非洲猪瘟检测方法的研究进展

方 勤，丛 彬，唐 伟

（永州职业技术学院，湖南 永州 425000）

非洲猪瘟（ASF）1914年起源于坦桑尼亚，1921年在肯尼亚首次报道，1957年首次传出非洲大陆进入欧洲西部，2007年传入东欧和俄罗斯西部，2017年传入俄罗斯东部，2018年传入我国。非洲猪瘟病毒（ASFV）可在钝缘软蜱中长期存在，使得其很难被净化，主要是由于其容易形成“家猪—钝缘软蜱—家猪和家猪—钝缘软蜱—野猪”循环传播，目前已知的能传播ASFV的钝缘软蜱有7大类，分别是欧洲的游走钝缘软蜱、非洲的非洲钝缘软蜱复合种、糙皮钝缘软蜱、帕氏钝缘软蜱、圆卡钝缘软蜱、波多钝缘软蜱和摩洛钝缘软蜱[1]。

ASFV是一种结构对称的二十面体双链DNA病毒，直径在175～215nm，拥有24个基因型，基因组长度为170～194kb，含有150～167个开放阅读框，能编码150～200种的蛋白质[2]。病毒粒子包含5层结构，由内到外依次是拟核、内核衣壳、内膜、衣壳、外膜。拟核的主要结合蛋白包括p10（pK78R）和p14.5（pE120R），内核衣壳蛋白主要包括pp220（pC475L）和pp62（pCP530R），pp220可裂解为p150、p37、p14和p34四种蛋白，pp62可裂解为p35和p15两种蛋白，内膜蛋白主要包括p17（pD117L）、p54（pE183L）、p12（pO61R）、p30（pCP204L）、p22（pKP177R）、pE248R、j5R（pH108R）、j13L（pE183L）和j18L（pE199L），衣壳蛋白主要包括p72（pB646L）、p49（pB438L）、p14.5（pE120R）、pH240R和pM1249L，外膜蛋白主要包括CD2v（Ep402R）和p12（pO61R）。其中p72、p30、p54和CD2v是ASFV重要的毒力蛋白[3]。

1 病原学检测

1.1 红细胞吸附试验（HAD）

HAD依赖于体外培养的感染ASFV的巨噬细胞能够使红细胞吸附在其细胞膜上，形成红细胞玫瑰花环，但是有的ASFV能诱导巨噬细胞产生病变使其不能形成红细胞吸附现象。如果出现不吸附现象，可利用免疫荧光检测方法将特异性荧光抗体与ASFV结合，通过显微镜观察显色结果可检出ASFV，能够提高检出率。但是巨噬细胞的培养费时费力，HAD的反应时间长达3d～10d且与病毒含量有关，所以这种方法除了不能100%检出ASFV，而且对慢性病例检出率会降低，因而通常作为一种补充检测方法[4]。

1.2 聚合酶链式反应（PCR）

PCR是利用ASFV结构蛋白设计特异性的引物，然后加入酶和四种脱氧核糖核苷酸，经过变性、退火和延伸3个基本反应步骤进行扩增。基于不同的基因设计不同的引物，如吴忆春等[5]根据ASFV的vp73基因序列设计引物，检测灵敏度为10-7ng/μg，李云灿等[6]根据ASFV的vp72基因序列设计引物，检测灵敏度为10-8ng/μg，两种引物的设计检测灵敏度均达到和优于世界动物卫生组织（OIE）的推荐方法。

1.3 荧光定量PCR（qPCR）

qPCR可根据ASFV的基因vp72、vp73、P54、K205设计引物和探针，是一种将PCR与光谱结合的核酸定量检测技术。qPCR有荧光染料法和探针法，通过荧光染料或荧光标记的特异性探针跟踪PCR扩增产物，并将其产生的信号实时收集，最后用标准曲线进行定量的分析。荧光染料法以SYBR Green I为代表，主要由于其通用性好、成本低，SYBRGreen I发出的荧光较弱，但是结合到DNA的双螺旋小沟区域后荧光信号明显增强[7]。探针法主要是利用PCR反应中标记荧光染料的特异性寡核苷酸探针来检测产物，目前使用最多的是vp72的B646L作为靶点的TaqMan探针和9GL为靶点的MGB探针[8]。qPCR的检测灵敏度非常高，如曾少灵等[9]基于vp73建立的qPCR最低检测限可达10copies/μL，董志珍等[10]基于ASFV的P54建立的qPCR最低检测限可达15 copies/μL，黄萍等[11]基于ASFV的vp72建立的qPCR最低检测限可达100copies/μL。

1.4 微滴数字PCR（ddPCR）

ddPCR是在数字PCR（dPCR）的基础上将液滴微流控芯片与dPCR技术相结合，具有dPCR高灵敏度、高通量和低消耗的优点，同时克服了dPCR芯片结构复杂、成本高和加工困难的缺点。ddPCR不需要使用标准样品，相较qPCR不依赖标准曲线，能直接读出DNA分子的个数做到绝对定量。ddPCR通过反应体系配制、样品微滴化处理、PCR扩增和微滴检测读取四个步骤后，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数和比例得出靶分子的拷贝数或浓度。ddPCR的检测灵敏度比qPCR更为灵敏，如邬旭龙等[12]基于ASFV的K205R基因设计的特异性引物建立的ddPCR的最低检测限为10copies/μL，原霖等[13]基于ASFV的vp72基因设计的特异性引物建立的ddPCR的最低检测限为0.8copies/μL。由于ddPCR检测灵敏且不依赖标准样品，可用于饲料、饮水和猪肉产品中微量核酸的检测，对早期检测意义重大，但是其检测所需要的仪器价格昂贵，普及还需要一定时间。

1.5 等温核酸扩增技术

等温核酸扩增技术是一种在恒温条件下的DNA扩增技术，用于检测ASFV主要包括环介导等温扩增技术（LAMP）、重组聚合酶扩增技术（RPA）、重组聚合酶辅助扩增技术（RAA）、交叉引物扩增技术（CPA）等多种等温扩增技术[14]。

LAMP是一种DNA扩增的单管技术，对目标DNA链上的不同区段设计不同的引物和具有复制活性、高链置换活性的聚合酶，在60℃～65℃的恒温环境下进行核酸扩增的方法[15]。LAMP相较PCR而言，不需要专业的热循环仪，只要恒温设备即可扩增，更适宜在现场和非实验的条件下进行检测，并且已有检测试剂盒，如北京森康生物技术开发有限公司开发的非洲猪瘟病毒LAMP检测试剂盒，所以LAMP具有使用简单、检测方便等特点[16]。它的灵敏度也非常高，Wu等基于ASFV的K205R基因序列设计的LAMP引物的最低检测限为6copies/μL。

RPA是一种由DNA重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换聚合酶参与的恒温扩增技术，DNA在体外扩增温度为25℃～45℃，基本不需要加热即可完成双链DNA的解链处理并进行循环扩增，而且扩增时间较短一般不超过20min，相较qPCR而言检测效率明显更高，而且检测限度也不弱于qPCR，如Zhai等[7]以ASFV的vp72基因与K205R基因为检测靶标的RPA-LFD法，最低检测限为100copies/μL。

RAA是具有我国专利的一种等温检测技术，是RPA技术的一种改良。RAA体系中的重组酶来源于细菌或真菌较来源于噬菌体的RPA更易得到，而且温度适应性更强。39℃在重组酶、单链结合蛋白和聚合酶的作用下10～20min就可完成核酸的扩增，且较RPA灵敏度更高，如Fan等[7]基于ASFV的B646L基因建立的RPA方法和RAA方法最低检测限为93.4copies/μL和53.6copies/μL，赵凯颖等[17]基于ASFV的B646L基因建立RAA方法最低检测限为10copies/μL。

CPA是我国首个具有自主知识产权的核酸扩增技术，是一类利用多个引物和探针的等温核酸扩增技术，它的引物有1个或多个是交叉引物，依赖DNA聚合酶的高活性链置换特性扩增DNA。CPA不需提取DNA，且无交叉反应，比LAMP灵敏度高但检出率不如LAMP，Wozniakowski等[7]对比了LAMP与CPA两种等温检测方法去检测ASFV，灵敏度方面LAMP的最低检测限为300copies/μL，CPA的最低检测限为7.2copies/μL，但LAMP的阳性检出率为90%，CPA只有70%。

2 血清学检测

2.1 酶联免疫吸附试验（ELISA）

ELISA是血清学检测最常用的方法，其基本原理是吸附在固相载体上抗原或抗体在酶标物的作用下发生特异性的反应，利用底物显色做一些定性或定量的分析。基于ELISA，发展出了阻断ELISA、间接ELISA和双夹心ELISA等方法[18]。阻断ELISA的原理是通过包被的ASFV蛋白与ASFV特异性抗体发生反应，再进行氧化物酶标记物竞争反应，通过底物显色深浅进行抗体的阳性检测。间接ELISA是通过包被蛋白与样品中抗体反应，再与酶标抗体结合，加入底物显色来确定其ASFV抗体是否为阳性。双抗夹心ELISA是特异性抗体与固相载体结合，加入待检测抗原后再加入酶标抗体，最后用底物进行显色，根据显色的深浅做一些定性或定量分析。ELISA检测灵敏度高，具有特异性，操作简单，能够用于大量样本的检测。目前，ASFV在ELISA的检测中使用最多的抗原蛋白有p30、p54、p72和p73等，如Cubillos等[7]利用ASFV的p30建立的ELISA，梁云浩等[19]利用ASFV的p54建立的间接ELISA，曹琛福等[20]利用ASFV的p54建立的阻断ELISA，Vidal MI等[21]利用ASFV的p72建立的双夹心ELISA。

2.2 胶体金免疫层析技术（GICA）

GICA是一种以胶体金作为显色媒介标记抗原或抗体作为示踪标记物，以纤维素膜作为载体在层析过程中完成反应从而达到检测目的的免疫标记技术。GICA适合现场检测ASFV，其检测简单快速且对设备要求不高。GICA的建立需要设计专门的检测线和质控线，检测线会根据靶目标的存在与否出现显色或不显色，质控线能够确认试纸的检测是否正常。GICA通常利用葡萄球菌A蛋白（SPA）作为检测线，纤维素膜包被的ASFV的p54或p72多克隆抗体作为质控线，如张鑫宇等[22]建立的p54抗体胶体金检测法，以SPA作为检测线，抗p54多克隆抗体作为质控线，戴建华等[23]根据胶体金免疫层析原理制作的胶体金免疫层析试纸，以ASFV的p54抗原作为金标垫，SPA为检测线，p54多克隆抗体为质控线，吴海涛等[24]制备的检测ASFV的p72胶体金免疫试纸条，以SPA作为检测线，抗p72多克隆抗体作为质控线。

2.3 免疫印迹法（IBT）

IBT是一种利用凝胶电泳分离不同组分的蛋白质固定于印迹纸上，以特异性抗体为探针，建立免疫印迹检测系统实现对靶抗原蛋白质的检测。AFSV的IBT通常以重组蛋白P30和p54等建立免疫印迹检测系统，如Barderas等[7]利用粉纹夜蛾幼虫制备的ASFV重组蛋白p30建立免疫印迹检测系统，Kazakova A S等[7]将ASFV的重组蛋白p30克隆成原核表达载体，经表达纯化后建立了高纯度重组蛋白p30的免疫印迹检测系统，Alcaraz等[25]在大肠杆菌中表达重组蛋白p54，建立了ASFV重组蛋白p54的免疫印迹检测系统。

3 小结

ASF检测方法的选择通常要根据具体情况而定，每种检测方法都有它的优缺点。如qPCR的优点是快速，灵敏度高，不容易交叉污染，缺点是成本高，需配套仪器，容易出现假阳性。RPA的优点是对仪器要求低，快速特异，操作简单，缺点是易出现假阳性。ELISA的优点是应用广泛，可用于大量样本检测，缺点是被检动物需要产生抗体。GICA的优点是检测快速，稳定性高，可用于现场检测，缺点是易出现假阳性，不能定量。IBT快速灵敏，可以避免在抗原生产中使用活毒，缺点是检测时可能会出现非特异性反应[26,27]。总之，检测方法的使用要相互辅助，同时大力加强对新方法的开发，使ASFV的无所遁形。 □