报道了用20%的食醋冲洗母牛阴道，可以改变阴道的酸碱环境，当pH值降到6.7以下时，后代中母犊可达63.5%。2015年，于涛等[39]检测了奶牛宫颈分泌物的pH值，结果发现，pH值越高，后代中雄性占比越高，反之，雄性占比越低；在p H值小于6.7的母牛中，后代多为雌性，而当p H值大于7.6时，后代多为雄性；pH值在6.8~7.5时，雌雄后代数目较为平均。2017年，熊前等[40]以罗威纳发情母犬为试验对象，使用自配的碱性冲洗液对母犬阴道进行冲洗，结果显示，试验组比对照组公犬比例提高了4.8%，但差异不显著。这种方法虽在家畜性别控制上具有一定的效果，但是目前用于改变母畜生殖环境的液体并没有一个统一标准，也无商品化的试剂用于调节母畜生殖道环境，所以很难大范围推广应用。

2.4 不同温度解冻冻精技术

2015年，李来平等[41]将冻精在3种不同温度区间内解冻，分别为40~45、45~55、55~60℃。前2个温度区间对后代的性别比例无明显影响，而55~60℃对后代性别有很大影响，后代中雌性比例为59%。2004年，姜忠玲等[42]研究也发现，在适当提高解冻温度可提高后代的雌性比例。2016年，马正文[43]发现，在41℃下解冻冻精，同时采用食醋冲洗母牛阴道，出生后代中雌性比例可达67.9%。这种方法简单实用，但冻精解冻所需时间及温度的控制对一线操作人员要求较高，使得该技术的推广受到了一定的限制。

2.5 分子生物学技术

近些年来，随着分子生物学技术的快速发展，科学工作者对基因功能的研究取得了很大的突破。RNA干扰（RNA interference，RNAi）技术和基因编辑技术作为非常重要的靶向基因沉默工具，被广泛应用于哺乳动物基因改造[44-48]。这2种技术可以使动物体内某些特定基因快速失去功能，目前，有些研究团队就已经将其应用于动物的性别控制上。

石河子大学研究表明，通过RNAi降低动物体内Zfy（Y chromosome linked zinc-finger protein transcriptional factor，Y染色体相关锌指蛋白转录因子）基因或者Zfx（X chromosome linked zincfinger protein transcriptional factor，X染色体相关锌指蛋白转录因子）基因mRNA的表达量，可导致动物体内X精子或Y精子的发育受到破坏，引起后代性别比例的改变。2019年，该研究团队将针对奶牛Zfy基因的干扰载体注射到成年公牛睾丸中，采集精液进行人工授精，后代犊牛中雌性占比达到72.0%[49]。此外，该研究团队还利用同样的方法在绵羊[50-51]、马鹿[52]、猪[53-54]、小鼠[55-56]等动物上取得了一定的性别控制效果。

在模式动物中，2012年，WU等[57]设计了针对小鼠性别决定基因——SRY基因的干扰载体，对怀孕母鼠的受精卵进行注射后发现，SRY基因的沉默使得其下游的在两性性腺分化过程中起重要作用的WT 1基因表达量显著升高，最终影响了后代小鼠性腺和睾丸发育。2013年，KATO等[58]利用TALEN技术结合原核注射技术生产出敲除SRY基因的小鼠，发现SRY基因敲除影响了小鼠性腺的发育，雄性小鼠出现了像雌鼠一样的内生殖器，但这些小鼠不育，与正常小鼠交配不能产生后代。2017年，SONG等[59]研究发现，Sp1基因可以作为SRY转录的主要调控因子，Sp1基因突变会导兔性别发生反转。2021年，DOUGLAS等[60]在以小鼠为模型，开发了一种合成的致死性双组分CRISPR-Cas9策略，以100%的效率生产出均是雄性或雌性的小鼠后代，该研究为之后CRISPRCas9技术应用于其他哺乳动物进行性别控制奠定了基础。

3 小结与展望

家畜性别控制在畜牧业中意义重大，随着现代分子生物学和细胞生物学技术的快速发展，将彻底改变动物的生产方式。然而，无论是对哺乳动物的性别决定基因还是性别决定机制，人类的认识仍然非常有限。由于不同的性别控制技术有着各自的优点和缺点，具体选择哪一种技术取决于临床中的应用环境，而不是单一地选择某一种方法。总的来说，性别决定是一个复杂的生物学过程，受到各种内部和外部因素的影响。随着生命科学的快速发展，在不久的将来人们一定能够进一步阐明哺乳动物性别决定机制，研制出更加高效、快速、准确、经济的性别控制方法，并将它们应用于生产实践，结合体外受精、胚胎分割、胚胎移植、体细胞核移植等生物学技术，促进现代畜牧产业快速高质量发展。