尿液肌氨酸在前列腺癌中的应用及检测

周斌 胡晞江

前列腺癌（prostate carcinoma，PCa）发病率在临床上位于男性恶性肿瘤的第二位，且在中国呈逐年上升趋势［1］，PCa 早诊断、早治疗尤为重要，目前PCa 早期筛查主要依靠直肠指检联合血液前列腺特异性抗原（prostate specific antigen，PSA）检测，但其存在一定程度的“灰区”和假阳性结果，造成过度治疗和漏诊（灵敏度为20.5%、特异性为51%～91%）［2⁃3］，因此在临床上迫切需要特异和敏感的生物标志物及其准确且灵敏的检测方法。

尿液前列腺癌抗原3（prostate cell antigen 3，PCA3）、早期前列腺抗原（early prostatecancer anti⁃gen，EPCA）、前列腺干细胞抗原（prostate stem cell antigen，PSCA）、α⁃甲酰辅酶A 消旋酶（alpha⁃meth⁃ylacyl⁃coa racemase，AMACR）等生物标志物逐步走进了大众的视野［4⁃5］，但是由于其检测手段有限，限制了在临床上的使用。近年来通过代谢组学逐渐发现包括肌氨酸、丙氨酸、精氨酸、尿嘧啶、谷氨酸、富马酸、柠檬酸和丝氨酸等多种代谢产物有望被用作PCa 患者生物标志物［6⁃7］，其中肌氨酸是最早被筛选和证实的［8］。对于这些新型生物标志物推广至临床应用还需进行严密评估及确证，使科研向临床转化。本文主要综述肌氨酸的临床应用价值和近十年来尿液中肌氨酸的检测方法，为医务工作者及科研工作者提供参考依据。

1 肌氨酸的临床应用价值

肌氨酸，即N⁃ 甲基甘氨酸，化学式为CH3NHCH2COOH，末端含羧基，溶于水，是胆碱代谢为甘氨酸过程的中间体。自2009年研究者首次揭示肌氨酸是PCa 发展时显著增高的代谢产物后［8］，又陆续开展了众多研究以期评估肌氨酸作为PCa 生物标志物的价值。少量研究显示，尿液中的肌氨酸不能用于鉴别前列腺相关疾病。Jentzmik发现直肠指诊与尿液中肌氨酸联合使用并不比PSA 更容易区分PCa 和非PCa，且肌氨酸浓度与评分无相关性［9］。大部分研究认为：尿肌氨酸不仅能作为前列腺疾病早期筛查、病理分级及预后判断的关键指标，还能有效反映PCa 的侵袭性，辨别癌细胞是缓慢生长还是高度侵袭生长，其检测诊断PCa 的准确性优于血PSA 检测［8，10］。Wang 等［11］也进一步证实了尿肌氨酸/肌酐比值不仅可区分良性前列腺增生性疾病和PCa，还可在PSA 灰色区（PSA<10 ng/mL）水平时作为PCa 生物标志物，而且还发现肌氨酸浓度水平与Gleason 评分密切相关。上述结果说明，肌氨酸在检出PCa 以及判断PCa 侵袭性方面至少与PSA 相当，甚至更优。也有研究者推测，将PSA 检测和一些新的生物标志物如肌氨酸等结合起来，可使PCa 的诊断、治疗和监测更个体化，最重要的是在活检之前就能预判前列腺病变的严重程度，减少不必要的穿刺活检。

综上所述，尿液肌氨酸检测在前列腺癌诊断中的应用价值目前存在争议，导致出现争议的原因可能与尿液肌氨酸检测方法、测定样本（尿沉渣或经尿液离心后的上清液）、受试人群等差异有关［12］。不同GNMT遗传背景可影响人群中肌氨酸水平［13］，而且样品预处理方法和检测方法都可能影响检测结果［12，14］。因此，样品前处理和检测对肌氨酸在临床上的应用非常重要。

2 肌氨酸检测方法

肌氨酸要达到临床应用必须依赖准确，且快速的检测方法，目前肌氨酸检测方法种类繁多，主要包括间接定量分析和直接检测两大类。间接定量分析是通过肌氨酸氧化酶或纳米酶氧化肌氨酸间接检测，主要包括比色法［15］，荧光法［16］和电化学方法［17］。2007年以来随着纳米酶催化体系的不断发展，肌氨酸比色法中基于纳米酶的生物传感器逐渐增多，大大优化了比色法的检测性能。直接检测方法通常包括色谱法、色谱与质谱联用法［18］以及电化学方法［17］。这类方法准确性和重复性都非常好，但暂未能实现标准化的快速批量检测，电化学方法灵敏度也有待提高。随着分子印迹技术在电化学传感器中的应用，其检测性能均达到了新的高度。

2.1 分光光度法

传统的分光光度法主要依赖的是肌氨酸氧化酶，这是最早开发和最经典的检测方法之一，目前已有成熟检测试剂盒和专利诞生，该方法操作简单，成本低，也不受丙氨酸干扰，但在低浓度尿液加标实验中回收率较低。随着材料科学的迅猛发展，越来越多的人工模拟酶如贵金属络合物和金/银纳米颗粒等有望替代传统酶用于分析检测中，纳米酶的应用也是肌氨酸比色检测未来发展方向。纳米酶既具有纳米材料优异的理化特性，良好的相容性，合成简单，易修饰和无毒，又兼具极佳的酶学催化功能，可避免酶修饰和分离步骤，也能减少蛋白酶的非特异性吸附。早期在Pd 纳米颗粒合成中引入碳纳米管，石墨烯等纳米颗粒增强模拟酶活性，改善生物亲和力，使方法的检出限降至5.0 nmol/L［19］。BawaMbage 等人以自制的叶酸官能团化的多金属氧酸盐化合物为模拟酶，实现肌氨酸和双氧水同时检测，但检出限较高（0.311 μmol/L）［20］。

2.2 电化学分析法

尿液中肌氨酸的含量极低（健康成人为1～1.5 μmol/L），常规的电化学生物传感器的灵敏度和选择性并不都能满足临床需求［17，21］。近年来，研究者们一方面致力于改善肌氨酸氧化酶活性，通过新型材料的合成或结构改善实现活性生物物质固定在基体电极表面保证接触面积最大化，达到酶催化活性增强目的。比如，Yang 等［22］合成铂负载介孔磷酸镍增加活性位点，对肌氨酸氧化酶产物具有良好的电化学性能，在定量分析肌氨酸时检出限为0.24 μmol/L。Yang 等以类沸石咪唑酯骨架材料（zeoliticimidazolate framework⁃8，ZIF⁃8）负载纳米铂（Pt@ZIF8），将其修饰在玻碳电极（glassy carbon electrode，GCE）上（Pt@ZIF8/GCE），ZIF⁃8独特的3D 网络结构提高了铂纳米颗粒对肌氨酸氧化酶的电催化活性，维持检出限在1.06 μmol/L水平，线性范围为5～30 μmol/L［23］。另一方面研究者们利用分子印迹聚合物对模板分子的良好识别机制，实现肌氨酸检测中出色的选择性和稳定性［24］，比如，Sheydaei Omid 等［25］利用新型纳米分子印迹聚合物修饰碳糊电极建立了微分脉冲伏安法，以甲基丙烯酸为功能单体，乙腈水溶液为致孔剂，通过溶胶⁃凝胶法制备分子印迹聚合物纳米珠，纳米珠结构在碳糊电极上良好的电催化作用，实现了肌氨酸定量分析的高亲和性和高选择性，但该方法同样没有呈现优异的检出限（0.38 μmol/L）。Özkütük 等［26］以甲基丙烯酰胺基组氨酸为功能单体，乙二醇二甲基丙烯酸酯为交联剂，通过乳液聚合合成分子印迹聚合物，该分子印迹聚合物电位传感器平台对肌氨酸显示出高选择性，且响应时间短（<2 min），线性范围宽（10⁃5～10⁃9mol/L）。也有研究者把磁性Fe3O4纳米粒子嵌入金属有机骨架化合物作为分子印迹化合物载体，利用金属有机骨架的多孔结构提高传质效率和吸附能力，印迹因子达4.30，使检测肌氨酸的检测限降至0.4 pmol/L，线性范围为1～100 pmol/L［27］。所以，电化学方法可通过改变模板分子的结构或基于复合材料创建多层分子印迹聚合物来设计聚合物的整体形态以此提高选择性和灵敏度。虽然分子印迹技术在电化学传感器中已经获得了良好应用，但仍然存在机理研究不够深入，制备技术有待优化等亟待解决的问题。

2.3 色谱法或色谱⁃质谱联用法

质谱法是氨基酸定量检测的最准确的方法之一。肌氨酸结构上带有氨基和羧基，是一种分子量较小的亲水物质，在电喷雾离子源中肌氨酸离子化效率较低，直接用质谱法信号较弱，通常需要与气相色谱、液相色谱和毛细管电泳联合使用［28］。目前肌氨酸检测的色谱法主要以高效液相色谱为主，而气相色谱使用较少（需要合适的衍生化试剂衍生）。尿液中存在内源性丙氨酸，其浓度是肌氨酸的数千倍，在常规色谱法或色谱⁃质谱联用法中不能有效分离肌氨酸及其分子异构体（α⁃L⁃丙氨酸，α⁃D⁃丙氨酸和β⁃丙氨酸）。近年来，通过合适的衍生化等手段逐步可排除丙氨酸的干扰。如Tang⁃Chia Chung 等人利用荧光试剂左氧氟沙星酰氯衍生化，以乙酸钠缓冲液和四氢呋喃作为流动相进行梯度洗脱，在己基⁃苯基柱上能较好的分离氨基酸衍生物与其分子异构体，线性范围为44.5～1780.0 ng/mL，检出限为8.9 ng/mL［18］。研究者利用丹磺酰氯进行柱前衍生，在液相色谱串联质谱仪上通过提高分辨率和离子化效率，使衍生后肌氨酸及丙氨酸保留时间延长以达到分离目的［29］。高效液相色谱⁃质谱或气相色谱⁃质谱法能对复杂基质中的肌氨酸进行准确定量，重复性好，且有极高的分辨率和分析效率，值得注意的是质谱法需要昂贵的仪器设备、标准品和固相萃取等样品前处理手段。所以在今后要实现临床意义上的色谱⁃质谱法常规检测肌氨酸，应该更着重样品前处理方法的简化以及临床操作的标准化。

2.4 荧光光谱法

肌氨酸本身不具有荧光，必须利用荧光染料等试剂与其相互作用生成络合物再进行测定。研究者利用镧系金属有机骨架出色的光学特性［30］，将Tb3+和Cu2+引入到金属有机骨架中设计了发光探针，通过肌氨酸与Cu2+之间的强相互作用来影响传感器的发光性质，检出限为0.23 μmol/L［16］。近两年也报道了基于核酸适体的荧光光谱法，肌氨酸核酸适体于2018年首次合成，对肌氨酸具有严格的识别行为和高度的亲和力（解离常数为134.8±1.12 nmol/L），用于肌氨酸检测，不受内源性丙氨酸干扰［31］。2019年Canan Özyurt 等［31］使用氧化石墨烯辅助的配体指数富集技术又筛选了两个特异性的DNA 核酸适体9S 和13S，显著降低了解离常数，相比2018年报道的核酸适体荧光法，其检出限降低了5 个数量级，低至0.5 pmol/L，是现有检测方法中检出限最低的方法，线性范围达到6 个数量级，核酸适体的应用避免了复杂繁琐的衍生和样品预处理步骤［32］。

3 小结与展望

本文综述了肌氨酸在前列腺癌早期筛查和等级评分中的应用价值及近十年来的检测方法。肌氨酸定量方法种类多，早期不同的检测方法的结果差异性大，而且全自动化检测方法较少，严重制约了肌氨酸在临床上的应用。比色法有成品的试剂盒，操作简便，对仪器设备要求不高，适合医院大规模检测，未来应该更多的开发纳米酶的潜在应用价值。色谱⁃质谱检测方法难以在基层单位开展，其需要昂贵的检测费用和特殊的专业技术操作人员，但准确性和重复性都非常好。电化学方法近年来通过使用分子印迹聚合物等极大降低了肌氨酸检测的检出限，并提高了选择性，电化学方法和荧光光谱法未来应该朝连续、自动化、快速和计算机方向发展，通过自动化仪器向医院推广。实验室可根据检测目的和自身实验室条件选择合适的检测方法，建立普通人群和前列腺相关疾病的肌氨酸数据库，提高肌氨酸生物标志物早期筛查的灵敏度和准确性。总之，如何选择和互补不同的检测方法，改善检测方法的性能参数，提高肌氨酸检测的临床应用价值是检验工作人员一致的追求方向。